Руководство по составления и использования hiPSC, полученных НПС по изучению неврологических заболеваний

Резюме

This protocol describes how neural progenitor cells can be differentiated from human induced pluripotent stem cells, in order to yield a robust and replicative neural cell population, which may be used to identify the developmental pathways contributing to disease pathogenesis in many neurological disorders.

Аннотация

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long period of disease progression prior to the onset of symptoms. Because fibroblasts from patients and healthy controls can be efficiently reprogrammed into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), and subsequently differentiated into neural progenitor cells (NPCs) and neurons for the study of these diseases, it is now possible to recapitulate the developmental events that occurred prior to symptom onset in patients. We present a method by which to efficiently differentiate hiPSCs into NPCs, which in addition to being capable of further differentiation into functional neurons, can also be robustly passaged, freeze-thawed or transitioned to grow as neurospheres, enabling rapid genetic screening to identify the molecular factors that impact cellular phenotypes including replication, migration, oxidative stress and/or apoptosis. Patient derived hiPSC NPCs are a unique platform, ideally suited for the empirical testing of the cellular or molecular consequences of manipulating gene expression.

Введение

Экспрессия генов исследований нейронов, дифференцированных в пробирке из человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) нами ¹ и других ^2,3 показывают, что hiPSC нейроны напоминают плода, а не взрослых мозговой ткани. В настоящее время модели hiPSC основе может быть более подходящим для изучения предрасположенности к, а не конца особенностей, неврологические заболевания. Ранее мы уже сообщали, что значительная часть гена подписью шизофренией hiPSC полученных нейронов сохраняется у больных шизофренией hiPSC полученных нервных клеток-предшественников (НПС), указывая, что НПС может быть полезным типом клеток для изучения молекулярных путей, способствуя шизофрении ¹ , Мы и другие сообщили, отклоняющееся миграции, повышение окислительного стресса и активных форм кислорода, чувствительность к югу от пороговых экологических стрессов и нарушения функции митохондрий при шизофрении hiPSC НПС ^1,4-6, а также снижение нейронов Connectivity и синаптической функции у больных шизофренией hiPSC нейронов ^5,7-10. Если молекулярные факторы, способствующие аномальным миграции и / или окислительного стресса у больных шизофренией hiPSC НПС также лежат в основе снижение нейронов подключения при шизофрении hiPSC полученных нейронов, НПС может быть надежной и высоко репликативной нейронной популяции, с которой для изучения механизмов, ответственных за болезни. Кроме того, поскольку можно быстро произвести большое количество клеток и не нужно ждать несколько недель или месяцев для созревания нейронов, анализы, основанные на NPC пригодны для изучения больших когорт пациентов и более пригодными для высокопроизводительного скрининга. Мы считаем, что hiPSC НПС может служить в качестве прокси для путей развития, потенциально способных к патогенезе заболевания, как уже было показано, при расстройствах как разнообразны, как шизофрения ¹ и Хантингтона болезни ^11.

Чтобы дифференцировать NPC, с hiPSCs, начальной нервной вводства осуществляется двойным SMAD торможения (0,1 мМ LDN193189 и 10 мМ SB431542) ^12. Конфликтуя BMP и TGF- сигналов с этих малых молекул, эндодермы и мезодермы спецификация их, ускоряя дифференцировку нейронов и приводит к образованию видимых нервных розетками в течение одной недели обшивки. Нейронные рисунка происходит в начале этого процесса, по-видимому в период нейронной розеткообразования и сразу же после этого. При отсутствии других сигналов, эти примитивные нервные клетки предположить переднюю переднего мозга, как судьба ^13. Сразу же после образования нервной розетки, и продолжается в течение расширения NPC, переднего мозга НПС культивируют с FGF2 ^8,14. Они имеют двойное клонов потенциал и могут быть дифференцированы в нейронных популяций 70-80% III-ТУБУЛИН-положительных нейронов и 20-30% глиальных фибриллярный кислый белок (GFAP) -позитивных астроцитов (рис 1). Большинство переднего мозга hiPSC нейронов VGLUT1-положительных, И поэтому по-видимому глутаматергическая, хотя около 30% нейронов GAD67-положительных (ГАМК) ^8.

НПС регулярно пассировать более чем в десять раз в пробирке, сохраняя последовательные профили дифференциации, и без накопления кариотипа нарушения. Группы сообщили пассажи НПС более чем в 40 раз ^15, однако, мы находим, что за десять проходов, НПС показывают увеличение склонности к астроцитов дифференциации. НПС хорошо переносят многократные замораживания-оттаивания может быть перешли расти, как нейросферах просто культивирование в неприлипающих пластин. НПС эффективно трансдуцировали вирусными векторами, что позволяет быстро оценить молекулярных и клеточных последствий генетической возмущений и легко расширяется до получения достаточного количества материала для биохимических исследований. Кроме того, поскольку допускает вирусные векторы надежный чрезмерной экспрессии и / или нокдауна болезни отношение генов, в любом управления или пациента происходит NeurAl клетки, можно использовать эту платформу для тестирования эффекта генетического фона на этих манипуляций. Хотя это и не подходит для Synaptic или деятельности на основе анализов, требующих зрелых нейронов, НПС может быть практической альтернативой для многих простых молекулярных или биохимических анализов пациента, полученных нервных клеток.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. hiPSC дифференциация Neural клеток-предшественников

1. Расти и расширяться hiPSCs в человеческих эмбриональных стволовых клеток (HES) носитель (Таблица 1) совместно культивировали на мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) фидерного слоя до больших (но субконфлюентные) колонии не будут готовы для нейронной дифференциации с помощью эмбриоидного тела (EB) промежуточного (рисунок 2). Обычные hiPSC условия культивирования хорошо описаны в других ^16,17; Кратко, не растут в hiPSCs HES сред на MEF фидерного слоя до сливной, а затем ферментативно проход с коллагеназы (1 мг / мл в DMEM) и расширить примерно 1: 3 раз в 7 дней.
2. Для приготовления покрытых пластин поли-L-орнитин / ламинин, пальто пластин с 10 мкг / мл поли-L-орнитин в стерильной воде для пластиковых поверхностей (50 мкг / мл для стеклянных поверхностей) и инкубируют при комнатной температуре в течение 3-24 ч. Промыть по меньшей мере, один раз стерильной водой, а затем покрытие с 5 г / мл ламинин в стерильном PBS при комнатной температуре в течение 3-24 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если завернутый в пластик, плиты могут бытьхраниться до шести месяцев при -20 ° C.
3. На 1-й день, ферментативно поднимать субконфлюентные hiPSCs (как правило, выращенных на MEFs или hiPSCs, выращенных в определенных средах, таких как TeSR ¹⁸ на Матригель) от пластины, как больших колоний с использованием 1 мг / мл коллагеназы IV в DMEM / F12.
   Примечание: После 1-2 ч инкубации при 37 ° С, колонии будет плавающей в чашке.
4. Осторожно промыть hiPSC колонии (отстаиванием, не центрифугирования) 1-2X с DMEM / F12, ресуспендируют в 2 мл / лунку N2 / B27 СМИ (таблица 1) и передачи не соблюдают 6-луночные планшеты (по совместительству 3-колодцы в 1 Ну) ^19.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ночь колонии образуют плавающие шаровые скопления называются "эмбриональных телец" (EBS). Ожидать существенных гибель клетки.
5. На 2-й день, наклона пластин и позволяют ЭТ отстояться. Осторожно снимите СМИ и мыть один раз DMEM / F12, чтобы убрать мусор. Подача со N2 / B27 среде с добавлением двойного Smad ингибиторов (0,1 М LDN193189 и 10M SB431542) ¹² .
6. В дни 3-7, neuralization будет происходить в контексте двойного SMAD торможения; убедитесь, что ЭТ круглые, но не кистозная. Поток ЭТ каждый второй день с N2 / B27 среде с добавлением 0,1 М LDN193189 и 10М SB431542.
7. В дни 7-14 после покрытие из ЭТ с поли-L-орнитин / ламинин пластин с покрытием, проверить с помощью микроскопа светлого, что нейронные розетки начинают появляться в течение нескольких дней (характеризуется как круглые кластеров нейроэпителиальных клеток с апикально-базальной полярности; Рисунок 1). Продолжайте кормить прилипшие ЭТ каждый второй день с N2 / B27 среде с добавлением 0,1 М LDN193189, 10M SB431542 и 1 г / мл ламинина.

2. Сбор Neural Розетки

ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем, что нейронные розетки ферментативно собирают с использованием нейронных Розетка выбора реагента ²⁰ или аналогичный выбора реагента. Хотя нейронные розетки можно вручную выбрал в 6-луночный планшет, покрытый поли-L-орнитин / ламинин, ThiМЕТОДОЛОГИЯ занимает обширную подготовку в освоении, и, в зависимости от пользователя мастерства, может потребоваться второй тур кусать день 20 для дальнейшего обогащения НПС и истощать без нервные типы клеток.

1. Для ферментативного отбора нейронных розетками на 14 день, аспирация средств массовой информации из придерживались ЭТ и добавить 1 мл нервной выбора розетка реагента на лунку для 6-луночного планшета. Инкубируют при 37 ° С в течение 1 часа.
2. С P1000 Pipetman, аккуратно удалите фермент из каждой лунки. Добавить 1 мл DMEM / F12 на хорошо вымыть.
3. С P1000, собирать 1 мл DMEM / F12 и быстро изгнать DMEM / F12 обратно в хорошо, таким образом, снятие розеток от пластины. Сбор розетки в трубки сокола.
4. Внесите еще 1 мл DMEM / F12 и быстро изгнать в той же скважине, чтобы отделить оставшиеся розетки. (Не растереть. Старайтесь не порвать розеточные агрегатов). Сбор нервные розетки в той же трубки сокола.
5. Повторите шаг 2,4, как это необходимо. Если розетки не отделить легко, добавьте месповторно фермента и повторить процесс (шаги 2.1-2.4)
6. Спин клетки при 300 х г в течение 3 мин. Аспирируйте стирки и повторно приостанавливать розетки в 2 мл NPC информации (таблица 1). Передача клетки (1: 1) в поли-L-орнитин / ламинин покрытием 6-луночный планшет.
7. От дней 15-21 нервные розетки будет расширяться; корма розетки каждый второй день с NPC СМИ.
8. Оценка качества нервных розеток и гарантировать, что плоские фибробластов, как клетки не расширяется в культуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если не-розетки сохраняются, культура NPC иногда можно спасти с помощью ручного сбора, выбрав только лучшие из отборных розеток в Accutase. Диссоциируют 15 мин при 37 ° С. Пелле, мыть и пластины в NPC носителя, на 24-луночного поли-L-орнитин / ЛАМИНИНА пластины с покрытием.

3. Расширение Neural клеток-предшественников

Примечание: hiPSC НПС можно выращивать на любой Matrigel- или поли-L-орнитин / ламинин пластин с покрытием. Обычно мы используем MatrigeL-пластины, поскольку они могут быть получены быстрее и с меньшими затратами.

1. Для приготовления пластины Матригель покрытием, быстро оттаивают и ресуспендируют в 1 мг замороженных аликвоту Матригель в 24 мл холодной DMEM / F12, и сразу же распределить 2 мл в каждую лунку два шесть-луночных планшетах. Инкубировать в течение, по меньшей мере 1 ч при 37 ° С.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Matrigel нужно только атмосферный, не мыть, непосредственно перед использованием.
2. Поток НПС каждый второй день и поддерживать на очень высокой плотности, или они будут спонтанно дифференцироваться в нейроны.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на более установленных NPC, обычно расщепляются 1: 4 каждую неделю, очень низкие НПС канал может быть разделен 1: 2 редко, например раз в две недели.
3. Чтобы разделить первые аспирации СМИ и добавить 1 мл теплой Accutase (1x) на лунку 6-луночного планшета. Инкубируют при 37 ° С в течение 10-15 мин.
4. Осторожно передавать отдельные клетки в 15 мл пробирку, содержащую DMEM / F12 с минимальным механическим нагрузкам, как это возможно. Не титрования клеток, а в фермента. Пелле клеток путем spinniнг на 1000 мкг в течение 5 мин.
5. Аспирируйте мыть и повторно приостанавливать НПС в ~ 1 мл среды на NPC исходного лунку 6-луночного.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидайте, что сливной колодец блюдо 6-а имеет 5-10 миллионов клеток; Это может быть подтверждено путем подсчета 10L аликвоту клеток с использованием гематоцитометр до повторного покрытия.
6. После повторного приостановления, повторно пластины НПС в качестве NPC, нейронов или нейросферах. Для поддержания НПС, пластины приблизительно 1-2 миллионов клеток на лунку 6-луночного планшета. Эффективность формирования нейросфера может варьироваться в зависимости от экспериментов и клеточных линий, но обычно происходит лучше, если между 200000 и 1000000 клетки высевают на лунку в неприлипающими 6-луночный планшет; Если происходит слипание из нейросферах, уменьшить количество клеток, посеянных. Дифференцироваться в нейроны, плиты примерно 200 000 клеток на лунку 6-луночного планшета, замена NPC СМИ с нейронных СМИ.
7. Иммуногистохимически проверки каждый установленный NPC линии. После достаточно клеточный материал был ExpanDED, этикетка НПС с антителами для нестин и SOX2. Проверенная NPC линии также должны быть дифференцированы в нейроны в течение 4-6 недель, и помечены с антителами для III-тубулина и MAP2AB.
   1. Исправить клеток в 4% параформальдегид в PBS при 4 ° С в течение 10 мин. Проницаемыми НПС при комнатной температуре в течение 15 мин в 1,0% Triton в PBS, а затем блокируют в 5% осла сыворотки с 0,1% Тритона при комнатной температуре в течение 30 мин.
   2. Выдержите с первичным антителом в 5% осла сыворотки с 0,1% Triton, в течение ночи при 4 ° С.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем следующие антитела: козий анти-Sox2, 1: 200; мышиного антитела против человеческого Нестин, 1: 200; кролика против βIII-тубулина, 1: 500; мышиное анти-βIII-тубулина, 1: 500; мышиное анти-MAP2AB, 1: 200. (Рисунок 2).
   3. После промывки PBS, инкубировать вторичными антителами клетки с соответствующим сопряженного вторичного антитела к козьим, мыши или кролика в масштабе 1: 300, в в 5% осла сыворотки с 0,1% Triton в течение 1-2 ч при комнатной температуре. Для визуализации ядер, пятно клеток с 0,5 мкг / мл DAPI (4 '6-диамидино-2-фенилиндол), а затем установите с Vectashield.

4. NPC Трансдукция

1. Использование spinfection (центрифугирование клеточной культуры пластин в присутствии вируса в 1000 мкг в течение 1 часа), чтобы увеличить процент трансфицированных клеток ^21. Вытяжку СМИ и заменить соответствующей гиперэкспрессией (или управления) Лентивирусов (или ретровирусы), титровать до желаемого множественности заражения (МВД) (обычно 1-10), разведенного в NPC СМИ. Использование 1,5 мл объема на лунку 6-луночного планшета с (или соответствующим образом масштабированного объема для других типов тканей культуральных планшетах). Спин на 1000 мкг и 37 ° С в течение 1 ч в тарельчатой ​​центрифуге.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале, преобразовывать НПС лентивирусными или ретровирусных векторов в течение 1-2 дней расщепления. Ли с использованием коммерческих или лабораторно получают вирусы, это может быть полезно, чтобы надлежащим образом титр вируса партии заранее путем серийного разведения. (Рисунок 3).
2. Чтобы уменьшить КВЖДlular смерть, заменить средства массовой информации в течение 8 ч в spinfection.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вирусный интеграция и экспрессия трансгена должны быть обнаружены в пределах 24 часов по флуоресценции гена-репортера. (Если вирус не хватает флуоресцентный репортер, это более трудно оценить, успешно трансфекции может лучше быть подтверждено иммуноблот, иммуногистохимии или кПЦР сверхэкспрессию продуктов.) Полный выражение может занять 3-7 дней; повторные spinfections с дополнительным вируса может потребоваться, чтобы увеличить процент трансфицированных клеток. Периодические spinfections может произойти ежедневно, но не должно быть так часто. В идеале, если с помощью флуоресцентного репортер,> 80% клеток должны быть маркированы.

5. нейросфера Анализ миграции

Примечание: нейросферах форма спонтанно, после ферментативной диссоциации НПС (в форме идентичной той, которая используется в расширении NPC - шаги 3,3-3,6), если клетки культивируют в суспензии в NPC сред.

1. Короче говоря, расти отделитьD НПС в NPC СМИ за 48 ч в прилипших пластин в целях стимулирования нейросферы. (Рисунок 4).
2. Для нейросфера миграции, подготовить свежие матригель пластины с помощью холодных СМИ NPC, а не DMEM, в 96-луночного планшета, 1-2 ч до нейросфера сбора. Не аспирации Матригель из скважин.
3. Как первоначально опубликован для сотовых полученных нейросферах ²² эмбриональных стволовых вручную выбрать NPC-производные нейросферы под микроскопом, после промывки в NPC СМИ, чтобы удалить остатки клеток. Передача один нейросфера в каждую лунку в Матригель покрытием 96-луночного планшета.
4. Добавить дополнительный 0,5 мг Matrigel, разбавленный в холодных средах NPC, с нейросферах в каждом 96-луночном планшете.
5. Вручную центр каждого отдельного нейросфера в середине и с использованием наконечника пипетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы забрать нейросферы такого же размера, для того, чтобы уменьшить изменчивость в результатах поиска.
6. Разрешить миграция происходит в течение 48 часов, а затем исправить клетки WIth 4% параформальдегида и пятен с заданными иммуногистохимических маркеров.
7. Если радиальная миграция должна быть определена, их фотографии нейросферы в их полностью с помощью 4x объектива микроскопа. Исключить любые нейросферы контактирующих край скважины или второй нейросфера из анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если миграция происходит дольше, чем 48 часа, в результате радиального переноса, вероятно, будет слишком большим, чтобы изображение с помощью 4x цели.
8. Измерьте среднюю миграции из каждого нейросфера с помощью программного обеспечения NIH ImageJ (рисунок 5). Это может быть сделано с помощью одного из методов анализа, описанных ниже:
   1. Радиальная миграция:
      1. Вручную проследить край дальние миграции клеток с помощью инструмента выбора от руки, то использовать меру функцию (Ctrl + M), чтобы вычислить площадь полученной фигуры. Перед измерением область Убедитесь, что зона проверяется в окне Set Измерения найти на вкладке анализировать. ИспользуйтеЗначение измерения площади и уравнения для площади круга (= πr ^2), чтобы определить радиус (внешний).
      2. Трассировка край исходного нейросфера, измерить и рассчитать площадь радиус (внутренний) таким же образом. Рассчитать общую радиальную миграцию как разность между наружным и внутренним радиусами.
   2. Наибольшее клеточной миграции:
      1. Измерьте расстояние перемещается из пяти удаленных клеток от края внутренней нейросфера помощи функции выбора прямой линии, за которой следует Меры функции (Ctrl + M).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Нервные розетки могут быть идентифицированы морфологически, используя светлое микроскопа, по их характерному внешнему виду как круглые кластеров нейроэпителиальных клеток с апикально-базальной полярности (рис 1). Хотя персонажи, как правило, культивируют при очень высокой п?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Мы описали методы, с помощью которых дифференцировать hiPSCs в НПС, нейронная тип клеток, в которых значительная часть генов подписью hiPSC, полученных из нейронов сохраняется и может служить в качестве прокси-сервера для путей развития, потенциально способных к патогенезе заболевания ^{8, ...}

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Life Technologies	#11330	for HES media
DMEM/F12	Life Technologies	#10565	for neural media
KO-Serum Replacement	Life Technologies	#10828	Needs to be lot tested
Glutamax	Life Technologies	#35050
NEAA	Life Technologies	#11140
N2	Life Technologies	#17502-048	Needs to be lot tested
B27-RA	Life Technologies	#12587-010	Needs to be lot tested
FGF2	Life Technologies	#13256-029	Resuspend in PBS + 1% BSA
LDN193189	Stemgent	#04-0074
SB431542	Stemgent	#04-0010
BDNF	Peprotech	#450-02	Resuspend in PBS + 0.1% BSA
GDNF	Peprotech	#450-10	Resuspend in PBS + 0.1% BSA
Dibutyryl cyclic-AMP	Sigma	#D0627	Resuspend in PBS + 0.1% BSA
L-ascorbic acid	Sigma	#A0278	Resuspend in H20
STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent	Stemcell Technologies	#05832
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT-104
Collagenase IV	Life Technologies	#17104019
CF1 mEFs	Millipore	#PMEF-CF
Poly-L-Ornithine	Sigma	P3655
Laminin, Natural Mouse 1 mg	Life Technologies	#23017-015
BD Matrigel	BD	#354230	Resuspend on ice in cold DMEM at 10 mg/ml, use 1 mg per two 6-well plate equivalent
Tissue culture treated 6-well plates	Corning	3506
Ultra low attachment 6-well plates	Corning	3471
goat anti-Sox2	Santa Cruz	sc­17320	use at 1:200
mouse anti-human Nestin	Millipore	MAB5326	use at 1:200
rabbit anti-βIII-tubulin	Covance	PRB­435P	use at 1:500
mouse anti-βIII-tubulin	Covance	MMS­435P	use at 1:500
mouse anti-MAP2AB	Sigma	M1406	use at 1:200
Plate centrifuge	Beckman Coulter	Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier)