JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

This protocol describes how neural progenitor cells can be differentiated from human induced pluripotent stem cells, in order to yield a robust and replicative neural cell population, which may be used to identify the developmental pathways contributing to disease pathogenesis in many neurological disorders.

Abstract

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long period of disease progression prior to the onset of symptoms. Because fibroblasts from patients and healthy controls can be efficiently reprogrammed into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), and subsequently differentiated into neural progenitor cells (NPCs) and neurons for the study of these diseases, it is now possible to recapitulate the developmental events that occurred prior to symptom onset in patients. We present a method by which to efficiently differentiate hiPSCs into NPCs, which in addition to being capable of further differentiation into functional neurons, can also be robustly passaged, freeze-thawed or transitioned to grow as neurospheres, enabling rapid genetic screening to identify the molecular factors that impact cellular phenotypes including replication, migration, oxidative stress and/or apoptosis. Patient derived hiPSC NPCs are a unique platform, ideally suited for the empirical testing of the cellular or molecular consequences of manipulating gene expression.

Introduction

دراسات التعبير الجيني للخلايا العصبية متباينة في المختبر من صنع الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs) من قبلنا 1 وغيرها 2،3 تشير إلى أن الخلايا العصبية hiPSC تشبه الجنين بدلا من الكبار أنسجة المخ. في الوقت الحاضر، قد تكون النماذج القائمة hiPSC-أكثر ملاءمة لدراسة الاستعداد ل، بدلا من الميزات في وقت متأخر من، والأمراض العصبية. لقد ذكرت سابقا أن جزءا كبيرا من التوقيع الجيني لفصام الخلايا العصبية المشتقة من hiPSC يتم حفظها في الفصام الخلايا الاصلية العصبية المشتقة من hiPSC (الشخصيات)، مشيرا إلى أن الشخصيات قد يكون نوع من الخلايا مفيدة لدراسة المسارات الجزيئية المساهمة في الفصام 1 . نحن وغيرنا وأفادت الهجرة الشاذة، وزيادة الإجهاد التأكسدي وأنواع الاكسجين التفاعلية، حساسية للضغوط البيئية عتبة الفرعية وظيفة الميتوكوندريا ضعف في الفصام hiPSC الشخصيات 1،4-6، وكذلك انخفضت العصبية جonnectivity وظيفة متشابك في الخلايا العصبية الفصام hiPSC 5،7-10. إذا كانت العوامل الجزيئية المساهمة في الهجرة الشاذة و / أو الاكسدة في الفصام hiPSC الشخصيات أيضا تكمن وراء اتصال الخلايا العصبية انخفاض في الفصام الخلايا العصبية المشتقة من hiPSC، يمكن أن تكون الشخصيات السكان العصبي القوي وتنسخي للغاية مع الذي لدراسة الآليات المسؤولة عن المرض. وعلاوة على ذلك، لأن واحدا يمكن أن تولد بسرعة أعداد كبيرة من الخلايا وليس من الضروري الانتظار أسابيع أو أشهر لنضوج الخلايا العصبية، المقايسات مقرها NPC-هي مناسبة لدراسة الأفواج الكبيرة المرضى واكثر سهولة في ارتفاع الفرز الإنتاجية. ونحن نعتقد أن hiPSC الشخصيات يمكن أن تكون بمثابة وكيل لمسارات التنمية المحتمل أن تساهم في التسبب بالمرض، كما سبق أن تظاهروا في اضطرابات متنوعة مثل انفصام الشخصية (1) وهنتنغتون المرض 11.

للتمييز الشخصيات من hiPSCs، العصبية الأولية فيويتم إنجاز الدرفلة الجديد من قبل المزدوج لل Smad تثبيط (0.1MM LDN193189 و 10mm SB431542) 12. عن طريق استعداء BMP و TGF يشير مع هذه الجزيئات الصغيرة، ويتم حظر الأديم الباطن ومواصفات الأديم المتوسط، وتسريع تمايز الخلايا العصبية ويؤدي إلى تشكيل ريدات العصبية واضحة خلال أسبوع واحد من الطلاء. يحدث الزخرفة العصبية في هذه العملية في وقت مبكر، ويفترض خلال فترة تشكيل ريدة العصبي وبعد ذلك مباشرة. في غياب العظة أخرى، تفترض هذه الخلايا العصبية البدائية لمثل الدماغ الأمامي مصير الأمامي 13. مباشرة بعد تشكيل ريدة العصبي، ومستمرة طوال التوسع مجلس الشعب، الشخصيات الدماغ المقدم تستزرع مع FGF2 8،14. لديهم إمكانات النسب المزدوجة، ويمكن أن تكون متباينة للسكان العصبي من 70-80٪ الخلايا العصبية III-تويولين إيجابية و20-30٪ ييفي الدبقية البروتين الحمضية (GFAP) النجمية -positive (الشكل 1). الغالبية العظمى من الخلايا العصبية الدماغ الأمامي hiPSC هي-VGLUT1 إيجابية، وهكذا هي يفترض glutamatergic، على الرغم من أن ما يقرب من 30٪ من الخلايا العصبية هي-GAD67 الموجب (GABAergic) 8.

الشخصيات و passaged بشكل روتيني أكثر من عشر مرات في المختبر، مع الحفاظ على ملامح التمايز متسقة، وبدون تراكم التشوهات النمط النووي. وذكرت جماعات الشخصيات الركض أكثر من 40 مرة 15، ومع ذلك، نجد أن وراء عشر الممرات والشخصيات تظهر زيادة الميل للنجمية التمايز. الشخصيات جيدا يتسامح متعددة تجميد يذوب ويمكن تحويلها لزراعة كما neurospheres ببساطة عن طريق زراعة في لوحات غير ملتصقة. وtransduced الشخصيات بكفاءة عن طريق النواقل الفيروسية، التي تمكن من تقييم سريع للعواقب الجزيئية والخلوية من اضطراب وراثي، وقابلة للتوسيع بسهولة لانتاج مادة كافية للدراسات كيميائية حيوية. وعلاوة على ذلك، لأن ناقلات فيروسية قوية تسمح الإفراط في التعبير و / أو ضربة قاضية للجينات الأمراض ذات الصلة، في أي سيطرة أو المريض المستمدة neurخلايا القاعدة ويمكن للمرء أن استخدام هذه المنصة لاختبار تأثير الخلفية الوراثية على هذه التلاعبات. وإن لم تكن مناسبة لمتشابك أو فحوصات على أساس النشاط التي تتطلب الخلايا العصبية الناضجة، قد الشخصيات يكون بديلا عمليا لكثير من التحليلات الجزيئية أو البيوكيميائية واضحة من الخلايا المشتقة من المريض العصبية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. hiPSC التمايز إلى خلايا العصبية السلف

  1. النمو والتوسع hiPSCs في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HES) وسائل الاعلام (الجدول 1) شارك في تربيتها على الماوس الخلايا الليفية الجنينية (MEF) طبقة المغذية حتى كبيرة (ولكن subconfluent) مستعمرات جاهزة للالتمايز العصبي عن طريق هيئة مضغي الشكل (EB) وسيطة (الشكل 2). ووصف الظروف الروتينية ثقافة hiPSC جيدا في أماكن أخرى 16،17. لفترة وجيزة، وتنمو hiPSCs في وسائل الإعلام HES على طبقة المغذية MEF حتى متموجة، والمرور ثم إنزيمي مع كولاجيناز (1mg / مل في DMEM) وتوسيع ما يقرب من 1: 3 كل 7 أيام.
  2. لإعداد بولي-L-الأورنيثين / laminin لوحات مغلفة، لوحات معطف مع 10 غرام / مل بولي-L-الأورنيثين في الماء المعقم للأسطح البلاستيك (50 غ / مل للأسطح الزجاج)، واحتضان في RT ل3-24 ساعة. يغسل مرة واحدة على الأقل مع الماء المعقم ثم معطف مع 5G / مل Laminin في برنامج تلفزيوني العقيمة في RT ل3-24 ساعة.
    ملاحظة: إذا ملفوفة في البلاستيك، لوحات يمكن أن يكونتخزينها لمدة تصل إلى ستة أشهر عند -20 درجة مئوية.
  3. في يوم 1، ورفع إنزيمي hiPSCs subconfluent (نمت بشكل عام على MEFS، أو hiPSCs نمت في وسائل الاعلام محددة مثل TeSR 18 على Matrigel) من لوحة مستعمرات كبيرة مثل استخدام 1mg / مل كولاجيناز الرابع في DMEM / F12.
    ملاحظة: بعد 1-2 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية، المستعمرات سيتم يتحرك في الطبق.
  4. غسل بلطف المستعمرات hiPSC (عن طريق تسوية، وليس الطرد المركزي) 1-2x مع DMEM / F12، resuspend في 2ML / بئر N2 / وسائل الإعلام B27 (الجدول 1) ونقل إلى أطباق غير ملتصقة 6 جيدا (الجمع بين 3 آبار في 1 حسنا) (19).
    ملاحظة: بين عشية وضحاها، والمستعمرات تشكل العائمة تجمعات كروية وصفته "الهيئات مضغي الشكل" (EBS). نتوقع الموت الخلوي كبير.
  5. في يوم 2، لوحات الميل والسماح لتسوية EBS. إزالة بعناية وسائل الإعلام، ويغسل مرة واحدة مع DMEM / F12 لإزالة الحطام. تغذية مع N2 / B27 وسائل الإعلام تستكمل مع مثبطات لل Smad المزدوجة (0.1M LDN193189 و10M SB431542) 12 .
  6. على أيام 3-7، سيحدث neuralization في سياق ثنائي تثبيط لل Smad. تأكد من أن EBS هي مستديرة ولكن ليس الكيسي. تغذية EBS كل يوم الثاني مع وسائل الإعلام N2 / B27 تستكمل مع 0.1M LDN193189 و10M SB431542.
  7. في أيام 7-14، بعد الطلاء من EBS لبولي-L-الأورنيثين / Laminin لوحات المغلفة، تحقق باستخدام المجهر brightfield أن ريدات العصبية تبدأ في الظهور في غضون بضعة أيام (وصفها بأنها مجموعات من خلايا عصبية ظهارية مستديرة مع apico القاعدية قطبية. الشكل 1). تواصل تغذية EBS ملتصقة كل يوم الثاني مع N2 / B27 وسائل الإعلام تستكمل مع 0.1M LDN193189، 10M SB431542 و 1 غرام / مل laminin.

2. حصاد العصبية ريدات

ملاحظة: نوصي بأن ريدات العصبية أن تحصد إنزيمي باستخدام العصبية روزيت اختيار الكاشف 20 أو كاشف اختيار مماثل. على الرغم ريدات العصبية يمكن التقاطها يدويا في 6 جيدا بولي-L-الأورنيثين / Laminin لوحة المغلفة، ثيالصورة منهجية تأخذ تدريبا مكثفا لسيده، وتعتمد على مهارة المستخدم، قد تحتاج إلى الجولة الثانية من قطف في يوم 20 إلى إثراء للالشخصيات وتستنزف أنواع الخلايا غير العصبية.

  1. لاختيار الأنزيمية من ريدات العصبية في اليوم 14، وسائل الإعلام نضح من EBS الالتزام وإضافة 1 مل من كاشف العصبي اختيار ردة لكل بئر لوحة 6 جيدا. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  2. مع pipetman P1000، وإزالة بلطف الانزيم من كل بئر. إضافة 1 مل من DMEM / F12 لكل بئر لغسل.
  3. مع P1000، وجمع 1 مل من DMEM / F12 وسرعان ما طرد DMEM / F12 مرة أخرى إلى البئر، وبالتالي فصل وريدات من لوحة. جمع ريدات في أنبوب الصقر.
  4. الماصة 1 مل أخرى من DMEM / F12 وسرعان ما طرد في نفس البئر لفصل ريدات المتبقية. (لا يسحن. حاول أن لا تفريق المجاميع ردة). جمع ريدات العصبية في نفس أنبوب الصقر.
  5. كرر الخطوة 2.4 الضرورة. إذا ريدات لا فصل بسهولة، إضافة موإعادة انزيم وتكرار هذه العملية (الخطوات 2،1-2،4)
  6. تدور الخلايا في 300 x ج لمدة 3 دقائق. نضح غسل، وإعادة تعليق ريدات في 2 مل من مجلس الشعب وسائل الإعلام (الجدول 1). نقل الخلايا (1: 1) في بولي-L-الأورنيثين / Laminin المغلفة 6 لوحة جيدا.
  7. من يوم 15-21، فإن ريدات العصبية التوسع؛ ريدات تغذية كل يوم الثاني مع وسائل الإعلام مجلس الشعب.
  8. تقييم جودة ريدات العصبية والتأكد من أن خلايا تشبه الخلايا الليفية مسطحة لا تتوسع داخل الثقافة.
    ملاحظة: إذا استمرت غير ريدات، ثقافة NPC يمكن في بعض الأحيان إنقاذه من قبل قطف اليدوي، واختيار أفضل فقط من ريدات التقطت في Accutase. فصل 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بيليه، وغسل وصفيحة في وسائل الإعلام مجلس الشعب على 24 جيدا بولي-L-الأورنيثين / Laminin لوحة المغلفة.

3. التوسع في الخلايا العصبية السلف

ملاحظة: hiPSC الشخصيات يمكن زراعتها على أي Matrigel- أو بولي-L-الأورنيثين / Laminin لوحات المغلفة. نحن عادة استخدام Matrigeل-لوحات لأنها يمكن أن تكون مستعدة بشكل أسرع وبتكلفة أقل.

  1. لإعداد لوحات Matrigel المغلفة، وبسرعة ذوبان الجليد و resuspend قسامة المجمدة 1mg من Matrigel في 24 مل الباردة DMEM / F12 وتوزيعها على الفور 2 مل إلى كل بئر من اثنين من لوحات ستة جيدا. احتضان لمدة 1 ساعة على الأقل في 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: Matrigel يحتاج فقط إلى أن يستنشق، وليس غسلها، مباشرة قبل الاستعمال.
  2. تغذية الشخصيات كل يوم الثاني على التوالي والحفاظ على كثافة عالية جدا أو أنها سوف تفرق تلقائيا إلى الخلايا العصبية.
    ملاحظة: على الرغم من الشخصيات الأكثر رسوخا عادة تقسيم 1: 4 كل أسبوع، الشخصيات مرور منخفضة جدا يمكن تقسيم 1: 2 ونادرا ما مرة واحدة كل أسبوعين.
  3. لتقسيم والإعلام نضح الأولى وإضافة 1 مل دافئ Accutase (1X) لكل بئر من لوحة 6 جيدا. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة.
  4. بلطف نقل خلايا منفصلة في أنبوب 15 مل تحتوي على DMEM / F12 مع إجهاد أقل قدر ممكن. لا يعاير خلايا بينما في الانزيم. خلايا بيليه بواسطة spinniنانوغرام في 1،000 x ج لمدة 5 دقائق.
  5. نضح غسل، واعادة تعليق الشخصيات في ~ 1 مل سائل الإعلام NPC لكل بئر الأصلي من 6 جيدا.
    ملاحظة: نتوقع أن بئر متموجة من صحن 6 جيدا ديه مليون 5-10 خلايا. هذا ويمكن التأكد عن طريق عد قسامة 10L من الخلايا باستخدام عدادة الكريات مسبق لإعادة الطلاء.
  6. وبعد اعادة تعليق، الشخصيات إعادة لوحة كما الشخصيات، الخلايا العصبية أو neurospheres. للحفاظ على الشخصيات، لوحة حوالي 1-2000000 خلايا لكل بئر من لوحة 6 جيدا. كفاءة تشكيل neurosphere يمكن أن تختلف بين التجارب وخطوط الخلايا، ولكن يحدث عادة أفضل إذا هي المصنفة بين 200،000 و 1،000،000 خلايا لكل بئر من غير ملتصقة وحة 6 جيدا. إذا حدث التثاقل من neurospheres، والحد من عدد الخلايا المصنف. التفريق إلى الخلايا العصبية، لوحة حوالي 200،000 الخلايا لكل بئر من لوحة 6 جيدا، لتحل محل وسائل الإعلام مجلس الشعب مع وسائل الاعلام الخلية العصبية.
  7. Immunohistochemically التحقق من صحة كل سطر مجلس الشعب المقررة. مرة واحدة وكانت المواد الخلوية كافية EXPANدائرة التنمية الاقتصادية، الشخصيات التسمية مع الأجسام المضادة للNESTIN وSOX2. كما ينبغي التفريق بين خطوط المصادق عليها مجلس الشعب في الخلايا العصبية لمدة 4-6 أسابيع، وصفت مع الأجسام المضادة للIII-تويولين وMAP2AB.
    1. إصلاح الخلايا في بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني في 4C لمدة 10 دقيقة. Permeabilize الشخصيات في RT لمدة 15 دقيقة في 1.0٪ تريتون في برنامج تلفزيوني، ومن ثم منع في 5٪ المصل حمار مع 0.1٪ تريتون في RT لمدة 30 دقيقة.
    2. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية في 5٪ المصل حمار مع 0.1٪ تريتون، بين عشية وضحاها في 4C.
      ملاحظة: نوصي الأجسام المضادة التالية: الماعز المضادة للSox2، 1: 200. Nestin الماوس مكافحة الإنسان، 1: 200. أرنب مكافحة βIII تويولين، 1: 500. الماوس مكافحة βIII تويولين، 1: 500. الماوس المضادة للMAP2AB، 1: 200. (الشكل 2).
    3. بعد غسل مع PBS، واحتضان خلايا الأجسام المضادة الثانوية مع الأجسام المضادة الثانوية مترافق المناسبة لالماعز، والماوس أو أرنب في 1: 300، في في 5٪ مصل حمار مع 0.1٪ تريتون لمدة 1-2 ساعة على RT. لتصور النوى، وخلايا وصمة عار مع 0.5 ميكروغرام / مل دابي (4 '6-diamidino-2-phenylindole) ثم جبل مع Vectashield.

4. مجلس الشعب تنبيغ

  1. استخدام spinfection (الطرد المركزي لوحات زراعة الخلايا في وجود الفيروس في 1،000 x ج لمدة 1 ساعة) لزيادة نسبة الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل 21. وسائل الإعلام نضح واستبدال overexpression ذات الصلة (أو السيطرة) lentiviruses (أو الفيروسات القهقرية)، titered لتعدد المطلوب من العدوى (وزارة الداخلية) (عادة 1-10)، مخففة في وسائل الإعلام مجلس الشعب. استخدام 1.5 مل حجم لكل بئر من لوحة 6 جيدا (أو حجم تحجيمها بشكل مناسب لأنواع أخرى من لوحات زراعة الأنسجة). تدور في 1،000 x ج و 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في لوحة أجهزة الطرد المركزي.
    ملاحظة: من الناحية المثالية، تنبيغ الشخصيات مع lentiviral أو ناقلات فيروسات في غضون 1-2 أيام من تقسيم. سواء باستخدام الفيروسات التجارية أو إعداد المختبر، ويمكن ان يكون من المفيد عيار بشكل مناسب دفعات من الفيروس في وقت مبكر عن طريق التخفيف المتسلسل. (الشكل 3).
  2. للحد من سلالموت lular، استبدال وسائل الإعلام في غضون 8 ساعة من spinfection.
    ملاحظة: التكامل الفيروسية والتحوير التعبير يجب أن تكون قابلة للكشف خلال 24 ساعة من قبل مضان مراسل الجين. (إذا كان الفيروس يفتقر مراسل الفلورسنت، وهذا هو أكثر صعوبة لتقييم، ويمكن أفضل ترنسفكأيشن ناجحة يتم التصديق عليها من قبل طخة مناعية، المناعية أو QPCR للمنتجات overexpression.) التعبير كامل قد يستغرق 3-7 أيام؛ قد تكون هناك حاجة spinfections المتكررة بفيروس إضافي لزيادة نسبة الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. يمكن أن يحدث spinfections المتكررة يوميا ولكن لا يلزم أن يكون تكرارا لذلك. من الناحية المثالية، إذا كان استخدام مراسل الفلورسنت،> يجب أن يكون المسمى 80٪ من الخلايا.

5. Neurosphere الهجرة الفحص

ملاحظة: Neurospheres شكل عفوي، في أعقاب تفكك الأنزيمية من الشخصيات (بواسطة بطريقة مماثلة لتلك المستخدمة في التوسع مجلس الشعب - خطوات 3،3-3،6)، إذا الخلايا المستزرعة في تعليق في وسائل الإعلام مجلس الشعب.

  1. لفترة وجيزة، وتنمو فصلد الشخصيات في وسائل الإعلام مجلس الشعب لمدة 48 ساعة في لوحات غير ملتصق من أجل توليد neurospheres. (الشكل 4).
  2. للهجرة neurosphere، وإعداد لوحات Matrigel جديدة باستخدام وسائل الإعلام NPC الباردة، بدلا من DMEM، في لوحة 96-جيدا، 1-2 ساعة قبل neurosphere قطف. لا نضح Matrigel من الآبار.
  3. كما نشرت أصلا لالجذعية الجنينية المستمدة من الخلايا neurospheres 22، واختيار يدويا neurospheres مجلس الشعب المستمدة من تحت المجهر، بعد غسل مرة واحدة في وسائل الإعلام للمجلس الوطنى لإزالة الحطام الخلوي. نقل neurosphere واحدة على كل جانب من Matrigel المغلفة لوحة 96-جيدا.
  4. إضافة 0.5 ملغ إضافي Matrigel، مخففة في وسائل الإعلام NPC البرد، إلى neurospheres في كل لوحة 96-جيدا.
  5. تركز يدويا في كل neurosphere الفردي في منتصف البئر باستخدام طرف الماصة.
    ملاحظة: من المهم أن يلتقط neurospheres مشابهة من حيث الحجم، من أجل الحد من التباين في النتائج.
  6. السماح الهجرة تحدث لمدة 48 ساعة ومن ثم إصلاح خلايا ثإيث 4٪ امتصاص العرق وصمة عار مع علامات المناعى المرجوة.
  7. إذا الهجرة الشعاعية هي أن تحدد، neurospheres صورة في حياتهم تماما باستخدام الهدف 4X المجهر. استبعاد أي neurospheres الاتصال حافة البئر أو neurosphere الثاني من التحليل.
    ملاحظة: في حالة حدوث الهجرة لمدة أطول من 48 ساعة، سوف ينتج عنها من الهجرة شعاعي من المرجح أن تكون كبيرة جدا لصورة باستخدام الهدف 4x و.
  8. قياس متوسط ​​الهجرة من كل neurosphere باستخدام NIH يماغيج البرمجيات (الشكل 5). ويمكن القيام بذلك باستخدام أي من أساليب التحليل هو موضح أدناه:
    1. الهجرة شعاعي:
      1. تتبع حافة الخلايا أبعد المهاجرة باستخدام أداة التحديد مرفوعة ثم استخدام مقياس (السيطرة + M) وظيفة لحساب مساحة الشكل الناتج يدويا. قبل قياس مساحة تأكد من أن المساحة محددا في مجموعة القياسات نافذة وجدت تحت علامة التبويب تحليل. استخدامقيمة قياس المنطقة والمعادلة لمساحة الدائرة (A = πr 2) لتحديد دائرة نصف قطرها (الخارجي).
      2. تتبع حافة neurosphere الأصلي، وقياس وحساب مساحة دائرة نصف قطرها (الداخلي) بنفس الطريقة. حساب مجموع الهجرة شعاعي بالفرق بين أنصاف أقطار الخارجي والداخلي.
    2. أعظم الهجرة الخلوية:
      1. قياس المسافة انتقلت من أبعد خلايا خمسة من حافة neurosphere الداخلي باستخدام أداة التحديد القسط الثابت تليها قياس (السيطرة + M) وظيفة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

ويمكن تحديد ريدات العصبية شكليا، وذلك باستخدام المجهر brightfield، من خلال مظهرها المميز في شكل مجموعات جولة من خلايا عصبية ظهارية مع apico القاعدية قطبية (الشكل 1). على الرغم من الشخصيات تستزرع عادة في كثافة الخلايا عالية جدا، وذلك مباشرة بعد الركض، قليلا سوما هرمي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وصفناها الطرق التي يمكن من خلالها تمييز hiPSCs في اللجان التحضيرية الوطنية، وهو نوع من الخلايا العصبية التي يتم حفظها جزءا كبيرا من التوقيع الجيني للخلايا العصبية hiPSC المشتقة والتي قد تكون بمثابة وكيل لمسارات التنمية المحتمل أن تساهم في التسبب بأمراض 8، 11. بالإضا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Kristen Brennand is a New York Stem Cell Foundation - Robertson Investigator. The Brennand Laboratory is supported by a Brain and Behavior Young Investigator Grant, National Institute of Health (NIH) grant R01 MH101454 and the New York Stem Cell Foundation.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM/F12Life Technologies#11330for HES media
DMEM/F12Life Technologies#10565for neural media
KO-Serum ReplacementLife Technologies#10828Needs to be lot tested
GlutamaxLife Technologies#35050
NEAALife Technologies #11140
N2Life Technologies #17502-048Needs to be lot tested
B27-RALife Technologies #12587-010Needs to be lot tested
FGF2Life Technologies#13256-029Resuspend in PBS + 1% BSA
LDN193189Stemgent#04-0074
SB431542Stemgent#04-0010
BDNFPeprotech#450-02Resuspend in PBS + 0.1% BSA
GDNF Peprotech #450-10Resuspend in PBS + 0.1% BSA
Dibutyryl cyclic-AMPSigma #D0627Resuspend in PBS + 0.1% BSA
L-ascorbic acidSigma#A0278Resuspend in H20
STEMdiff Neural Rosette Selection ReagentStemcell Technologies #05832
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT-104
Collagenase IVLife Technologies#17104019
CF1 mEFsMillipore#PMEF-CF
Poly-L-OrnithineSigmaP3655
Laminin, Natural Mouse 1 mgLife Technologies#23017-015
BD MatrigelBD#354230Resuspend on ice in cold DMEM at 10 mg/ml, use 1 mg per two 6-well plate equivalent
Tissue culture treated 6-well platesCorning3506
Ultra low attachment 6-well platesCorning3471
goat anti-Sox2 Santa Cruzsc­17320use at 1:200
mouse anti-human NestinMilliporeMAB5326use at 1:200
rabbit anti-βIII-tubulinCovancePRB­435Puse at 1:500
mouse anti-βIII-tubulinCovanceMMS­435Puse at 1:500
mouse anti-MAP2ABSigmaM1406use at 1:200
Plate centrifugeBeckman CoulterBeckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier)

References

  1. Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. , (2014).
  2. Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12, 573-586 (2013).
  3. Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 12770-12775 (2012).
  4. Hashimoto-Torii, K., et al. Roles of heat shock factor 1 in neuronal response to fetal environmental risks and its relevance to brain disorders. Neuron. 82, 560-572 (2014).
  5. Robicsek, O., et al. Abnormal neuronal differentiation and mitochondrial dysfunction in hair follicle-derived induced pluripotent stem cells of schizophrenia patients. Mol Psychiatry. 18 (10), 1067-1076 (2013).
  6. Paulsen, B. D., et al. Altered oxygen metabolism associated to neurogenesis of induced pluripotent stem cells derived from a schizophrenic patient. Cell Transplant. 21 (7), 1547-1559 (2012).
  7. Yu, D. X., et al. Modeling hippocampal neurogenesis using human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2, 295-310 (2014).
  8. Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).
  9. Wen, Z., et al. Synaptic dysregulation in a human iPS cell model of mental disorders. Nature. , (2014).
  10. Zhang, L., Song, X., Mohri, Y., Qiao, L. Role pf Inflammation and Tumor Microenvironment in the Development of Gastrointestinal Cancers: What Induced Pluripotent Stem Cells Can Do. Current stem cell research & therapy. , (2014).
  11. An, M. C., et al. Genetic Correction of Huntington's Disease Phenotypes in Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 11 (2), 253-263 (2012).
  12. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  13. Pankratz, M. T., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
  14. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143, 527-539 (2010).
  15. Sareen, D., et al. Chromosome 7 and 19 trisomy in cultured human neural progenitor cells. PLoS One. 4, e7630(2009).
  16. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  17. Cowan, C. A., et al. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med. 350, 1353-1356 (2004).
  18. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
  19. Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460, 1127-1131 (2009).
  20. Xia, G., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells to model spinocerebellar ataxia type 2 in vitro. Journal of molecular neuroscience : MN. 51, 237-248 (2013).
  21. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
  22. Delaloy, C., et al. MicroRNA-9 coordinates proliferation and migration of human embryonic stem cell-derived neural progenitors. Cell Stem Cell. 6, 323-335 (2010).
  23. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
  24. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
  25. Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nat Neurosci. 15, 477-486 (2012).
  26. Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

96 lentiviral neurosphere

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved