Nörolojik Hastalıklar Çalışmaları Yaratma ve Kullanma hiPSC Türetilmiş NPC A Guide

Özet

This protocol describes how neural progenitor cells can be differentiated from human induced pluripotent stem cells, in order to yield a robust and replicative neural cell population, which may be used to identify the developmental pathways contributing to disease pathogenesis in many neurological disorders.

Özet

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long period of disease progression prior to the onset of symptoms. Because fibroblasts from patients and healthy controls can be efficiently reprogrammed into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), and subsequently differentiated into neural progenitor cells (NPCs) and neurons for the study of these diseases, it is now possible to recapitulate the developmental events that occurred prior to symptom onset in patients. We present a method by which to efficiently differentiate hiPSCs into NPCs, which in addition to being capable of further differentiation into functional neurons, can also be robustly passaged, freeze-thawed or transitioned to grow as neurospheres, enabling rapid genetic screening to identify the molecular factors that impact cellular phenotypes including replication, migration, oxidative stress and/or apoptosis. Patient derived hiPSC NPCs are a unique platform, ideally suited for the empirical testing of the cellular or molecular consequences of manipulating gene expression.

Giriş

Bizim ¹ insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs) in vitro farklılaşmış nöronların ve diğerleri ^2,3 Gen ifadesi çalışmaları hiPSC nöronlar fetal ziyade yetişkin beyin dokusu benzer olduğunu göstermektedir. Şu anda, hiPSC-tabanlı modeller yerine geç özellikleri, nörolojik hastalığı dışında, yatkınlık çalışmaları için daha uygun olabilir. Daha önce NPC şizofreni ¹ katkıda moleküler yolları araştırılmasında faydalı bir hücre tipi olabileceğini göstermektedir, şizofreni hiPSC türetilen nöron gen imza önemli bir kısmının şizofreni hiPSC türetilmiş sinir progenitör hücrelerinin (NPC) muhafaza edilir bildirmişlerdir . Biz ve diğerleri anormal göç, artmış oksidatif stres ve reaktif oksijen türleri, alt eşik çevresel streslere ve şizofrenide bozulmuş mitokondriyal fonksiyonu hiPSC NPC ^1,4-6 hassasiyeti yanı sıra azalmış nöronal c bildirmiştironnectivity ve şizofreni hiPSC nöronlar ^5,7-10 sinaptik fonksiyon. Şizofreni hiPSC NPC anormal göç ve / veya oksidatif strese katkıda moleküler faktörler de şizofreni hiPSC kaynaklı nöronlar azalmış nöronal bağlantı temelini ise, NPC hastalıktan sorumlu mekanizmaları incelemek için sağlam ve yüksek replikatif nöral nüfus olabilir. Bir hızla hücrelerin çok sayıda oluşturabilir ve nöronal olgunlaşması için hafta veya ay beklemek gerekmez, çünkü Ayrıca, NPC-tabanlı deneyler daha büyük hasta gruplarını çalışma için uygundur ve yüksek verimli tarama daha yatkındır. Biz zaten şizofreni ¹ ve Huntington hastalığı ¹¹ gibi farklı hastalıkların ortaya konmuştur olarak hiPSC NPC, potansiyel hastalık patogenezinde katkıda gelişimsel yollar için bir vekil olarak hizmet verebilir inanıyoruz.

HiPSCs, ilk nöral gelen NPC ayırt etmektim çift SMAD inhibisyon (0.1 mM LDN193189 ve 10 mM SB431542) ¹² tarafından gerçekleştirilir. Bu küçük moleküller ile sinyalizasyon BMP ve TGF antagonize ederek, endoderm ve mezoderm özellikleri nöronal farklılaşma hızlandırılması ve kaplama bir hafta içinde görünür nöral rozet oluşumuna yol açan, bloke edilir. Sinir desenlendirme muhtemelen hemen sonra nöral rozet oluşumu ve döneminde, erken bu süreçte oluşur. Diğer ipuçları yokluğunda, bu ilkel nöral hücreler anterior ön beyin-benzeri kaderi ¹³ varsayıyorum. Hemen nöral rozet oluşumu takip ve NPC genişleme boyunca devam eden, ön beyin NPC FGF2'nin ^8,14 ile kültür. Onlar çift soy potansiyeline sahip ve% 70-80 III-tubulin-pozitif nöronlar ve% 20-30 glial fibriler asidik protein (GFAP) pozitif astrositler (Şekil 1) nöral nüfusa ayırt edilebilir. ön-beyin hiPSC nöronlarının çoğunluğu VGLUT1-pozitifNöronların yaklaşık% 30 GAD67 pozitif (GABA) rağmen ve böylece, muhtemelen glutamaterjik ^8.

NPC rutin tutarlı farklılaşma profilleri muhafaza ve karyotip anomalileri biriken olmadan iken, in vitro fazla on kez geçişli. Gruplar Pasajlanması NPC'lerin ^15, ancak, biz on pasajlar ötesinde, NPC astrosit farklılaşma eğilimini göstermektedir artmış olduğunu bulmak 40'tan fazla kez bildirilmiştir. NPC birden donma-çözülür iyi tolere ve sadece yapışmayan plakalarda kültürleme yoluyla neurospheres olarak büyümeye geçiş yapılabilir. NPC etkili bir biyokimyasal çalışmalar için yeterli malzeme elde etmek için hızlı bir genetik müdahalelerin moleküler ve hücresel sonucu değerlendirmeyi ve kolayca genişletilebilir sağlayan, viral vektörler tarafından iletilir. Ayrıca, çünkü viral vektörler izin sağlam aşırı ekspresyonu kontrolü veya hasta türetilmiş neur birinde ve / veya hastalık-ilgili genlerin demonte,El hücreleri, kimse bu manipülasyonlar genetik kökenli etkisini test etmek için bu platformu kullanabilirsiniz. Sinaptik veya olgun nöronlar gerektiren faaliyet tabanlı deneyleri için uygun olmasa da, NPC hasta kaynaklı sinir hücrelerinin çoğu basit moleküler veya biyokimyasal analizler için pratik bir alternatif olabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. hiPSC Farklılaşma Sinir Progenitör Hücreler için

1. Büyümek ve insan embriyonik kök hücre hiPSCs genişletin (HES) medya (Tablo 1) eş-kültüre bir fare embriyonik fibroblast (MEF), büyük (ama SUBCONFLUENT) koloniler bir embriyoid vücudun (EB) ara aracılığıyla nöral farklılaşma için hazır olana kadar besleyici tabaka üzerinde (Şekil 2). Rutin hiPSC kültür koşulları iyi yerde ^16,17 tarif edilmiştir; 3 Her 7 gün: kısaca, birbirine karışana kadar bir MEF besleyici tabaka üzerinde HES medyada hiPSCs büyümek, daha sonra enzimatik kollajenaz (DMEM 1mg / ml) ile geçit ve yaklaşık 1 genişletin.
2. Poli-L-Ornitin (cam yüzeyler için 50 ug / ml), plastik yüzeyler için steril su içinde ml / g, 10 ile Poli-L-Ornitin / laminin kaplanmış plakalar, kaplama plakaları hazırlamak ve 3-24 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe etmek. 3-24 saat boyunca oda sıcaklığında steril PBS içerisinde 5 g / mi Laminin steril su ve daha sonra kaplama ile en az bir kez yıkayın.
   NOT: plastik sarılı ise, plakalar olabiliraltı aya kadar -20 ° C 'de saklanır.
3. 1. Günde enzimatik DMEM / F12 içinde 1 mg / ml kollajenaz IV kullanılarak plaka gibi büyük koloniler (örneğin, Matrigel TeSR ¹⁸ olarak tanımlanmış ortamlarda yetiştirilen, genellikle MEF'ler yetiştiler ya da ancak hiPSCs) kaynaşma hiPSCs kaldırın.
   NOT: 37 ºC inkübasyon 1-2 saat sonra koloniler çanak yüzen olacak.
4. Yavaşça DMEM / F12, 2 ml / yuva N2 / B27 ortamı (Tablo 1) ve yapışkan olmayan 6 oyuklu tabaklara transfer tekrar süspansiyon ile 1-2X (değil santrifüj, çökeltilerek) hiPSC koloniler yıkama (1 içine 3-kuyu kombine eh) ^19.
   NOT: Gecelik, koloniler yüzen küresel kümeler oluşturacak "embriyoid organları" (EBS) olarak adlandırılan. Önemli hücresel ölüm bekliyoruz.
5. Ve Gün 2, eğim plakaları üzerinde EBS yerleşmek için izin verir. Dikkatle ortamı çıkarın ve enkaz kaldırmak için DMEM / F12 ile bir kez yıkayın. N2 ile besleyin / çift SMAD inhibitörleri (0.1M LDN193189 ve 10M SB431542) ¹² ile desteklenmiş B27 medya sup.
6. Gün 3-7, neuralization çift SMAD inhibe bağlamında oluşacak; EBS yuvarlak ama kistik olmadığını kontrol edin. EBS 0.1M LDN193189 ve 10M SB431542 ile desteklenmiş N2 / B27 medya ile her ikinci gün besleyin.
7. Nöral rozet (apico-bazal kutupları nöroepitelyal hücrelerin yuvarlak kümeleri olarak karakterize bir kaç gün içinde görünmeye başlar ki Günleri 7-14, kaplanmış plakalar Poli-L-Ornithine / Laminin için EBS kaplama izleyen, bir aydınlık mikroskop kullanılarak kontrol edin; Şekil 1). Yapışkan EBS 0.1 M LDN193189, 10M SB431542 ve 1 ug / ml, laminin ile takviye N2 / B27 ortamı ile her iki günde bir beslemeye devam edin.

Sinir rozet 2. Hasat

NOT: Biz nöral rozet enzimatik Sinir Rozet Seçim Reaktif ²⁰ veya benzeri seçim reaktif kullanılarak hasat öneririz. Nöral rozet elle 6-kuyu Poli-L-Ornithine / laminin kaplı levha, thi içine alınabilir rağmenmetodolojisi ayrıca NPC zenginleştirmek ve nöral olmayan hücre tiplerini tüketmek için günde 20 toplama bir ikinci tur gerektirebilir, kullanıcı beceri bağımlı, usta kapsamlı eğitim alır, ve.

1. 14. günde nöral rozet enzimatik seçimi için, uyulması EBS aspire maddeleri ve 6-delikli plaka için oyuk başına sinir rozet seçimi reaktif 1 ml. 1 saat süre ile 37 ° C'de inkübe edin.
2. P1000 Pipetman ile, yavaşça her kuyudan enzimi çıkarın. Yıkamak için oyuk başına DMEM / F12 içinde 1 ml ilave edilir.
3. Bir P1000 ile DMEM / F12 1 ml toplamak ve hızlı bir şekilde, böylece plaka rozet ayrılmakta, iyi geri DMEM / F12 sınırdışı. Bir şahin tüp içine rozetler toplayın.
4. Pipet başka 1 DMEM / F12 ml ve hızlı kalan rozet ayırmak için aynı kuyunun içine sınırdışı. (Çiğnemek etmeyin. Rozet agrega kırmak için çalışın). Aynı şahin tüp içine sinir rozetler toplayın.
5. Adımı tekrarlayın gerekli 2.4. Rozetler kolayca ayırmak istemiyorsanız, mo ekleyinenzimi yeniden ve işlemi tekrarlayın (2,1-2,4 adımları)
6. 3 dakika boyunca 300 xg'de hücreleri Spin. Aspire yıkama ve NPC medya (Tablo 1) 2 ml rozet yeniden askıya. Aktarım hücreleri (1: 1) ile Poli-L-Ornitin / laminin içine 6 plaka kaplama.
7. Gün 15-21 itibaren, nöral rozet genişletmek; yem rozet NPC medya ile her ikinci gün.
8. Nöral rozet kalitesini değerlendirmek ve düz fibroblast benzeri hücreler kültür içinde genişleyen değil emin olun.
   NOT: sigara rozet devam ederse, NPC kültürü bazen Accutase içine aldı rozet sadece en iyi seçerek, manuel toplama ile kurtarılabilir. 37 ºC 15 dakika ayırmak. Pelet, yıkama ve NPC ortam levha 24 oyuklu poli-L-ornitin / laminin kaplanmış plaka üzerine.

Sinir Progenitör Hücreler 3. Genişleme

Not: hiPSC NPC Matrigel- veya Poli-L-Ornitin / laminin kaplanmış plakalar ya da üzerinde yetiştirilir. Biz genellikle Matrige kullanınl-plakalar daha çabuk hazırlanan ve düşük maliyetle edilebilir.

1. Hızlı Matrigel kaplı plakalar hazırlamak çözülmesi ve 24 ml Matrigel, 1 mg donmuş bir kısım tekrar süspansiyon soğuk DMEM / F12 ve hemen iki altı oyuklu plakaların her bir oyuğuna 2 ml dağıtmak için. 37 ° C'de en az 1 saat süreyle inkübe edin.
   NOT: Matrigel sadece kullanımdan hemen önce, yıkanmış değil, aspire edilmesi gerekiyor.
2. Ikinci günde NPC Yem ve çok yüksek yoğunlukta korumak veya kendiliğinden nöronlara ayırt edecektir.
   NOT: rağmen daha kurulmuş NPC genellikle 1 split: 2 seyrek olarak bir kez her iki haftada: Her hafta 4, çok düşük geçiş NPC 1 bölünebilir.
3. , Bölme birinci aspirasyon ortam ve 6-çukurlu plaka içinde çukur başına 1 ml sıcak Accutase (1X) ekleyin. 10-15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
4. Yavaşça mümkün olduğu kadar az mekanik stres ile DMEM / F12 ihtiva eden bir 15 ml tüp içine müstakil hücreleri aktarın. Enzim ise hücreleri titre etmeyin. Spinni Pelet hücreleri5 dakika boyunca 1000 x g'de ng.
5. Yıkama aspire ve özgün kuyu başına ~ 1 ml NPC medyada NPC yeniden askıya 6-iyi.
   NOT: 6-iyi bir çanak bir birleşik kuyu 5-10.000.000 hücreleri vardır ki bekleyin; Bu hematositometre önce yeniden kaplama kullanılarak bir hücre 10l kesir hesabıyla doğrulanabilir.
6. NPC, nöronlar veya neurospheres olarak yeniden süspansiyon, yeniden plakalı NPC'ler ardından. 6 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu başına yaklaşık 1-2000000 hücreleri plaka, NPC korumak için. neurosphere oluşumu verimliliği deneyleri ve hücre hatları arasında değişir, ancak 200.000 ila 1.000.000 hücre yapışkan olmayan bir 6-yuvalı plaka içinde çukur başına tohumlanır halinde genellikle en iyi ortaya olabilir; neurospheres topaklanma meydana gelirse, tohumlanmış hücrelerinin sayısını azaltabilir. Nöron ortamı ile NPC ortamı yerine 6-çukurlu plaka içinde çukur başına nöronlara ayırt etmek için, plaka yaklaşık olarak 200,000 hücre.
7. İmmünohistokimyasal her kurulan NPC hattını doğrulamak. Yeterli miktarda hücre malzemesi olmuştur expanNestin ve Sox2 antikorların Değerlendirme aracı, etiket NPC. Onaylı NPC hatları da 4-6 hafta boyunca nöronların içine farklılaştırılmış ve III-tübülinin ve MAP2AB için antikorlar ile etiketlenmiş olmalıdır.
   1. 10 dakika boyunca 4 ° C'de PBS içinde% 4 paraformaldehid içinde hücreleri saptamak. PBS içinde% 1.0 Triton, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında NPC geçirgenliği ve daha sonra 30 dakika boyunca oda sıcaklığında% 0.1 Triton ile% 5 eşek serumu içinde engeller.
   2. Gece boyunca 4 ° C'de,% 0.1 Triton ile% 5 eşek serumu, birincil antikor ile inkübe edin.
      Not: Aşağıdaki antikorlar tavsiye: keçi anti-Sox2, 1: 200; Fare anti-insan Nestin, 1: 200; tavşan anti-βIII-tübülin, 1: 500; fare anti-βIII-tübülin, 1: 500; fare anti-MAP2AB, 1: 200. (Şekil 2).
   3. Oda sıcaklığında 1-2 saat süre ile,% 0.1 Triton ile% 5 eşek serumu, 300: PBS ile yıkandıktan sonra, 1 ile keçi, fare ya da tavşan uygun konjuge sekonder antikor ile ikincil antikorlar hücreleri inkübe edin. 0.5 ug / ml DAPI (4 'ile çekirdek, leke hücreleri görselleştirmek için6-diamidino-2-fenilindol sonra) ve Vectashield ile monte edin.

4. NPC İletimi

1. Transfekte edilmiş hücrelerin ²¹ yüzdesini arttırmak için (1 saat süre ile 1000 x g de virüsün mevcudiyetinde hücre kültür plakalarının santrifüj) spinfection kullanın. NPC medyada seyreltilmiş enfeksiyon istenen çokluğu (genellikle 1-10) (İB), titre aspire medya ve ilgili aşırı ifadesinin (veya kontrol) lentivirüsler (veya retrovirüsler) ile değiştirin. 1.5 mi, 6-çukurlu plaka içinde çukur başına hacmi (ya da doku kültürü plakaları diğer türleri için, uygun bir şekilde ölçekli hacmi) kullanın. 1000 xg'de Spin ve bir plaka santrifüj içinde 1 saat süre ile 37 ° C.
   NOT: İdeal, bölme 1-2 gün içinde lentiviral veya retroviral vektörlerle NPC transduce. Ticari veya laboratuvar hazırlanan virüsleri kullanarak olsun, uygun seri seyreltme ile önceden virüsün toplu titre etmek yararlı olabilir. (Şekil 3).
2. Cel azaltmak içinlular ölüm, spinfection 8 saat içinde ortam değiştirin.
   Not: Viral birleştirme ve transgen sentezleme raportör gen floresan ile 24 saat içerisinde tespit edilebilir. (Virüs bir floresan muhabiri eksiği varsa, bu değerlendirmek daha zordur; başarılı transfeksiyon iyi ekspresyonu ürünleri için immünoblot, immünohistokimyada veya qPCR tarafından onaylanmış olabilir.) Tam anlatım 3-7 gün sürebilir; Ek virüs tekrar spinfections transfekte hücrelerin yüzdesini arttırmak için gerekli olabilir. Tekrarlayan spinfections günlük oluşabilir ama çok sık olması gerekmez. İdeal olarak, bir flüoresan raportör kullanılıyorsa,> hücrelerin% 80 etiketlenmelidir.

5. Neurosphere değiştirme tahlili

Not: NPC enzimatik ayrışma ardından kendiliğinden Neurospheres bir şekilde, - hücre NPC ortam içinde süspansiyon halinde kültürlenen ise, (NPC genişleme 'de kullanılana benzer bir şekilde tarafından 3,3-3,6 adım).

1. Kısaca, ayırmak büyümekneurospheres oluşturmak için yapışkan olmayan plakalar içinde 48 saat için NPC ortam d NPC. (Şekil 4).
2. Neurosphere geçişi için, bir 96-yuvalı plaka içinde, oldukça DMEM daha çekme Neurosphere önce 1-2 saat soğuk NPC ortamı kullanılarak taze Matrigel plakaları hazırlamak. Kuyulardan Matrigel aspire etmeyin.
3. Ilk olarak, embriyonik kök hücre-türevli neurospheres ²² için yayınlanan gibi, el, selüler artığın ayrılması için NPC medya içinde bir defa yıkandıktan sonra, mikroskop altında NPC türetilmiş neurospheres al. Bir Matrigel kaplı 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna, bir neurosphere aktarın.
4. Her bir 96-çukurlu plaka içindeki neurospheres soğuk NPC bir ortamda seyreltilir, ek olarak 0.5 mg Matrigel ekleyin.
5. Elle iyi bir pipet ucu kullanarak ortasında her neurosphere merkezi.
   NOT: Bu sonuçlar değişkenliği azaltmak amacıyla, benzer büyüklükte neurospheres almak önemlidir.
6. Göç 48 saat için ortaya ve daha sonra w hücreleri düzeltmek için izinistenen immünohistokimyasal işaretleri ile i% 4 paraformaldehid ve leke.
7. Radyal geçiş bunların tamamen 4x objektif mikroskop kullanarak, fotoğraf neurospheres tespit edilmesi gerekebilir. Kuyunun kenarına veya analiz ikinci bir neurosphere temas herhangi neurospheres hariç.
   NOT: göç daha uzun 48 saat oluşursa, ortaya çıkan radyal göç olasılıkla bir 4x objektif kullanarak görüntü çok büyük olacaktır.
8. NIH ImageJ yazılımı (Şekil 5) kullanılarak her bir neurosphere ortalama geçiş ölçün. Bu aşağıda tarif edilen analiz yöntemleri kullanılarak yapılabilir:
   1. Radyal göç:
      1. El ile daha sonra oluşan şeklin alanını hesaplamak için ölçün (Ctrl + M) işlevini kullanabilirsiniz serbest seçim aracını kullanarak uzak göç hücrelerin kenarına iz. Ölçme önce alan Alanı Analiz sekmesi altında bulunan Set Ölçümleri penceresinde işaretli olduğundan emin olun. KullanAlan ölçümü ve bir çevreye (A = πr ²⁾ alanı için denklem değeri çapındaki (dış) belirlemek gerekmektedir.
      2. Orijinal neurosphere kenarına Trace alanını ölçmek ve aynı şekilde yarıçapı (iç) hesaplayın. Dış ve iç yarıçapı arasındaki fark olarak toplam radyal göç hesaplayın.
   2. Büyük hücresel göç:
      1. Tedbir (Ctrl + M) işlevi, ardından düz çizgi seçim aracını kullanarak iç neurosphere kenarından beş uzak hücrelerinin hareket mesafeyi ölçün.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Sinir rozet apico-bazal kutupları (Şekil 1) ile nöroepitelyal hücrelerin yuvarlak kümeleri olarak karakteristik görünüşü, bir aydınlık mikroskop kullanarak, morfolojik tespit edilebilir. NPC çok yüksek hücre yoğunluğu tipik olarak kültürlenir rağmen, hemen gerçekleşen pasajlanmasını da sonra biraz piramit şeklinde soma ve bipolar nörit yapısı görülebilir (Şekil 1D) 'dir. III-tubulin boyama NPC bazı oranı sürekli kültür (Şekil 1F)...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

^Biz, NPC içine hiPSCs, bir sinir hücre tipi olan hiPSC türetilmiş nöronların gen imzası önemli bir kısmı korunur ve bu potansiyel hastalık patogenezinde ⁸ katkıda gelişimsel yollar için bir vekil olarak hizmet edebilir ayırt etmek ile yöntemler tarif etmişlerdir ^11. Biz detaylı gibi Ayrıca, NPC biz hastalık yatkınlık moleküler ve biyokimyasal çalışmalar için uygun olabilir inanıyoruz sağlam Replikatif ve kolayca transdük nöral nüfus vardır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Life Technologies	#11330	for HES media
DMEM/F12	Life Technologies	#10565	for neural media
KO-Serum Replacement	Life Technologies	#10828	Needs to be lot tested
Glutamax	Life Technologies	#35050
NEAA	Life Technologies	#11140
N2	Life Technologies	#17502-048	Needs to be lot tested
B27-RA	Life Technologies	#12587-010	Needs to be lot tested
FGF2	Life Technologies	#13256-029	Resuspend in PBS + 1% BSA
LDN193189	Stemgent	#04-0074
SB431542	Stemgent	#04-0010
BDNF	Peprotech	#450-02	Resuspend in PBS + 0.1% BSA
GDNF	Peprotech	#450-10	Resuspend in PBS + 0.1% BSA
Dibutyryl cyclic-AMP	Sigma	#D0627	Resuspend in PBS + 0.1% BSA
L-ascorbic acid	Sigma	#A0278	Resuspend in H20
STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent	Stemcell Technologies	#05832
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT-104
Collagenase IV	Life Technologies	#17104019
CF1 mEFs	Millipore	#PMEF-CF
Poly-L-Ornithine	Sigma	P3655
Laminin, Natural Mouse 1 mg	Life Technologies	#23017-015
BD Matrigel	BD	#354230	Resuspend on ice in cold DMEM at 10 mg/ml, use 1 mg per two 6-well plate equivalent
Tissue culture treated 6-well plates	Corning	3506
Ultra low attachment 6-well plates	Corning	3471
goat anti-Sox2	Santa Cruz	sc­17320	use at 1:200
mouse anti-human Nestin	Millipore	MAB5326	use at 1:200
rabbit anti-βIII-tubulin	Covance	PRB­435P	use at 1:500
mouse anti-βIII-tubulin	Covance	MMS­435P	use at 1:500
mouse anti-MAP2AB	Sigma	M1406	use at 1:200
Plate centrifuge	Beckman Coulter	Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier)