Multiwell Rigidité Essai pour l'étude des réponses cellulaires Rigidité-dépendantes simple à base de polyacrylamide

Résumé

Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Résumé

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 – 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn’t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Introduction

La plupart des tissus dans le corps sont des matériaux visco-élastiques souples avec un module d'Young allant de 0,1 kPa pour le cerveau de 100 kPa pour cartilage souple, encore, la plupart de la recherche sur les cellules in vitro est réalisée sur du polystyrène pour culture de tissus (TCP) qui a un module d'environ 1 GPa . ¹ Ce décalage de rigidité affecte grandement la façon dont les cellules répondent à leur environnement. Un nombre croissant d'études est ainsi dédiée à élucider l'effet de la rigidité du substrat sur ​​le sort de divers types de cellules, ^{le 2,3} y compris des cellules souches. ⁴ En conséquence, plusieurs hydrogels ont été développés pour aider à la compréhension de la cellule de rigidité dépendante biologie, y compris polyacrylamide (PA), ^5-7 polyéthylène glycol (PEG), ^8,9 (PDMS), ¹⁰ et ¹¹ alginate. Bien que la preuve que la rigidité du substrat a un impact considérable sur le sort de la cellule est de plus en plus, la plupart des études sont menées sur une petite échelle avec un petit nombre de sexemples. Systématiques, études multidimensionnelles sur l'effet de la rigidité de substrat pour un éventail de types de cellules ou les conditions environnementales sont rares. ¹²

Plusieurs technologies d'hydrogel à haut débit prometteuses ont été développées, y compris les microréseaux à base de PEG, ¹³ des dispositifs microfluidiques pour la production de microbilles d'agarose d'hydrogel, ¹⁴ ou des micro et nano-tiges où la rigidité est modulée par le diamètre et la hauteur des microrods. ¹⁵ Cependant , les technologies de préparer ces substrats sont sophistiqués et disponibles pour nombre limité de laboratoires. Beaucoup de recherches impliquant rigidité modulée réponses cellulaires utilise polyacrylamide (AP) gels qui ne sont pas seulement bon marché et simple à mettre en œuvre, mais présentent également une gamme physiologiquement pertinente de module de Young, à savoir 0,3 -. 300 kPa ^16-22 Cependant, les méthodes existantes pour fabriquer PA gels pour la culture cellulaire sont de main-d'œuvre et par conséquent prepARED en petits lots. Certaines des difficultés liées à la préparation de gels PA comme substrats de cellules souches de l'exigence que les gels doivent être préparé: 1) en l'absence d'oxygène pour permettre la polymérisation complète, 2) avec une surface plane et lisse pour permettre cellulaire uniforme l'attachement et la propagation, et 3) fixée en permanence au fond de la boîte de culture cellulaire pour empêcher flottante.

Plusieurs groupes ont tenté de produire des gels PA pour la culture cellulaire en grandes séries. Semler et al. Les feuilles épaisses préparées de gels PA qui ont ensuite été "coupée" avec une perforatrice et placés dans des plaques à 96 puits. ²³ Cependant, cette méthode est limitée à des gels sévères, ce est à dire,> 1 kPa dans le module de Young, parce que plus doux gels sont "collante", difficile à couper, et facilement endommagé. Mih et al. A développé une technique plus sophistiquée qui permet aux gels d'être directement polymérisés dans une plaque à puits multiples à fond de verre. 6 Ceci a été réalisé en versant les solutions de gel dans des plaques à fond de verre fonctionnalisés et former des gels par «sandwich» avec une gamme de lamelle personnalisé. ⁶ même si de légers effets très prometteurs, bord étaient encore observés avec cette technique. De plus, la technique nécessite un réseau conçu sur mesure pas immédiatement accessible à de nombreux laboratoires ainsi que des plaques à puits multiples à fond de verre coûteuses.

Cet article décrit un moyen simple et peu coûteux à assembler gels PA dans une plaque multi-puits qui pourrait être facilement adoptée par ne importe quel laboratoire. Ici, un support plastique flexible est utilisé, qui a deux côtés - un une hydrophobe, qui est répulsif pour gels PA, et un une hydrophile, qui se lie de manière covalente le gel PA lors du dépôt. Une fois les feuilles de gel PA sont déposés et permanente apposée sur le support plastique flexible, il permet une manipulation des gels de toute épaisseur ou la rigidité et les couper en toute forme souhaitée. Cette apprOach produit non seulement personnalisés "lamelles" en plastique de tailles pas autrement disponibles dans le commerce, mais évite également la nécessité de surfaces de verre-prétraiter, soit des lamelles de verre ou les puits de plaques à puits multiples à fond de verre coûteuses, avec une solution de liaison PA, qui est un fastidieux et une étape de temps. Enfin, feuilles de gels uniformes PA peuvent être préparés en grandes séries et stockés de-hydraté pendant plusieurs mois.

En résumé, l'analyse présentée ici est une amélioration par rapport aux méthodes existantes dans plusieurs aspects. Premièrement, le processus de montage de la plaque à puits multiples est efficace, et le coût total des matériaux requis est faible. Deuxièmement, les hydrogels sont produites en grandes quantités dans un film de gel homogène unique. Enfin, seuls des matériaux qui sont disponibles dans le commerce sont tenus. L'utilité de l'essai est illustré par la découverte de l'effet de la rigidité du substrat sur la morphologie cellulaire et la zone d'étalement.

Protocole

1. Préparation des solutions et des aliquotes hydrogel associés

1. Préparation de la solution de précurseur de gel de polyacrylamide.
   1. Préparer la solution de précurseur de gel de Polyacrylamide en mélangeant acrylamide (A) (40% p / v, _M 71,08 g / mol), le bisacrylamide de réticulation (B) (2% p / v, _M 154,17 g / mol), et dé- de l'eau ionisée dans les pourcentages en volume indiquées au tableau 1.
      REMARQUE: Ces solutions peuvent être préparés en grandes séries et stockées à 4 ° C pendant plusieurs mois.
      1. ATTENTION: L'acrylamide est toxique par inhalation ou ingestion, en particulier, lorsqu'il est sous forme de poudre: ainsi, utiliser de préférence de 40% w solution / v pour réduire les risques de toxicité. Manipuler seulement en portant des vêtements de protection, comme des gants, des lunettes et une blouse de laboratoire. Stocker dans un récipient résistant à la lumière, bien fermé dans le réfrigérateur (<23 ° C, une zone bien ventilée).
      2. ATTENTION: Bis-acrylamide est toxique en cas d'inhalation ou d'ingestion, en particulier,lorsqu'elle est sous forme de poudre: ainsi, utiliser de préférence de 2% w solution / v pour réduire les risques de toxicité. Manipuler seulement en portant des vêtements de protection, comme des gants, des lunettes et une blouse de laboratoire. Stocker dans un récipient résistant à la lumière, bien fermé dans le réfrigérateur (<4 ° C de la zone, bien ventilé).
2. La préparation et l'utilisation de N -Sulfosuccinimidyl-6- (4'-azido-2'-nitrophénylamino) hexanoate (Sulfo-SANPAH, _M 492,40 g / mol) des parties aliquotes. ATTENTION: Sulfo-SANPAH provoque une irritation des yeux; Manipuler avec des gants et des lunettes bon ou de protection du visage. Conserver à -20 ° C dès réception et avant aliquotage.
   1. Pour stocker sulfo-SANPAH: dissoudre Sulfo-SANPAH dans dimethylsulfoxane (DMSO) à 50 mg / ml. Aliquoter la solution de stock en 50 micro-tubes de centrifugeuse de 20 pi par tube. Un gel rapide sur la glace sèche ou dans l'azote liquide (une étape facultative mais préférée pour préserver l'efficacité de réticulation maximum) et conserver à -80 ° C.
      REMARQUE: Les aliquotes can être stockés pendant plusieurs mois.
   2. Pour utiliser sulfo-SANPAH: décongeler brièvement aliquote et diluer dans 480 pi d'eau désionisée. Utiliser immédiatement. Sulfo-SANPAH hydrolyse rapidement dans l'eau: donc prendre la prudence se acquitter de toutes les étapes ci-dessus rapidement.
3. Préparation de persulfate d'ammonium (M _r 228,18 g / mol) des parties aliquotes.
   REMARQUE: persulfate d'ammonium provoque yeux, la peau et les voies respiratoires. Porter un équipement de protection individuelle approprié lors de la manipulation. Manipulez la poudre de persulfate d'ammonium dans une hotte chimique. Conserver la poudre dans un endroit sec, bien ventilé. Une fois aliquotes, la solution diluée peut être utilisé sur la table de travail.
   1. Dissoudre le persulfate d'ammonium dans de l'eau désionisée pour obtenir une concentration finale de persulfate d'ammonium à 10% p / v. Aliquoter et conserver à -20 ° C. Décongeler immédiatement avant l'utilisation.
4. Préparation de la solution de collagène de type I.
   1. Préparer 0,2 mg / ml solution collagène par dilution de la sorte1x lution dans du tampon phosphate salin (PBS) de pH 7,4. Stocker brièvement de glace ou utiliser immédiatement après dilution.

2. Préparation d'hydrogel (Voir Figure 1)

1. Préparation des lames de verre hydrophobes.
   1. Placez quelques gouttes d'une solution hydrophobe sur une plaque de verre et d'utiliser du papier de soie se propager à travers la surface. Laissez sécher à l'air et essuyer de nouveau avec un mouchoir en papier pour égaliser le revêtement hydrophobe.
      REMARQUE: solution hydrophobe magasin dans une armoire inflammable à RT. Porter un équipement de protection individuelle lors de la manipulation. Travailler dans un endroit bien ventilé.
2. Préparation du support en matière plastique souple.
   1. Couper le support plastique flexible pour correspondre à la taille de la plaque de verre à revêtement hydrophobe.
   2. Marquer le côté hydrophobe du support plastique flexible en grattant légèrement la surface avec un outil pointu comme un scalpel.
      NOTE: Une fois que le gel - qui est totalement transparent - sèche, Les rayures seront aider à distinguer de quel côté de support souple en plastique contient du gel.
      REMARQUE: Le support plastique flexible a une hydrophobe et un côté hydrophile. Une fois déposé, le polyacrylamide adhère de façon permanente sur le côté hydrophile du support plastique qui facilite la manipulation d'hydrogel ultérieure facile.
3. Préparation de gel (par exemple les volumes sont donnés pour des solutions de précurseur de gel de 5 ml).
   NOTE: 5 ml seraient suffisants pour produire ~ 40 gels lorsque le gel épaisseur initiale est de 0,5 mm. Plus gels peuvent être produits si l'épaisseur du gel est réduite.
   1. Passer 4972,5 ul de solution de précurseur de polyacrylamide concentration finale désirée (tableau 1) dans un tube conique de 50 ml. Placez dans une chambre de dégazage pendant 30 min avec le couvercle ouvert.
      NOTE: L'oxygène agit comme un piège à radicaux libres et lorsqu'il est présent, il inhibe la polymérisation.
   2. Ajouter 25 ul de 10% en poids / volume de persulfate d'ammonium (voir point 1.3) pour obtenir un finaleconcentration en persulfate d'ammonium à 0,05%.
   3. Ajouter 2,5 pi de N, N, N ', N'-tétraméthyléthylènediamine (TEMED, _M 116,24 g / mol) à la solution dégazée de gel pour obtenir une concentration finale de TEMED 0,5%.
      NOTE: Magasin TEMED dans une armoire inflammable à RT. Manipuler dans une hotte chimique lorsque vous portez un équipement de protection individuelle approprié. Gardez bien fermé sous gaz inerte, car il est très sensible à l'humidité et de l'air.
   4. Mélanger doucement la solution par pipetage de haut en bas 3-5 fois. Ne vortex pour éviter la diffusion d'oxygène dans la solution de précurseur de gel.
   5. Pipeter la solution de gélatine sur le côté hydrophile du support en matière plastique souple et un sandwich avec lame de verre hydrophobe revêtu. Séparer les deux glissières par des entretoises de silicone d'une épaisseur désirée (par exemple, 0,5 mm). Laisser une petite quantité (~ 100 pi) d'une solution de précurseur de polymère dans le tube conique de 50 ml d'utiliser comme indicateur de gélification.
      REMARQUE:Tout écartement pourrait être utilisé. Par exemple, une seule bande de Parafilm donne une épaisseur de gel gonflé finale de 100 - 120 um.
   6. Placez une autre plaque de verre au sommet du sandwich en plastique souple support / gel pour assurer une surface plane hydrogel lors de la polymérisation.
   7. Laisser polymériser le gel pendant 45 minutes, bien que moins de temps peut être utilisé pour des gels supérieur% en poids, si désiré. Pour se assurer que le gel a polymérisé, observer la solution restante dans le tube conique de 50 ml; si la solution restante a gélifié, alors il est probable que la gélification de la plaque de verre a été initié ainsi. Toutefois, notez que l'ouverture prématurée de la moule empêcher la polymérisation complète.
   8. Une fois que le gel est formé, décoller le support de plastique souple avec le gel de polyacrylamide attaché de manière covalente sur le dessus, et mettre gel côté-up sécher à l'air.
      REMARQUE: convection ou séchage à la chaleur peuvent aussi être utilisés pour accélérer cette étape. Une fois séché sur le support en matière plastique souple, le gel peut être magasinD indéfiniment.
      1. Marquer des taches nues du support de plastique souple, où les gels de polyacrylamide ne font pas en raison de bulles. Mark tandis que le gel est encore hydratée car cela se fondre dans le support de plastique souple une fois que le gel est sec.

3. Assemblée Multiwell Plate, Collagène revêtement, et stérilisation

1. Assemblage de plaque à puits multiples.
   1. Une fois séché, coupé gels PA dans des formes souhaitées.
      1. Pour une plaque de 96 puits, utilisez une perforatrice lourd de devoir avec un diamètre de ~ 6 mm. Utilisez un coupe-papier robuste pour couper gels dans des formes carrées ou rectangulaires. Sinon, utilisez des ciseaux.
   2. Préparer environ 500 ul de PDMS par plaque à 96 puits selon les instructions du fabricant. Pour coller les gels au fond d'une plaque à puits multiples, placer une petite goutte (~ 5 pi) de polydiméthylsiloxane (PDMS) au centre de chaque puits. En utilisant des pinces, placer une polyacrylamidegel de e de chaque côté ainsi, flexible support en plastique vers le bas. Pour permettre PDMS pour guérir, laissez la plaque assemblée à 37 ° C pendant un minimum de 4 heures.
2. Collagène revêtement de gels de Polyacrylamide.
   1. Avec une pipette de transfert, placer une petite quantité (7-8 pi) de sulfo-SANPAH (se reporter au point 1.2.2) dans chaque puits et agiter de droite à gauche pour enrober la surface du gel uniformément. Travaillez rapidement depuis sulfo-SANPAH ne est pas stable dans l'eau.
   2. Placer la plaque de puits sous une lampe UV à haute intensité (intensité = 37 mW, λ = 302 à 365 nm) pendant 5 min. Rincer les gels avec du PBS pour éliminer sulfo-SANPAH excès.
   3. Pipette 50 ul de 0,2 mg / ml de collagène de type I solution (voir point 1.4) dans chaque puits. Laissez la plaque couverte à température ambiante pendant au moins 2 heures ou O / N à 4 ° C.
      NOTE: Pour accélérer le processus de revêtement de collagène, une pipette de transfert peut être utilisé pour ajouter la solution de collagène. Typiquement, 1-2 gouttes de solution devrait être suffisant pour terminerly couvrent la surface du gel.
   4. Laissez la plaque de puits à température ambiante pendant au moins 2 heures pour permettre la liaison de collagène.
   5. Rincer avec du PBS pour éliminer l'excès de solution de collagène et stériliser sous UV (λ = 200 nm) dans une hotte de culture tissulaire pendant 2 h.
   6. Faire tremper les gels dans un milieu complet (voir la section 4.1 pour la composition du milieu) O / N pour hydrater et équilibrer. Utilisez pour la cellule ensemencement immédiatement ou conserver au réfrigérateur jusqu'à 2 jours.

4. cellulaire semis sur PA Rigidité Assay

REMARQUE: Bien que typique de lignées cellulaires de mammifères communes, le protocole décrit dans cette section est utilisé spécifiquement avec le cancer du sein lignée cellulaire MDA-MB-231 (voir figures 4 et 5).

1. Recueillir les cellules de flacon de culture de tissu par exposition à 5% de trypsine / EDTA pendant 5 min à 37 ° C. Utilisez ~ 80 pi de trypsine / EDTA pour chaque cm ² de la culture zone de ballon; par exemple, utiliser 2 ml de trypsine / EDTA fora T25 du ballon de culture de cellules. Remettre en suspension les cellules récoltées dans du milieu complet supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine à une concentration finale souhaitée de la cellule. En tenant compte de temps de doublement cellulaire ainsi que la durée pendant laquelle les cellules sont ensemencées sur l'analyse, choisir une concentration cellulaire appropriée sous-confluentes. Assurez-vous que moyen supplémentaire est suffisant pour submerger complètement les hydrogels.
   NOTE: Depuis les hydrogels ont été pré-équilibrée dans les médias (voir l'étape 3.2.6) un volume de 100 pi devrait être suffisant. Des volumes de taille typiques utilisés pour les plaques multi-puits devraient être suffisants puisque les gels ont été pré-équilibrée dans du support dans l'étape précédente.
   NOTE: Le test serait approprié pour tout type de fixation des cellules dépendant.
   1. Compter le nombre de cellules sous un microscope inversé en utilisant un hémacytomètre. Charge 10 pi de suspension cellulaire dans chaque port de hémacytomètre et la moyenne du nombre de cellules à partir d'au moins huit quadrants. Pour obtenir leconcentration cellulaire finale, il faut multiplier le nombre de cellules par 10 ^quatre.
      REMARQUE: Les meilleurs résultats de comptage cellulaire sont obtenus lorsque le nombre de cellules dans chaque quadrant de hématimètre est 20-50.
2. Culture des cellules sur le test de rigidité PA dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de CO _2. Changer de support tous les 2 à 3 jours. Recueillir les cellules en cas de besoin par une exposition à 5% de trypsine / EDTA à 37 ° C pendant 5 min. Utilisation ~ 80 pi de trypsine / EDTA par ^cm2 de flacon de culture tissulaire. Au cours de toutes les étapes de manipulation cellulaire, prenez soin de ne pas perturber la surface d'hydrogel: aspirer ou moyen de pipette en inclinant légèrement la plaque à puits multiples sur le côté et de toucher la pointe de la pipette sur la paroi latérale de chaque puits, par opposition à toucher l'hydrogel.
   REMARQUE: Sauf pour prendre soin de ne pas endommager la surface d'hydrogel lors de la manipulation de culture tissulaire standard, les cellules ensemencées sur le test de rigidité peut être manipulé de la même manière que si elles ont été ensemencées surd'une plaque multipuits régulière.

5. imagerie des cellules ensemencées sur PA Rigidité Assay

1. cellules image directement sur le test de rigidité PA.
   NOTE: Toute microscope - inversé, fluorescent ou confocale, peut être utilisé pour l'imagerie cellulaire.
   REMARQUE: Le support en matière plastique souple utilisée pour construire le test de rigidité est entièrement transparent et ne pas interférer avec ou autofluorescence imagerie cellulaire. Cependant, même si le support en matière plastique souple lui-même est transparente, des capacités d'imagerie seront limités par la distance de travail de l'objectif. Le support en matière plastique souple a une épaisseur de 0,23 mm et une distance de travail typique d'un objectif 10X est ~ 4 mm, diminuant fortement pour des grossissements plus élevés.
   1. Pour l'imagerie des cellules vivantes, la position PA rigidité test in support de plaque de microscope et l'image. Les séances d'imagerie sous 2 heures, ou utiliser un microscope équipé d'une chambre environnementale des durées d'imagerie.
   2. Lorsque im de cellules vivantesvieillissement ne est pas l'objectif, fixer les cellules dans une solution de formaldéhyde 4% complété avec 0,1% de détergent. Faire tremper les cellules dans un fixateur à température ambiante pendant un minimum de 2 heures. Rincer deux fois avec PBS. Jeter les déchets fixateur dans un conteneur de déchets désignés.
      NOTE: Les cellules peuvent être visualisés immédiatement ou stockée immergés dans du PBS à 4 ° C pendant jusqu'à deux semaines. ATTENTION: Le formaldéhyde est toxique par inhalation et par contact. Manipuler avec des gants dans une hotte chimique.
      REMARQUE: Cellulaire protocole de fixation doit être choisi sur la base des protocoles de coloration de la cellule et la manipulation ultérieure, parce que certains fixateurs endommagent certaines protéines cellulaires.
   3. Pour l'imagerie de fluorescence, colorer les cellules avec tache de cellule souhaitée directement dans la plaque multi-puits fixée. Image immédiatement.

Résultats

Polyacrylamide (AP) hydrogels sont largement utilisés pour tester les réponses cellulaires rigidité dépendante. ^17,24 En mélangeant différentes concentrations d'acrylamide (A) et bis-acrylamide (B) on peut faire gels PA qui couvrent la gamme de rigidité de la plupart des tissus mous le corps - 0,3 -.. 300 le module de kPa Jeune ¹ Cependant, la préparation de gels de polyacrylamide est long et fastidieux, ce qui limite souvent leur utilité dans des applications «à haut débit» comme ...

Discussion

Les gels de polyacrylamide, initialement mis au point pour l'électrophorèse, ²⁸ sont maintenant couramment utilisés comme substrats de culture cellulaire pour étudier les effets de la rigidité du substrat sur ​​la morphologie cellulaire, la motilité et la communication ^3,24,29 parmi d'autres caractéristiques de cellules. Polyacrylamide permet la manipulation de la rigidité du substrat pour englober la rigidité de l'ensemble des tissus mous dans le corps (0,3 à 300 kPa) ave...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
40% Acrylamide	Bio-Rad	161-0140
2% Bis-acrylamide	Bio-Rad	161-0142
Ammonium Persulfate	Bio-Rad	161-07000
TEMED	Sigma Aldrich	T9281
Sulfo-SANPAH	Thermo Scientific	22589
Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/ml	BD Biosciences	354236
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100
Hydrophobic solution — Repel Silane	GE Healthcare Bio-Sciences	17-1332-01
PBS (1x), pH 7.4	HyClone	SH30256.01
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit]	Elsworth Adhesives	3097358-1004
Tyrpsin/EDTA (10x)	Sigma Aldrich	44174
RPMI-1640 Medium (1x)	HyClone	SH30027-02
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30073-03
Penicillin Streptomycin	MP Biomedicals	1670046
Detergent: Triton-X	Sigma Aldrich	T8787
Formaldehyde 37% Solution	Sigma Aldrich	F1635
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A2153
BSA-based cell adhesion blocking kit — ECM Cell Adhesion Array Kit	Chemicon International	ECM540
Disposable lab equipment
flexible plastic support — GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels	GE Healthcare Bio-Sciences	309819
Glass Plates	Slumpys	GBS4100SFSL
50 ml conical tubes	Fisher Scientific	3181345107
15 ml conicals tubes	FALCON	352097
Micro centrifuge tubes	Fisher Scientific	2 ml: 02681258
96-well plate (flat bottom)	Fisher Scientific	12565501
Disposable Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml)	Fisher Scientific	1 ml: 13-678-11B, 2 ml: 05214038, 5 ml (FALCON): 357529, 10 ml: 13-678-11E, 25 ml: 13-678-11, 50 ml: 13-678-11F
Glass Transfer Pipettes	Fisher Scientific	5 3/4": 1367820A, 9":136786B
Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl)	Fisher Scientific	2707509
Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes	Fisher Scientific	13-711-9D
Parafilm	PARAFILM	PM992
Powder Free Examination Gloves	Quest	92897
Silicone spacers — Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm	Grace Bio-Labs	JTR-S-0.5
Large/non-disposable lab equipment
Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M)	Zeiss	3820005619
Microscope Software	Zeiss	AxioVision Rel. 4.8.2
UV oven	UVITRON	UV1080
Vacuum chamber/degasser	BelArt	999320237
Vacuum pump for degasser	KNF Lab	5097482
Tissue Culture Hood	NUAIRE	NU-425-600
Chemical Fume Hood	KEWAUNEE	99151
Inverted Microscope (Axiovert 25)	Zeiss	663526
Incubator	NUAIRE	NU-8500
Pipette Aid	Drummond Scientific Co.	P-76864
Hemacytometer	Bright-Line	383684