بسيط Multiwell تصلب الفحص لدراسة الردود خلية تصلب التي تعتمد على أساس بولي أكريلاميد

Summary

Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Abstract

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 – 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn’t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Introduction

معظم الأنسجة في الجسم هي المواد اللزجة لينة مع معامل يونج (أ) تتراوح من 0.1 كيلو باسكال لالدماغ إلى 100 ​​كيلو باسكال لالغضاريف لينة، وبعد، ويجري أكثر في أبحاث الخلايا المختبر على البوليسترين زراعة الأنسجة (TCP) التي لديها معامل ~ 1 جيغا ¹ عدم التطابق هذا صلابة يؤثر بشكل كبير على طريقة الخلايا تستجيب لبيئتها. وهناك مجموعة متزايدة من البحوث بالتالي مخصص لتوضيح تأثير الركيزة صلابة على مصير مختلف أنواع الخلايا، بما في ذلك ^2،3 الخلايا الجذعية. ⁴ ونتيجة لذلك، تم وضع الهلاميات المائية متعددة للمساعدة في فهم خلية تعتمد على صلابة علم الأحياء بما في ذلك بولي أكريلاميد (PA) ^و5-7 البولي ايثيلين جلايكول (PEG)، ^8،9 ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS)، ^{و 10} والجينات. ¹¹ في حين أن الأدلة التي الركيزة صلابة لديها تأثير كبير على مصير الخلايا ينمو، ويتم إجراء معظم الدراسات على نطاق ضيق مع عدد صغير من الصورةamples. منهجية، ودراسات متعددة الأبعاد على تأثير الركيزة صلابة لمجموعة من أنواع الخلايا أو الظروف البيئية نادرة. ¹²

وقد تم تطوير العديد من التقنيات هيدروجيل عالية الإنتاجية الواعدة، بما في ذلك ميكروأرس تستند PEG، ¹³ ميكروفلويديك الأجهزة لإنتاج ميكروبيدات الاغاروز هيدروجيل، ¹⁴ أو الجزئي والنانو قضبان حيث التضمين صلابة من قبل قطر والارتفاع من microrods. ¹⁵ ولكن وتكنولوجيات إعداد مثل هذه ركائز هي متطورة والمتاحة لعدد محدود من المختبرات. الكثير من البحوث التي تنطوي على صلابة التضمين استجابات الخلايا يستخدم بولي أكريلاميد (PA) المواد الهلامية التي ليست فقط غير مكلفة وبسيطة لتنفيذ، ولكن أيضا يحمل مجموعة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية من معامل يونج، وهي 0.3 - 300 كيلو باسكال ^16-22 ومع ذلك، الأساليب القائمة لافتعال PA المواد الهلامية للثقافة الخلية هي كثيفة العمالة وبالتالي الإعداديةعرب كورب في دفعات صغيرة. بعض الصعوبات المرتبطة إعداد المواد الهلامية السلطة الفلسطينية بمثابة ركائز الخلايا الجذعية من شرط أن المواد الهلامية يجب أن يكون مستعدا: 1) في غياب الأكسجين للسماح البلمرة كاملة، 2) مع سطح مستو وناعم للسماح خلية موحدة المرفقات ونشر، و3) الملصقة بشكل دائم إلى أسفل الطبق الثقافة الخلية لمنع العائمة.

وقد حاولت عدة مجموعات لإنتاج المواد الهلامية السلطة الفلسطينية لزراعة الخلايا على دفعات كبيرة. زملر وآخرون أوراق سميكة مستعدة من المواد الهلامية السلطة الفلسطينية التي كانت ثم "قطع" مع لكمة ثقب وضعها في لوحات 96-جيدا. ²³ ومع ذلك، هذا الأسلوب يقتصر على المواد الهلامية أشد، أي> 1 كيلو باسكال في معامل يونج، ليونة المواد الهلامية هي "لزجة"، من الصعب قطع، وتلف بسهولة. MIH وآخرون بتطوير تقنية أكثر تطورا والذي يسمح المواد الهلامية ليتم بلمرة مباشرة في لوحة من الزجاج السفلي multiwell. 6 وقد تحقق ذلك عن طريق سكب الحلول هلام في لوحات من الزجاج السفلي بين functionalized وتشكيل المواد الهلامية التي كتبها "يقحم" لهم مع مجموعة ساترة مخصصة. ^و6 على الرغم من واعدة جدا، والآثار تفوق طفيف لا يزال لوحظ مع هذه التقنية. بالإضافة إلى ذلك، تتطلب هذه التقنية مجموعة مصمم خصيصا لا يمكن الوصول إليها على الفور إلى العديد من المختبرات وكذلك من الزجاج السفلي مكلفة لوحات multiwell.

وتصف هذه الورقة طريقة بسيطة وغير مكلفة لتجميع المواد الهلامية للسلطة الفلسطينية في لوحة multiwell التي يمكن اعتمادها بسهولة من قبل أي مختبر. هنا، ويستخدم على الدعم من البلاستيك المرن الذي له وجهان - واحد مسعور، وهو طارد للالهلام السلطة الفلسطينية، واحد ماء، الذي يربط تساهميا هلام السلطة الفلسطينية على الترسيب. مرة واحدة يتم إيداع أوراق هلام السلطة الفلسطينية وبشكل دائم الملصقة على الدعم من البلاستيك المرن، فإنه يمكن التعامل مع المواد الهلامية من أي سمك أو تصلب وقطع لهم في أي شكل المطلوب. هذا approach تنتج ليس فقط مخصصة "coverslips" بلاستيكية بأحجام لا خلاف المتاحة تجاريا، ولكن أيضا يغني عن ضرورة إلى ما قبل علاج الواجهات الزجاجية، إما coverslips الزجاج أو الآبار من الزجاج السفلي مكلفة لوحات multiwell، مع حل السلطة الفلسطينية ملزم، وهو ومملة وخطوة تستغرق وقتا طويلا. وأخيرا، وصحائف والمواد الهلامية PA موحدة يمكن أن تكون على استعداد في دفعات كبيرة وتخزينها دي رطب لعدة أشهر.

وباختصار، فإن فحص المقدمة هنا هو تحسنا الطرق القائمة في عدة جوانب. أولا، عملية لوحة التجمع multiwell هي كفاءة، والتكلفة الإجمالية للمواد المطلوبة منخفضة. ثانيا، يتم إنتاج الهلاميات المائية في دفعات كبيرة في فيلم هلام متجانس واحد. وأخيرا، يطلب من المواد فقط التي هي متاحة تجاريا. وتتجلى فائدة الفحص من خلال استكشاف تأثير الركيزة صلابة على مورفولوجيا الخلايا ونشر المنطقة.

Protocol

1. إعداد الحلول ومأخوذة هيدروجيل المصاحب

1. إعداد الحل بولي أكريلاميد هلام السلائف.
   1. إعداد بولي أكريلاميد حل هلام السلائف عن طريق خلط مادة الأكريلاميد (A) (40٪ ث / ت، M _ص 71.08 جم / مول)، وbisacrylamide crosslinker (B) (2٪ ث / ت، _ص M 154.17 جم / مول)، واجتثاث الماء المؤين في نسب حجم المحددة في الجدول 1.
      ملاحظة: هذه الحلول يمكن إعداد في دفعات كبيرة وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى عدة أشهر.
      1. تنبيه: الأكريلاميد سامة عند استنشاق أو ابتلاع، ولا سيما عندما تكون في شكل مسحوق: وهكذا، ويفضل استخدام 40٪ ث / ت حل للحد من مخاطر سمية. التعامل فقط في حين يرتدي ملابس واقية، مثل القفازات، ونظارات واقية، ومعطف المختبر. متجر في، حاوية مغلقة بإحكام مقاومة للضوء في الثلاجة (<23 ° C، منطقة جيدة التهوية).
      2. تنبيه: مكرر الأكريلاميد السامة على استنشاق أو ابتلاع، بشكل خاص،عندما تكون في شكل مسحوق: وهكذا، ويفضل استخدام 2٪ ث / ت حل للحد من مخاطر سمية. التعامل فقط في حين يرتدي ملابس واقية، مثل القفازات، ونظارات واقية، ومعطف المختبر. متجر في، حاوية مغلقة بإحكام مقاومة للضوء في الثلاجة (<4 ° C، منطقة جيدة التهوية).
2. إعداد واستخدام N -Sulfosuccinimidyl-6- (4'-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoate (سلفو-SANPAH، M _ص 492.40 جم / مول) مأخوذة. تنبيه: سلفو-SANPAH يسبب تهيج العين الشديد؛ التعامل مع قفازات والعين السليمة أو حماية الوجه. تخزينها في -20 ° C عند استلام وقبل aliquoting.
   1. لتخزين سلفو-SANPAH: حل سلفو-SANPAH في dimethylsulfoxane (DMSO) في 50 ملغ / مل. قسامة الحل الأسهم إلى 50 أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 20 ميكرولتر في الأنبوب. تجميد فلاش على الثلج الجاف أو في النيتروجين السائل (خطوة اختيارية لكنه فضل الحفاظ على أقصى قدر من الكفاءة crosslinker) وتخزينها في -80 ° C.
      ملاحظة: مأخوذة كاليفورنيان خزنها لعدة أشهر.
   2. لاستخدام سلفو-SANPAH: ذوبان الجليد في قسامة لفترة وجيزة وتمييع في 480 ميكرولتر من دي المتأينة المياه. استخدامها على الفور. سلفو-SANPAH hydrolyzes بسرعة في الماء: ولذا أخذ الحيطة والحذر على أداء جميع الخطوات المذكورة أعلاه بسرعة.
3. إعداد فوق كبريتات الأمونيوم (M _ص 228.18 جم / مول) مأخوذة.
   ملاحظة: فوق كبريتات الأمونيوم تسبب العين والجلد وتهيج في الجهاز التنفسي. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند التعامل مع. التعامل مع مسحوق فوق كبريتات الأمونيوم في غطاء الدخان الكيميائية. مسحوق تخزينها في مكان جاف وجيد التهوية. مرة واحدة aliquoted، يمكن استخدام محلول مخفف على مقاعد البدلاء العمل.
   1. حل بيرسلفات الأمونيوم في الماء منزوع الأيونات لتحقيق النهائي تركيز فوق كبريتات الأمونيوم 10٪ ث / ت. قسامة وتخزينها في -20 ° C. ذوبان الجليد مباشرة قبل الاستعمال.
4. إعداد الكولاجين النوع الأول حل.
   1. إعداد 0.2 ملغ / مل حل الكولاجين عن طريق تمييع السهم حتىlution في الفوسفات 1X مخزنة المالحة (PBS) الرقم الهيدروجيني 7.4. تخزين على الجليد لفترة وجيزة أو استخدام فور التخفيف.

2. هيدروجيل إعداد (راجع الشكل 1)

1. إعداد الشرائح الزجاجية مسعور.
   1. ضع بضع قطرات من محلول مسعور على طبق من الزجاج واستخدام المناديل الورقية لنشر عبر السطح. السماح الهواء الجاف ويمسح بقطعة المناديل الورقية مرة أخرى على استقامة طلاء مسعور.
      ملاحظة: مخزن حل مسعور في خزانة قابلة للاشتعال في RT. ارتداء معدات الوقاية الشخصية عند التعامل مع. العمل في منطقة جيدة التهوية.
2. إعداد دعم بلاستيكية مرنة.
   1. خفض الدعم بلاستيكية مرنة لتتناسب مع حجم لوحة من الزجاج مسعور المغلفة.
   2. بمناسبة الجانب مسعور من الدعم من البلاستيك المرن من الخدش طفيفة السطح مع أداة حادة مثل مشرط.
      ملاحظة: مرة واحدة في هلام - التي تكون شفافة تماما - يجف، فإن علامات خدش تساعد التمييز الذي يحتوي على مرونة الجانب دعم البلاستيك هلام.
      ملاحظة: الدعم من البلاستيك المرن لديه مسعور والجانب ماء. مرة واحدة المودعة، بولي أكريلاميد تلتزم بشكل دائم إلى الجانب ماء من الدعم من البلاستيك مما يسهل سهولة التعامل هيدروجيل لاحق.
3. تحضير هلام (يتم إعطاء كميات سبيل المثال لمدة 5 مل حلول هلام السلائف).
   ملاحظة: سوف 5 مل تكون كافية لإنتاج المواد الهلامية ~ 40 عندما هلام سمك الأولي هو 0.5 ملم. يمكن أن تنتج عن المواد الهلامية إذا تم تخفيض سمك هلام.
   1. وضع 4972.5 ميكرولتر من حل السلائف بولكرلميد من المطلوب التركيز النهائي (الجدول 1) إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. وضع في غرفة التفريغ لمدة 30 دقيقة مع غطاء فتحه.
      ملاحظة: أعمال الأكسجين كما فخ الجذور الحرة وعندما تكون موجودة، فإنه يمنع البلمرة.
   2. إضافة 25 ميكرولتر من 10٪ ث / ت فوق كبريتات الأمونيوم (يرجى الرجوع إلى نقطة 1.3) لتحقيق نهائيالأمونيوم تركيز بيرسلفات من 0.05٪.
   3. إضافة 2.5 ميكرولتر من N، N، N '، tetramethylethylenediamine N'- (TEMED، M _ص 116.24 جم / مول) في حل هلام نزع الغاز لتحقيق تركيز TEMED النهائي من 0.5٪.
      ملاحظة: مخزن TEMED في خزانة قابلة للاشتعال في RT. التعامل في غطاء الدخان الكيميائية عند ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة. تبقي مغلقة بإحكام تحت غاز خامل، كما هو درجة عالية من الهواء والرطوبة الحساسة.
   4. مزيج الحل بلطف بواسطة pipetting صعودا وهبوطا 3-5 مرات. لا دوامة لتجنب انتشار الأوكسجين في حل هلام السلائف.
   5. ماصة الحل الهلام على الجانب ماء من الدعم من البلاستيك المرن وساندويتش مع مسعور المغلفة شريحة زجاجية. فصل الشرائح مع اثنين من الفواصل السيليكون من سمك المطلوب (على سبيل المثال، 0.5 ملم). ترك كمية صغيرة (~ 100 ميكرولتر) من الحل البوليمر السلائف في 50 مل أنبوب مخروطي لاستخدام كمؤشر على دبق.
      ملاحظة:ويمكن استخدام أي فاصل. على سبيل المثال، وهو شريط واحد من بارافيلم يعطي سماكة هلام تورم النهائي من 100-120 ميكرون.
   6. وضع لوحة زجاجية أخرى فوق مرونة البلاستيك دعم / هلام شطيرة للتأكد من سطح حتى هيدروجيل على البلمرة.
   7. السماح للهلام تتبلمر لمدة 45 دقيقة، على الرغم من أن أقل وقت يمكن أن تستخدم في المواد الهلامية من أعلى٪ بالوزن اذا شئت. للتأكد من أن الجل وبلمرة، ومراقبة الحل المتبقية في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. إذا كان قد تبلور الحل المتبقية، فمن المرجح أن دبق على لوحة من الزجاج وقد بدأت كذلك. ومع ذلك، لاحظ أن افتتاح سابق لأوانه من العفن سيمنع البلمرة كاملة.
   8. مرة واحدة يتم تشكيل هلام، تقشر دعم البلاستيك المرن مع هلام بولي أكريلاميد المرفقة تساهميا على القمة، ووضع جل جنبا إلى الهواء الجاف.
      ملاحظة: يمكن أيضا الحراري أو التجفيف بالحرارة استخدامها لتسريع هذه الخطوة. جفت مرة واحدة على الدعم من البلاستيك المرن، يمكن أن يكون جل متجرد إلى أجل غير مسمى.
      1. بمناسبة أي بقع عارية من الدعم بلاستيكية مرنة، حيث المواد الهلامية بولي أكريلاميد لم تشكل بسبب الفقاعات. علامة في حين أن جل ما زال رطب حيث سيؤدي ذلك إلى مزيج بدعم البلاستيك المرن مرة واحدة هلام جاف.

3. Multiwell الجمعية اللوحة، طلاء الكولاجين، والتعقيم

1. التجمع لوحة Multiwell.
   1. جفت مرة واحدة، وقطع المواد الهلامية السلطة الفلسطينية إلى الأشكال المطلوبة.
      1. لوحة 96-جيدا، واستخدام الثقيلة لكمة ثقب بقطر ~ 6 ملم. استخدام ورقة القاطع الثقيلة لخفض المواد الهلامية إلى أشكال مربعة أو مستطيلة. بدلا من ذلك، استخدم المقص.
   2. إعداد ما يقرب من 500 ميكرولتر من PDMS في لوحة 96-جيدا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. لالغراء المواد الهلامية إلى الجزء السفلي من لوحة multiwell، ضع قطرات صغيرة (~ 5 ميكرولتر) من ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) في وسط كل بئر. باستخدام ملقط، ضع polyacrylamid واحدهلام الإلكترونية في كل البلاستيك جيدا ومرنة دعم الجانب السلبي. للسماح PDMS لعلاج، وترك لوحة تجميعها عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعات.
2. الكولاجين طلاء المواد الهلامية بولي أكريلاميد.
   1. مع ماصة نقل، ضع كمية صغيرة (7-8 ميكرولتر) من سلفو-SANPAH (يرجى الرجوع إلى نقطة 1.2.2) في كل بئر ودوامة من جانب إلى آخر لمعطف سطح هلام بالتساوي. العمل على وجه السرعة منذ سلفو-SANPAH ليست مستقرة في الماء.
   2. وضع لوحة بشكل جيد في ظل كثافة عالية مصباح الأشعة فوق البنفسجية (كثافة = 37 ميغاواط، λ = 302-365 نانومتر) لمدة 5 دقائق. شطف المواد الهلامية مع برنامج تلفزيوني لإزالة الزائد سلفو-SANPAH.
   3. ماصة 50 ميكرولتر من 0.2 ملغ / مل الكولاجين النوع الأول حل (يرجى الرجوع إلى نقطة 1.4) في كل بئر. ترك لوحة تغطيتها على RT لمدة 2 ساعة على الأقل أو O / N عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: لتسريع عملية الكولاجين الطلاء، وماصة نقل يمكن استخدامها لإضافة محلول الكولاجين. عادة، 1 - 2 ينبغي قطرات من محلول تكون كافية لإكماللاي تغطية سطح هلام.
   4. ترك لوحة جيدا في RT لمدة 2 ساعة على الأقل للسماح الكولاجين الترابط.
   5. شطف مع برنامج تلفزيوني لإزالة حل الكولاجين الزائد وتعقيم تحت الأشعة فوق البنفسجية (λ = 200 نانومتر) في الثقافة غطاء محرك السيارة الأنسجة لمدة 2 ساعة.
   6. نقع المواد الهلامية في المتوسط ​​كاملة (راجع القسم 4.1 لتكوين المتوسط) O / N لترطيب وتتوازن. استخدام للخلية البذر مباشرة أو تخزينها في الثلاجة لمدة تصل إلى 2 أيام.

4. البذر الخلية على السلطة الفلسطينية تصلب الفحص

ملاحظة: على الرغم نموذجية للخطوط الخلايا الثديية مشتركة، يتم استخدام بروتوكول المبينة في هذا القسم تحديدا مع سرطان الثدي خط الخلية MDA-MB-231 (انظر الأرقام 4 و 5).

1. جمع الخلايا من نسيج الثقافة قارورة عن التعرض إلى 5٪ التربسين / EDTA لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. استخدام ~ 80 ميكرولتر من التربسين / EDTA لكل سم ² من منطقة قارورة الثقافة. على سبيل المثال، استخدام 2 مل من التربسين / EDTA FOرا T25 زراعة الخلايا القارورة. اعادة تعليق الخلايا التي تم جمعها في المتوسطة كاملة تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين في تركيز الخلية النهائي المطلوب. مع الأخذ بعين الاعتبار خلية مضاعفة الوقت وكذلك طول الفترة الزمنية سيتم المصنف الخلايا على الفحص، واختيار التركيز المناسب خلية فرعية متموجة. ضمان المتوسطة أضاف يكفي لغمر تماما الهلاميات المائية.
   ملاحظة: منذ الهلاميات المائية تم قبل معايرتها في وسائل الإعلام (راجع الخطوة 3.2.6) 100 حجم ميكرولتر يجب أن تكون كافية. يجب أن أحجام المتوسطة المعتادة المستخدمة في لوحات multiwell تكون كافية منذ المواد الهلامية تم قبل معايرتها في وسائل الإعلام في الخطوة السابقة.
   ملاحظة: إن الفحص تكون مناسبة لأي نوع من الخلايا التي تعتمد على المرفق.
   1. عد عدد الخلايا تحت مجهر مقلوب باستخدام عدادة الكريات. تحميل 10 ميكرولتر من تعليق خلية في كل ميناء عدادة الكريات ومتوسط ​​عدد خلايا من لا يقل عن 8 أجزاء. للحصول علىتركيز الخلية النهائي، مضاعفة عدد خلايا بنسبة 10 ^4.
      ملاحظة: يتم الحصول على أفضل النتائج عدد خلايا عند عدد الخلايا في كل رباعي عدادة الكريات هو 20-50.
2. ثقافة الخلايا على صلابة فحص PA في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية وCO ₂ 5٪. تغيير وسائل الاعلام كل 2 - 3 أيام. جمع الخلايا عند الحاجة عن طريق التعرض إلى 5٪ التربسين / EDTA عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. استخدام ~ 80 ميكرولتر من التربسين / EDTA لكل سم ² من زراعة الأنسجة قارورة. خلال جميع الخطوات التلاعب خلية، ورعاية خاصة لا لتعطيل سطح هيدروجيل: نضح أو ماصة المتوسطة التي كتبها البقشيش قليلا لوحة multiwell جانبية ولمس طرف ماصة على الجدار الجانبي من كل بئر، خلافا للمس هيدروجيل.
   ملاحظة: باستثناء لرعاية خاصة لا تتلف سطح هيدروجيل خلال معيار التعامل زراعة الأنسجة، المصنفة الخلايا على فحص صلابة يمكن التلاعب بها بنفس الطريقة كما لو كانت المصنفة علىإلى لوحة multiwell العادية.

5. التصوير من خلايا المصنف على السلطة الفلسطينية تصلب الفحص

1. خلايا صورة مباشرة على صلابة مقايسة السلطة الفلسطينية.
   ملاحظة: أي المجهر - مقلوب، الفلورسنت، أو متحد البؤر، ويمكن استخدامها لتصوير الخلية.
   ملاحظة: الدعم من البلاستيك المرن المستخدمة لبناء فحص صلابة شفافة تماما ولا autofluoresce أو تتداخل مع التصوير الخلية. ومع ذلك، على الرغم من أن الدعم من البلاستيك المرن في حد ذاته هو شفاف وقدرات التصوير سوف تكون محدودة بسبب المسافة عمل الهدف. الدعم البلاستيكية مرن يحتوي على سمك 0.23 مم والمسافة العمل نموذجية من هدف 10X هو ~ 4 مم، وخفض حاد لتكبير أعلى.
   1. لتصوير الخلايا الحية، موقف السلطة الفلسطينية تصلب فحص في حامل لوحة المجهر والصورة. إبقاء جلسات التصوير تحت 2 ساعة، أو استخدام المجهر مجهزة غرفة البيئية لأوقات التصوير أطول.
   2. عندما يعيش ايم خليةالشيخوخة ليست الهدف، وتحديد الخلايا في 4٪ محلول الفورمالديهايد تستكمل مع 0.1٪ المنظفات. نقع الخلايا في تثبيتي في RT مدة لا تقل عن 2 ساعة. شطف مع PBS مرتين. تجاهل تثبيتي النفايات في حاوية النفايات المعينة.
      ملاحظة: خلايا يمكن تصوير فورا أو تخزينها المغمورة في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لمدة تصل الى 2 أسابيع. تنبيه: الفورمالديهايد سامة عند استنشاق والاتصال. التعامل مع القفازات في غطاء الدخان الكيميائية.
      ملاحظة: خلية بروتوكول تثبيت لابد من اختياره بناء على تلطيخ الخلايا والتعامل مع البروتوكولات اللاحقة، لأن بعض مثبتات تلف بعض البروتينات الخلية.
   3. للتصوير الفلورسنت، وصمة عار الخلايا مع المطلوب وصمة عار الخلايا مباشرة في لوحة multiwell الثابتة. الصورة فورا.

النتائج

وتستخدم بولي أكريلاميد (PA) الهلاميات المائية على نطاق واسع لاختبار استجابات الخلايا التي تعتمد على صلابة. ^17،24 بواسطة خلط تركيزات مختلفة من مادة الأكريلاميد (A) ومكرر الأكريلاميد (B) واحد يمكن أن تجعل المواد الهلامية السلطة الفلسطينية التي تغطي مجموعة وتصلب الأن?...

Discussion

المواد الهلامية بولي أكريلاميد، وضعت أصلا لالكهربي، ²⁸ تستخدم الآن بشكل روتيني بمثابة ركائز ثقافة الخلية لدراسة آثار الركيزة صلابة على مورفولوجيا الخلايا، حركية، والاتصالات ^3،24،29 بين خصائص الخلايا الأخرى. بولي أكريلاميد يسمح التلاعب الركيزة صلابة ليشم?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
40% Acrylamide	Bio-Rad	161-0140
2% Bis-acrylamide	Bio-Rad	161-0142
Ammonium Persulfate	Bio-Rad	161-07000
TEMED	Sigma Aldrich	T9281
Sulfo-SANPAH	Thermo Scientific	22589
Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/ml	BD Biosciences	354236
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100
Hydrophobic solution — Repel Silane	GE Healthcare Bio-Sciences	17-1332-01
PBS (1x), pH 7.4	HyClone	SH30256.01
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit]	Elsworth Adhesives	3097358-1004
Tyrpsin/EDTA (10x)	Sigma Aldrich	44174
RPMI-1640 Medium (1x)	HyClone	SH30027-02
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30073-03
Penicillin Streptomycin	MP Biomedicals	1670046
Detergent: Triton-X	Sigma Aldrich	T8787
Formaldehyde 37% Solution	Sigma Aldrich	F1635
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A2153
BSA-based cell adhesion blocking kit — ECM Cell Adhesion Array Kit	Chemicon International	ECM540
Disposable lab equipment
flexible plastic support — GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels	GE Healthcare Bio-Sciences	309819
Glass Plates	Slumpys	GBS4100SFSL
50 ml conical tubes	Fisher Scientific	3181345107
15 ml conicals tubes	FALCON	352097
Micro centrifuge tubes	Fisher Scientific	2 ml: 02681258
96-well plate (flat bottom)	Fisher Scientific	12565501
Disposable Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml)	Fisher Scientific	1 ml: 13-678-11B, 2 ml: 05214038, 5 ml (FALCON): 357529, 10 ml: 13-678-11E, 25 ml: 13-678-11, 50 ml: 13-678-11F
Glass Transfer Pipettes	Fisher Scientific	5 3/4": 1367820A, 9":136786B
Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl)	Fisher Scientific	2707509
Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes	Fisher Scientific	13-711-9D
Parafilm	PARAFILM	PM992
Powder Free Examination Gloves	Quest	92897
Silicone spacers — Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm	Grace Bio-Labs	JTR-S-0.5
Large/non-disposable lab equipment
Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M)	Zeiss	3820005619
Microscope Software	Zeiss	AxioVision Rel. 4.8.2
UV oven	UVITRON	UV1080
Vacuum chamber/degasser	BelArt	999320237
Vacuum pump for degasser	KNF Lab	5097482
Tissue Culture Hood	NUAIRE	NU-425-600
Chemical Fume Hood	KEWAUNEE	99151
Inverted Microscope (Axiovert 25)	Zeiss	663526
Incubator	NUAIRE	NU-8500
Pipette Aid	Drummond Scientific Co.	P-76864
Hemacytometer	Bright-Line	383684