Um Guia para a geração e uso hiPSC NPCs derivados para o Estudo das Doenças Neurológicas

Resumo

This protocol describes how neural progenitor cells can be differentiated from human induced pluripotent stem cells, in order to yield a robust and replicative neural cell population, which may be used to identify the developmental pathways contributing to disease pathogenesis in many neurological disorders.

Resumo

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long period of disease progression prior to the onset of symptoms. Because fibroblasts from patients and healthy controls can be efficiently reprogrammed into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), and subsequently differentiated into neural progenitor cells (NPCs) and neurons for the study of these diseases, it is now possible to recapitulate the developmental events that occurred prior to symptom onset in patients. We present a method by which to efficiently differentiate hiPSCs into NPCs, which in addition to being capable of further differentiation into functional neurons, can also be robustly passaged, freeze-thawed or transitioned to grow as neurospheres, enabling rapid genetic screening to identify the molecular factors that impact cellular phenotypes including replication, migration, oxidative stress and/or apoptosis. Patient derived hiPSC NPCs are a unique platform, ideally suited for the empirical testing of the cellular or molecular consequences of manipulating gene expression.

Introdução

Estudos de neurônios diferenciadas in vitro a partir de humanos células estaminais pluripotentes induzidas (hiPSCs) por nós ¹ e outros ^2,3 de expressão de genes indicam que os neurônios hiPSC assemelhar fetal em vez de adulto tecido cerebral. Actualmente, os modelos baseados em hiPSC pode ser mais adequado para o estudo da predisposição para, em vez de funções tardias da doença, neurológica. Nós já relataram que uma fracção significativa do gene assinatura de esquizofrenia neurónios derivados de hiPSC é conservado em células derivadas de esquizofrenia hiPSC progenitoras neurais (NPCs), indicando que NPCs pode ser um tipo de células útil para o estudo das vias moleculares que contribui para ^uma esquizofrenia . Nós e outros relataram migração aberrante, aumento do estresse oxidativo e espécies reativas de oxigênio, a sensibilidade a estresses ambientais sub-limiar e função mitocondrial prejudicada na esquizofrenia hiPSC NPCs ^1,4-6, bem como a diminuição neuronal conectividade e função sináptica em neurônios esquizofrenia hiPSC ^5,7-10. Se os factores moleculares que contribuem para a migração aberrante e / ou stress oxidativo na esquizofrenia hiPSC NPCs também estão na base da conectividade neuronal reduzido na esquizofrenia neurónios derivados de hiPSC, NPCs poderia ser uma população neural robusto e altamente replicativo com que para estudar os mecanismos responsáveis ​​pela doença. Além disso, porque pode-se gerar rapidamente grandes números de células e não precisam de esperar semanas ou meses para maturação neuronal, ensaios baseados em NPC são adequados para o estudo de coortes de pacientes e maiores são mais passíveis de rastreio de alto rendimento. Acreditamos que hiPSC NPCs pode servir como um proxy para as vias de desenvolvimento potencialmente contribuem para a patogênese da doença, como já foi demonstrado em desordens tão diversas como a esquizofrenia ¹ e doença de Huntington doença ^11.

Para diferenciar NPCs hiPSCs, neural inicial emprodução é conseguida através da inibição de dupla SMAD (0,1 mM e 10 mM LDN193189 SB431542) ^12. Antagonizando BMP e TGF sinalização com estas pequenas moléculas, endoderme e mesoderme especificação é bloqueado, acelerar a diferenciação neuronal e levando à formação de rosetas neurais visíveis dentro de uma semana de chapeamento. Padronização neural ocorre no início deste processo, presumivelmente, no período de formação de rosetas neural e imediatamente a seguir. Na ausência de outros sinais, estas células neurais primitivas assumir um destino prosencéfalo como ^anterior-13. Imediatamente após a formação de rosetas neural, e contínuo ao longo da expansão NPC, NPCs frontais do cérebro são cultivadas com FGF2 ^8,14. Eles têm potencial linhagem dupla e podem ser diferenciadas de populações neurais de 70-80% neurónios III-tubulina-positivos e 20-30% de proteína glial fibrilar ácida (GFAP) -positivas astrócitos (Figura 1). A maioria dos neurônios do cérebro anterior hiPSC são VGLUT1-positivo, E por isso são presumivelmente glutamatérgica e aproximadamente 30% dos neurónios estão GAD67-positivo (GABAérgica) ^8.

NPCs são rotineiramente passadas mais do que dez vezes in vitro, mantendo ao mesmo tempo perfis de diferenciação consistentes, e sem acumulação de anormalidades do cariótipo. Grupos têm relatado NPCs Passaging mais de 40 vezes ^15, no entanto, descobrimos que mais de dez passagens, NPCs mostram aumento da propensão para a diferenciação de astrócitos. NPCs bem tolerar múltiplas Freeze-descongela e pode ser transferida para crescer como neurospheres simplesmente o cultivo em placas não aderentes. NPCs são eficientemente transduzidas por vectores virais, permitindo uma rápida avaliação das consequências moleculares e celulares da perturbação genética, e facilmente expansível para se obter material suficiente para estudos bioquímicos. Além disso, porque os vectores virais permitir robusta sobre-expressão e / ou eliminação de genes relevantes a doença, em qualquer controlo ou paciente derivado neural células, pode-se usar esta plataforma para testar o efeito de fundo genético nessas manipulações. Apesar de não ser adequado para sináptica ou ensaios baseados em atividades que exigem neurônios maduros, NPCs pode ser uma alternativa prática para muitas análises moleculares e bioquímicas diretas de células neurais derivadas de pacientes.

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Protocolo

1. hiPSC Diferenciação de células progenitoras neurais

1. Crescer e expandir hiPSCs em células estaminais embrionárias humanas (HES) mídia (Tabela 1) co-cultivadas em um fibroblastos de rato embrionárias (MEF) camada alimentadora até grandes (mas subconfluentes) colônias estão prontos para a diferenciação neural através de um organismo embryoid (EB) intermediário (Figura 2). Condições de rotina cultura hiPSC estão bem descritos em outros lugares ^16,17; resumidamente, hiPSCs crescer em meios de HES em uma camada de alimentação MEF até à confluência, em seguida passagem por via enzimática com colagenase (1 mg / ml em DMEM) e expandir cerca de 1: 3 a cada 7 dias.
2. Para preparar as placas revestidas com poli-L-ornitina / laminina, placas de revestimento com 10 g / ml de poli-L-ornitina em água estéril para as superfícies de plástico (50 g / ml para as superfícies de vidro) e incubar a temperatura ambiente durante 3-24 h. Lavar pelo menos uma vez com água estéril e, em seguida, cubra com 5g / ml Laminin em PBS estéril a TA durante 3-24 horas.
   NOTA: Se envolvido em plástico, as placas podem serarmazenados por até seis meses a -20 ºC.
3. No Dia 1, enzimaticamente levantar hiPSCs confluentes (geralmente cultivadas em MEFs, ou hiPSCs cultivadas em meios definidos como em Matrigel TeSR ¹⁸⁾ a partir da placa de grandes colónias utilizando 1 mg / ml de colagenase IV em DMEM / F12.
   NOTA: após 1-2 horas de incubação a 37 ºC, as colônias serão flutuando no prato.
4. Delicadamente, lave colônias hiPSC (por sedimentação, não centrifugação) 1-2x com DMEM / F12, ressuspender em 2 mL / poço de N2 / media B27 (Tabela 1) e transferir para pratos não-aderente de 6 poços (combinar 3 poços em 1 -bem) ^19.
   NOTA: Durante a noite, irá formar colônias flutuantes aglomerados esféricos denominados "corpos embrióides" (EBS). Esperar a morte celular substancial.
5. No dia 2, placas de inclinação e permitir EBS para resolver. Retire cuidadosamente a mídia e lavar uma vez com DMEM / F12 para remover detritos. Alimente com N2 / B27 meios suplementados com inibidores SMAD duplos (0,1M LDN193189 e 10M SB431542) ¹² .
6. Nos Dias 3-7, neuralization ocorrerá no contexto de dupla inibição SMAD; verificar que a EBS são redondos, mas não cística. Alimente EBs cada segundo dia com a mídia N2 / B27 suplementadas com 0,1 M LDN193189 e 10M SB431542.
7. Nos dias 7-14, a seguir ao plaqueamento de EBs poli-L-ornitina / laminina placas revestidas, veja utilizando um microscópio de campo claro que rosetas neurais começam a aparecer dentro de poucos dias (caracterizado como aglomerados redondos de células neuroepiteliais com polaridade APICO-basal; A Figura 1). Continuem a alimentar EBs aderentes a cada segundo dia, com media N2 / B27 suplementado com 0,1 M LDN193189, 10M SB431542 e 1 g / ml laminina.

2. Harvest of Neural Rosetas

NOTA: Recomendamos que rosetas neurais ser enzymatically colhidas utilizando Reagente de Selecção Neural Rosette ²⁰ ou reagente seleção similar. Embora rosetas neurais podem ser colhidos manualmente em 6 poços de poli-L-ornitina / laminina placa revestida, this metodologia leva treinamento intensivo para mestre, e, dependendo da habilidade do usuário, pode requerer uma segunda rodada de picking no dia 20 para enriquecer ainda mais para NPCs e empobrecem os tipos de células não-neuronais.

1. Para selecção enzimática de rosetas neurais no dia 14, os meios de aspirado de EBs aderidas e adicionar 1 ml de reagente de selecção roseta neural por poço para uma placa de 6 poços. Incubar a 37 ºC durante 1 hora.
2. Com uma pipeta P1000, remover suavemente enzima de cada poço. Adicionar 1 ml de DMEM / F12 por poço para lavar.
3. Com um P1000, recolher o 1 ml de DMEM / F12 e rapidamente expelir o DMEM / F12 de volta para dentro do poço, separando assim as rosetas da placa. Recolha as rosetas em um tubo falcon.
4. Pipetar mais 1 ml de DMEM / F12 e rapidamente em expulsar o mesmo para separar bem rosetas restantes. (Não triturar. Tente não quebrar agregados roseta). Recolha as rosetas neurais em um mesmo tubo falcon.
5. Repita o passo 2.4, se necessário. Se rosetas não retirar prontamente, adicione more enzima e repetir o processo (passos 2,1-2,4)
6. Girar células a 300 xg durante 3 min. Aspirar a lavagem, e re-suspender rosetas em 2 ml de meio de NPC (Tabela 1). Transferência de células (1: 1) em um poli-L-ornitina / laminina revestido placa de 6 poços.
7. A partir Dias 15-21, as rosetas neurais irá expandir; rosetas de alimentação a cada segundo dia, com media NPC.
8. Avaliar a qualidade das rosetas neurais e assegurar que as células do tipo fibroblasto planas não estão a expandir dentro da cultura.
   NOTA: Se não-rosetas persistirem, a cultura NPC às vezes pode ser reaproveitado por picking o manual, selecionando apenas os melhores das rosetas escolhidos em Accutase. Dissociar 15 min a 37 ºC. Pellet, lavar e placa em meios NPC para 24 poços de poli-L-ornitina / laminina placa revestida.

3. Ampliação da Neural células progenitoras

NOTA: hiPSC NPCs podem ser cultivadas em qualquer Matrigel- ou poli-L-ornitina / laminina placas revestidas. Normalmente usamos Matrigel-placas de como eles podem ser preparados de forma mais rápida e com menor custo.

1. Para preparar as placas revestidas com Matrigel, descongelar rapidamente e ressuspender uma alíquota congelada de 1 mg em 24 ml de Matrigel frio DMEM / F12 e distribuir imediatamente 2 ml para cada poço de duas placas de seis poços. Incubar durante pelo menos 1 h a 37 ºC.
   NOTA: Matrigel necessita apenas de ser aspirado, não lavadas, imediatamente antes da utilização.
2. Alimente NPCs cada segundo dia e manter a densidade muito elevada ou eles vão diferenciar espontaneamente aos neurônios.
   NOTA: NPCs Embora mais estabelecidas são tipicamente divididas 1: 4 a cada semana, NPCs muito baixos de passagem podem ser divididas 1: 2 como com pouca frequência quanto uma vez a cada duas semanas.
3. Para dividir, media primeiros aspirado e adicione 1 ml quente Accutase (1x) por poço de 6 poços. Incubar a 37 ° C por 10-15 min.
4. Suavemente transferir células destacadas para um tubo de 15 ml contendo DMEM / F12 com tão pouco quanto possível a tensão mecânica. Não titulação em células enquanto enzima. Células de pellets por spinning a 1000 xg durante 5 min.
5. Aspirar a lavagem, e re-suspender NPCs em ~ 1 ml de meio por poço original NPC de 6 poços.
   NOTA: Esperar que um bem confluente de um de 6 poços prato tem 5-10.000.000 células; isto pode ser confirmado por contagem de uma aliquota de células 10l usando um hematocytometer antes da re-deposição.
6. Após re-suspensão, NPCs re-placa como NPCs, neurônios ou neurospheres. Para manter NPCs, placa aproximadamente 1-2 milhões de células por poço de uma placa de 6 poços. A eficiência de formação de neuroesferas podem variar entre experiências e as linhas celulares, mas em geral ocorre melhor se entre 200.000 e 1.000.000 células são semeadas por poço de um não-aderente placa de 6 poços; se ocorrer aglutinação das neuroesferas, reduzir o número de células semeadas. Para diferenciar a neurônios, placa de cerca de 200.000 células por poço de uma placa de 6 poços, substituindo media NPC com a mídia neurônio.
7. Immunohistochemically validar cada linha NPC estabelecida. Uma vez que o material celular suficiente tenha sido expanded, NPCs de etiqueta com anticorpos para Nestin e SOX2. Linhas Validated NPC também devem ser diferenciadas em neurônios durante 4-6 semanas, e marcadas com anticorpos para III-tubulina e MAP2AB.
   1. Fixar as células em 4% de paraformaldeído em PBS a 4C durante 10 min. Permeabilizar NPCs à TA durante 15 min em 1,0% de Triton em PBS e, em seguida bloquear em 5% de soro de burro com 0,1% de Triton à TA durante 30 min.
   2. Incubar com anticorpo primário em 5% de soro de burro com 0,1% de Triton, durante a noite a 4C.
      NOTA: Recomendamos os seguintes anticorpos: cabra anti-Sox2, 1: 200; nestina de murganho anti-humano, 1: 200; de coelho anti-βIII-tubulina, 1: 500; de ratinho anti-βIII-tubulina, 1: 500; de ratinho anti-MAP2AB, 1: 200. (Figura 2).
   3. Após uma lavagem com PBS, as células incubar com anticorpos secundários conjugados com o anticorpo secundário adequado para cabra, ratinho ou coelho a 1: 300, em em 5% de soro de burro com 0,1% de Triton durante 1-2 horas à temperatura ambiente. Para visualizar os núcleos, células mancha com 0,5 ug / ml de DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) e, em seguida, montar com Vectashield.

4. NPC Transdução

1. Use spinfection (centrifugação das placas de cultura de células na presença do vírus a 1.000 xg durante 1 hora) para aumentar a percentagem de células transfectadas ^21. Aspirar media e substituir com a superexpressão relevante (ou controle) lentivírus (ou retrovírus), titulado para a multiplicidade desejada de infecção (MOI) (normalmente 1-10), diluída em meio NPC. Utilizar 1,5 mL de volume por poço de uma placa de 6 poços (ou um volume de escala apropriada para outros tipos de placas de cultura de tecido). Giram em 1000 xg e 37 ºC durante 1 hora em uma placa de centrífuga.
   NOTA: O ideal é que a transdução de NPCs com lentivírus ou vetores retrovirais dentro de 1-2 dias de divisão. Seja usando vírus comerciais ou obtidos em laboratório, pode ser útil para titular adequadamente lotes de vírus com antecedência por diluição em série. (Figura 3).
2. Para reduzir celmorte lular, substituir a mídia dentro de 8 horas de spinfection.
   NOTA: a integração virai e a expressão do transgene deve ser detectável dentro de 24 horas por meio de fluorescência de gene repórter. (Se o vírus não tem um repórter fluorescente, isso é mais difícil de avaliar; transfecção de sucesso pode ser melhor validada por immunoblot, imuno-histoquímica ou qPCR para produtos superexpressão.) Expressão completa pode demorar 3-7 dias; spinfections repetidas com vírus adicional pode ser necessário para aumentar a percentagem de células transfectadas. Spinfections recorrentes podem ocorrer diariamente, mas não precisa ser tão freqüente. Idealmente, se estiver usando um repórter fluorescente,> 80% das células devem ser rotulados.

5. Neurosphere Migration Assay

NOTA: As neuroesferas forma espontaneamente, após a dissociação enzimática de NPCs (por uma maneira idêntica à utilizada na expansão NPC - passos de 3,3-3,6), se as células são cultivadas em suspensão em meio de NPC.

1. Em resumo, crescem dissociarNPCs d em media NPC para 48 horas em placas não aderentes, a fim de gerar neurospheres. (Figura 4).
2. Para a migração neuroesfera, para preparar as placas de Matrigel frescos usando meios NPC frio, em vez de DMEM, numa placa de 96 poços, 1-2 h antes da colheita de neuroesferas. Não aspirar Matrigel dos poços.
3. Conforme publicado originalmente para estaminais embrionárias derivadas de células neurospheres ^22, escolher manualmente neurospheres NPC-derivados sob um microscópio, depois de lavar uma vez na mídia NPC para remover os restos celulares. Transferir uma neuroesfera a cada poço de uma placa revestida Matrigel de 96 poços.
4. Adicionar mais 0,5 mg adicionais de Matrigel, diluiu-se em meios frios NPC, para as neuroesferas em cada placa de 96 poços.
5. Centrar cada manualmente neuroesfera individual no meio da cavidade utilizando uma ponta de pipeta.
   Nota: É importante escolher neurospheres de tamanho semelhante, a fim de reduzir a variabilidade nos resultados.
6. Permitir que a migração ocorra durante 48 horas e, em seguida, corrigir células wom paraformaldeído 4% e mancha com marcadores imunoistoquímicos desejados.
7. Se a migração radial deve ser determinado, neurospheres fotografia em sua inteiramente usando um objetivo 4x microscópio. Excluir qualquer neuroesferas contacto com a borda do poço ou uma segunda neuroesfera a partir da análise.
   NOTA: Se ocorrer a migração por mais de 48 horas, a migração radial resultante provavelmente vai ser muito grande para a imagem usando uma objetiva de 4x.
8. Medir a migração média de cada neuroesfera usando software NIH ImageJ (Figura 5). Isto pode ser feito usando qualquer um dos métodos de análise descritos abaixo:
   1. Migração radial:
      1. Traçar manualmente a aresta da migração de células usando a ferramenta de seleção à mão livre, em seguida, usar a função Measure (Ctrl + M) para calcular a área da forma resultante. Antes de medir a área de certificar-se de que a área está marcada na janela Definir Medidas encontrada na guia Analisar. Use avalor da medição da área e a equação para a área de um círculo (A = πr ²⁾ para determinar o raio (exterior).
      2. Seguir a borda da neuroesfera original, medir a área e calcular o raio (interior) da mesma maneira. Calcular o total de migração radial como a diferença entre os raios interno e externo.
   2. A grande migração celular:
      1. Meça a distância percorrida dos cinco células mais afastadas da borda da neurosphere interior usando a ferramenta de seleção linear seguido pela Medida função (Ctrl + M).

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Resultados

Rosetas neurais podem ser identificadas morfologicamente, utilizando um microscópio de campo claro, pela sua aparência característica como aglomerados redondos de células neuroepiteliais com polaridade APICO-basal (Figura 1). Embora NPCs são tipicamente cultivadas a uma densidade celular muito alta, imediatamente após a passagem em, ligeiramente soma em forma piramidal, e estrutura de neurites bipolar é visível (Figura 1D). NPCs validados expressam nestina e SOX2 na maioria das ...

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Discussão

Nós descrevemos métodos pelos quais a diferenciar hiPSCs em NPCs, um tipo de célula neural em que uma fração significativa da assinatura gene de neurônios hiPSC derivados é conservada e que pode servir como um proxy para as vias de desenvolvimento potencialmente contribuem para a patogênese da doença ^{8, 11.} Além disso, como já detalhado, NPCs são uma população neural robustamente replicativo e facilmente transduzidas, que acreditamos que pode ser adequado para estudos moleculares e bioquímicos ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Life Technologies	#11330	for HES media
DMEM/F12	Life Technologies	#10565	for neural media
KO-Serum Replacement	Life Technologies	#10828	Needs to be lot tested
Glutamax	Life Technologies	#35050
NEAA	Life Technologies	#11140
N2	Life Technologies	#17502-048	Needs to be lot tested
B27-RA	Life Technologies	#12587-010	Needs to be lot tested
FGF2	Life Technologies	#13256-029	Resuspend in PBS + 1% BSA
LDN193189	Stemgent	#04-0074
SB431542	Stemgent	#04-0010
BDNF	Peprotech	#450-02	Resuspend in PBS + 0.1% BSA
GDNF	Peprotech	#450-10	Resuspend in PBS + 0.1% BSA
Dibutyryl cyclic-AMP	Sigma	#D0627	Resuspend in PBS + 0.1% BSA
L-ascorbic acid	Sigma	#A0278	Resuspend in H20
STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent	Stemcell Technologies	#05832
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT-104
Collagenase IV	Life Technologies	#17104019
CF1 mEFs	Millipore	#PMEF-CF
Poly-L-Ornithine	Sigma	P3655
Laminin, Natural Mouse 1 mg	Life Technologies	#23017-015
BD Matrigel	BD	#354230	Resuspend on ice in cold DMEM at 10 mg/ml, use 1 mg per two 6-well plate equivalent
Tissue culture treated 6-well plates	Corning	3506
Ultra low attachment 6-well plates	Corning	3471
goat anti-Sox2	Santa Cruz	sc­17320	use at 1:200
mouse anti-human Nestin	Millipore	MAB5326	use at 1:200
rabbit anti-βIII-tubulin	Covance	PRB­435P	use at 1:500
mouse anti-βIII-tubulin	Covance	MMS­435P	use at 1:500
mouse anti-MAP2AB	Sigma	M1406	use at 1:200
Plate centrifuge	Beckman Coulter	Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier)