Semplice Poliacrilammide-based a più pozzetti Rigidità Assay per lo Studio della rigidezza-dipendenti le risposte delle cellule

Riepilogo

Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Abstract

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 – 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn’t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Introduzione

La maggior parte dei tessuti del corpo sono materiali viscoelastici morbidi con un modulo di Young che vanno da 0,1 kPa per cervello a 100 kPa per cartilagine morbida, ma, più in ricerca sulle cellule vitro è condotta su coltura tissutale polistirene (TCP), che ha un modulo di ~ 1 GPa . ¹ Questa mancata corrispondenza rigidità influenza notevolmente il modo in cui le cellule rispondono al loro ambiente. Un crescente corpo di ricerca è quindi dedicata alla chiarire l'effetto del substrato rigidità sul destino di vari tipi cellulari, comprese le cellule staminali ^{2,3. 4} Come risultato, più idrogel sono stati sviluppati per aiutare nella comprensione della cella rigidità-dipendente biologia compresi poliacrilammide (PA), ^5-7 polietilene glicole (PEG), ^8,9 polidimetilsilossano (PDMS), ¹⁰ e alginato. ¹¹ Mentre la prova che substrato rigidità ha un impatto sostanziale sul destino delle cellule è in crescita, la maggior parte degli studi sono condotti su scala ridotta con un piccolo numero di samples. Sistematiche, studi multidimensionali sull'effetto di substrato rigidità per una serie di tipi cellulari o condizioni ambientali sono rare. ¹²

Sono state sviluppate diverse tecnologie idrogel high-throughput promettenti, tra cui microarrays basati PEG, ¹³ dispositivi microfluidici per la produzione di microsfere di agarosio idrogel, ¹⁴ o micro e nano-aste in cui la rigidità è modulata dal diametro e altezza delle microrods. ¹⁵ Tuttavia , le tecnologie per preparare questi substrati sono sofisticati e disponibili per il numero limitato di laboratori. Gran parte della ricerca che coinvolge rigidità modulato le risposte delle cellule utilizza poliacrilammide (PA) gel che non sono solo poco costoso e semplice da implementare, ma mostrano anche una gamma fisiologicamente rilevanti di modulo di Young, vale a dire 0,3 -. 300 kPa ^16-22 Tuttavia, i metodi esistenti per fabbricare PA gel per colture cellulari molto lavoro e, conseguentemente, di preparazioneared in piccoli lotti. Alcune delle difficoltà associate alla preparazione di gel PA come substrati cellulari derivano dal requisito che i gel devono essere preparati: 1) in assenza di ossigeno per permettere la completa polimerizzazione, 2) con una superficie piana e liscia per consentire cellulare uniforme attaccamento e diffusione, e 3) fissata in modo al fondo del piatto di coltura cellulare per prevenire galleggiante.

Diversi gruppi hanno tentato di produrre gel PA per colture cellulari in grandi lotti. Semler et al. Fogli spessi preparati dei gel PA che erano poi "tagliata" con un perforatore e posizionati in piastre da 96 pozzetti. ²³ Tuttavia, questo metodo è limitato a gel rigide, cioè,> 1 kPa nel modulo di Young, perchè più morbido gel sono "sticky", difficile da tagliare, e facilmente danneggiati. Mih et al. Sviluppato una tecnica più sofisticata che permette i gel da polimerizzare direttamente in una piastra multipozzetto fondo di vetro. ^{6 Questo è stato ottenuto versando le soluzioni di gel in lastre di vetro-bottom funzionalizzate e formando gel da "sandwich" di loro con un allineamento coprioggetti personalizzato. 6 Anche se, lievi effetti di bordo molto promettenti sono stati ancora osservati con questa tecnica. Inoltre, la tecnica richiede una matrice custom-designed non immediatamente accessibili a molti laboratori e costose piastre a pozzetti multipli con fondo di vetro.}

Questo documento descrive un modo semplice e poco costoso da montare gel PA in una piastra multipozzetto che potrebbe facilmente essere adottata da qualsiasi laboratorio. Qui, un supporto plastico flessibile è utilizzato, che ha due lati - uno idrofoba, che è repellente per gel PA, e uno idrofila, che si lega covalentemente il gel PA sulla deposizione. Una volta fogli di gel PA vengono depositati e permanentemente affissa al supporto plastico flessibile, consente la movimentazione gel di qualsiasi spessore o rigidità e taglio in qualsiasi forma desiderata. Questo approach non solo produce custom 'vetrini' di plastica in formati non altrimenti disponibili in commercio, ma evita anche la necessità di pre-trattare le superfici di vetro, sia vetrini o pozzetti di costose lastre di pozzetti con fondo di vetro, con una soluzione PA vincolante, che è un noioso e un passo che richiede tempo. Infine, uniformi fogli gel PA possono essere preparati in grandi lotti e de-idratato conservati per alcuni mesi.

In sintesi, il saggio qui presentato è un miglioramento rispetto ai metodi esistenti in diversi aspetti. In primo luogo, il processo di assemblaggio piastra multipozzetto è efficiente, e il costo complessivo dei materiali necessari è basso. In secondo luogo, gli idrogel sono prodotte in grandi lotti in un unico film gel omogeneo. Infine, solo materiali che sono commercialmente disponibili sono richiesti. L'utilità del saggio è illustrato esplorare l'effetto di substrato rigidità sulla morfologia cellulare e zona diffusione.

Protocollo

1. Preparazione di soluzioni e Aliquote Hydrogel associati

1. Preparazione della soluzione poliacrilammide gel precursore.
   1. Preparare soluzione di gel di poliacrilammide precursore miscelando acrilammide (A) (40% w / v, M _r 71.08 g / mol), la bisacrylamide reticolante (B) (2% w / v, M _r 154.17 g / mol), e de- acqua ionizzata nelle percentuali di volume specificati nella tabella 1.
      NOTA: Queste soluzioni possono essere preparati in grandi lotti e conservati a 4 ° C fino a diversi mesi.
      1. ATTENZIONE: L'acrilamide è tossica su inalazione o ingestione, in particolare, se in polvere: così, utilizzare preferibilmente il 40% w / v soluzione per ridurre i rischi di tossicità. Maneggiare solo mentre indossa indumenti protettivi, come guanti, occhiali, e un camice da laboratorio. Conservare in un contenitore resistente alla luce, ben chiuso in frigorifero (<23 ° C, e ben ventilato).
      2. ATTENZIONE: Bis-acrilamide è tossica su inalazione o ingestione, in particolare,quando in polvere: così, utilizzare preferibilmente 2% w / v soluzione per ridurre i rischi di tossicità. Maneggiare solo mentre indossa indumenti protettivi, come guanti, occhiali, e un camice da laboratorio. Conservare in un contenitore resistente alla luce, ben chiuso in frigorifero (<4 ° C, e ben ventilato).
2. Preparazione e utilizzo di N -Sulfosuccinimidyl-6- (4'-azido-2'-nitrophenylamino) esanoato (Sulfo-SANPAH, M _r 492,40 g / mol) aliquote. ATTENZIONE: Sulfo-SANPAH provoca grave irritazione oculare; maneggiare con i guanti e la corretta protezione degli occhi o il viso. Conservare a -20 ° C alla ricezione e prima in aliquote.
   1. Per memorizzare sulfo-SANPAH: sciogliere Sulfo-SANPAH in dimethylsulfoxane (DMSO) a 50 mg / ml. Aliquota della soluzione di riserva in 50 provette micro da 20 ml per provetta. Freeze Flash in ghiaccio secco o in azoto liquido (un passaggio facoltativo, ma preferito per preservare la massima efficienza reticolante) e conservare a -80 ° C.
      NOTA: Le aliquote can essere conservati per alcuni mesi.
   2. Per utilizzare solfo-SANPAH: scongelare brevemente un'aliquota e diluire in 480 ml di acqua deionizzata. Utilizzare immediatamente. Sulfo-SANPAH idrolizza rapidamente in acqua: quindi prendere cautela per eseguire tutti i passaggi sopra in fretta.
3. Preparazione di persolfato di ammonio (M _r 228,18 g / mol) aliquote.
   NOTA: persolfato di ammonio provoca occhi, irritazione della pelle e delle vie respiratorie. Indossare dispositivi di protezione adeguati durante la manipolazione. Maneggiare persolfato di ammonio in polvere in una cappa. Conservare la polvere in un luogo asciutto e ben ventilato. Una volta aliquotati, la soluzione diluita può essere utilizzato sul banco di lavoro.
   1. Sciogliere persolfato di ammonio in acqua deionizzata per ottenere una concentrazione finale persolfato di ammonio del 10% w / v. Aliquota e conservare a -20 ° C. Scongelare immediatamente prima dell'uso.
4. Preparazione della soluzione di collagene di tipo I.
   1. Preparare 0,2 mg / ml soluzione di collagene diluendo il magazzino in modoluzione in 1x tampone fosfato salino (PBS) pH 7,4. Conservare brevemente ghiaccio o utilizzare immediatamente dopo la diluizione.

2. Idrogel Preparazione (fare riferimento alla figura 1)

1. Preparazione di vetrini idrofobici.
   1. Mettere alcune gocce di una soluzione idrofobico su una lastra di vetro e utilizzare carta velina per diffondere attraverso la superficie. Lasciate asciugare e pulire con un fazzolettino di carta di nuovo per uniformare il rivestimento idrofobo.
      NOTA: soluzione idrofobico Conservare in un armadio infiammabile a temperatura ambiente. Indossare indumenti protettivi durante la manipolazione. Lavorare in un ambiente ben ventilato.
2. Preparazione del supporto plastico flessibile.
   1. Tagliare il supporto di plastica flessibile per adattarsi alle dimensioni della lastra di vetro idrorepellente rivestita.
   2. Contrassegnare lato idrofoba del supporto plastico flessibile leggermente graffiare la superficie con un attrezzo appuntito come un bisturi.
      NOTA: Una volta che il gel - che è completamente trasparente - asciuga, I graffi aiuteranno a distinguere da che parte il supporto di plastica flessibile contiene il gel.
      NOTA: Il supporto di plastica flessibile ha un idrofobico e un lato idrofila. Una volta depositato, poliacrilammide aderisce in modo permanente al lato idrofila del supporto plastico che facilita la successiva manipolazione idrogel.
3. Gel Preparazione (esempio volumi sono indicati per soluzioni gel precursori 5 ml).
   NOTA: 5 ml sarebbero sufficienti a produrre ~ 40 gel quando lo spessore iniziale gel è di 0,5 mm. Più gel possono essere prodotti se lo spessore gel viene ridotta.
   1. Inserire 4972,5 ml di soluzione di precursore di poliacrilammide concentrazione finale desiderata (Tabella 1) in una provetta conica da 50 ml. Mettere in una camera di degasaggio per 30 minuti con il tappo aperto.
      NOTA: ossigeno agisce come una trappola radicali liberi e, quando presente, inibisce la polimerizzazione.
   2. Aggiungere 25 ml di 10% w / v di ammonio persolfato (vedi punto 1.3) per ottenere una finaleammonio persolfato concentrazione dello 0,05%.
   3. Aggiungere 2,5 ml di N, N, N ', N'-tetrametiletilendiammina (TEMED, M _r 116.24 g / mol) alla soluzione di gel degasato per ottenere una concentrazione finale di 0,5 TEMED%.
      NOTA: Conservare TEMED in un armadio infiammabile a temperatura ambiente. Maneggiare in una cappa indossando i dispositivi di protezione adeguati. Tenere ben chiuso sotto gas inerte, come è altamente dell'aria e sensibile all'umidità.
   4. Mescolare delicatamente la soluzione pipettando su e giù 3 - 5 volte. Non vortice per evitare la diffusione di ossigeno nella soluzione di gel precursore.
   5. Pipettare la soluzione di gel sul lato idrofila del supporto plastico flessibile e panino con idrofobico rivestita vetrino. Separate le due slitte con distanziali silicone di spessore desiderato (ad esempio 0,5 mm). Lasciare una piccola quantità (~ 100 ml) di soluzione di precursore di polimero nella provetta conica da 50 ml di utilizzare come indicatore di gelificazione.
      NOTA:Qualsiasi spacer potrebbe essere utilizzato. Per esempio, una singola striscia di Parafilm dà spessore gonfio gel finale di 100 - 120 micron.
   6. Posizionare un altro lastra di vetro in cima al flessibile panino supporto / gel plastica per accertare una superficie piana idrogel sulla polimerizzazione.
   7. Lasciare polimerizzare il gel per 45 minuti, anche se meno tempo può essere utilizzato per i gel di maggiore% in peso, se desiderato. Per verificare che il gel ha polimerizzato, osservare la soluzione rimanente nel tubo conico da 50 ml; se la soluzione rimanente è gelificata, allora è probabile che gelificazione sulla lastra di vetro è stata avviata pure. Si noti tuttavia che l'apertura anticipata dello stampo impedirà completa polimerizzazione.
   8. Una volta che il gel si forma, staccare il supporto plastico flessibile con il gel di poliacrilammide covalentemente attaccato sulla parte superiore, e impostare gel-side-up asciugare all'aria.
      NOTA: convezione o essiccazione calore possono anche essere utilizzati per accelerare questo passaggio. Una volta essiccato sul supporto di plastica flessibile, il gel può essere negoziod tempo indeterminato.
      1. Segna tutti i punti scoperti del supporto plastico flessibile, dove gel di poliacrilammide non formano a causa di bolle. Mark mentre il gel è ancora idratata quanto ciò fondono con il supporto plastico flessibile quando il gel è asciutto.

3. multipozzetto gruppo piastra, Collagene Coating, e sterilizzazione

1. Assieme piastra multipozzetto.
   1. Una volta asciugato, tagliato gel PA in forme desiderate.
      1. Per una piastra a 96 pozzetti, utilizzare un buco pugno pesante, con un diametro di circa 6 mm. Usare un taglierino pesante per tagliare gel in forme quadrate o rettangolari. In alternativa, usare le forbici.
   2. Preparare circa 500 ml di PDMS per piastra da 96 pozzetti secondo le istruzioni del produttore. Per incollare i gel al fondo di una piastra multipozzetto, posizionare una piccola goccia (~ 5 microlitri) di polidimetilsilossano (PDMS) al centro della ogni pozzetto. Utilizzando pinze, collocare uno polyacrylamide gel in ogni lato supporto plastico bene, flessibili verso il basso. Per consentire PDMS curare, lasciare la piastra montata a 37 ° C per un minimo di 4 ore.
2. Rivestimento Collagene di gel di poliacrilammide.
   1. Con una pipetta di trasferimento, mettere una piccola quantità (7-8 ml) di solfo-SANPAH (vedi punto 1.2.2) in ogni pozzetto e turbolenza da un lato all'altro per rivestire la superficie del gel in modo uniforme. Lavoro prontamente dal solfo-SANPAH non è stabile in acqua.
   2. Posizionare la piastra ben sotto una lampada UV ad alta intensità (intensità = 37 mW, λ = 302-365 nm) per 5 min. Sciacquare i gel con PBS per rimuovere l'eccesso solfo-SANPAH.
   3. Pipettare 50 ml di 0,2 mg / ml di collagene di tipo I soluzione (vedi punto 1.4) in ogni pozzetto. Lasciare la piastra coperta a temperatura ambiente per almeno 2 ore o O / N a 4 ° C.
      NOTA: Per accelerare il processo di verniciatura collagene, una pipetta di trasferimento può essere utilizzata per aggiungere la soluzione di collagene. Tipicamente, 1 - 2 gocce di soluzione deve essere sufficiente per completarely coprire la superficie del gel.
   4. Lasciare la piastra bene a temperatura ambiente per almeno 2 ore per consentire il collagene legame.
   5. Risciacquare con PBS per rimuovere la soluzione di collagene in eccesso e sterilizzare ai raggi UV (λ = 200 nm) in una cappa coltura tissutale per 2 ore.
   6. Mettere a bagno i gel in terreno completo (fare riferimento alla sezione 4.1 per mezzo di composizione) O / N per idratare ed equilibrare. Utilizzare per la cella di semina immediatamente o conservare in frigorifero per un massimo di 2 giorni.

4. Semina cellulare su PA Rigidità Assay

NOTA: Sebbene tipico per linee comuni di cellule di mammifero, il protocollo descritto in questa sezione è specificamente utilizzato con il cancro al seno linea cellulare MDA-MB-231 (vedi figure 4 e 5).

1. Raccogliere cellule dal pallone di coltura tissutale da esposizione al 5% tripsina / EDTA per 5 min a 37 ° C. Utilizzare ~ 80 ml ​​di tripsina / EDTA per ogni cm ² di cultura dell'area pallone; per esempio, utilizzare 2 ml di tripsina / EDTA fora T25 pallone di coltura cellulare. Risospendere le cellule raccolte in mezzo completo addizionato con siero fetale bovino 10% (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina a una concentrazione cellulare finale desiderata. Tenendo conto delle cellule tempo di raddoppio e la lunghezza del tempo le cellule saranno seminate sul dosaggio, scegliere concentrazione cellulare sub-confluenti appropriata. Assicurarsi che media aggiunto è sufficiente per immergere completamente il idrogel.
   NOTA: Poiché i idrogel sono stati pre-equilibrata nei media (fare riferimento al punto 3.2.6) 100 Volume ml dovrebbe essere sufficiente. Tipici volumi medi utilizzati per piastre a pozzetti multipli devono essere sufficienti in quanto i gel sono stati pre-equilibrata in media nel passaggio precedente.
   NOTA: Il test sarebbe appropriato per qualsiasi tipo di cellula attaccamento-dipendente.
   1. Contare il numero di cellule al microscopio invertito utilizzando un emocitometro. Carico 10 ml di sospensione cellulare in ogni porto emocitometro e la media del numero di celle da almeno 8 quadranti. Per ottenere ilconcentrazione cellulare finale, moltiplicare il numero di celle da 10 ^4.
      NOTA: I migliori risultati di conteggio delle cellule si ottengono quando il numero di cellule in ogni quadrante emocitometro è 20 - 50.
2. Coltivare le cellule sul test rigidità PA in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% di CO _2. Cambiare i media ogni 2 - 3 giorni. Raccogliere cellule quando necessario dall'esposizione al 5% tripsina / EDTA a 37 ° C per 5 min. Utilizzare ~ 80 ml ​​di tripsina / EDTA per cm ² di pallone di coltura tissutale. Durante tutte le fasi di manipolazione cellulare, prestare particolare attenzione a non disturbare la superficie di idrogel: aspirato o medio pipetta leggermente inclinando la piastra pozzetti lateralmente e toccando la punta della pipetta sulla parete laterale di ogni bene, al contrario di toccare l'idrogel.
   NOTA: Ad eccezione facendo particolare attenzione a non danneggiare la superficie idrogel durante la movimentazione coltura tissutale normale, le cellule seminate su dosaggio rigidità può essere manipolato nello stesso modo come se fossero seminate suad una piastra multipozzetto regolare.

5. Imaging di celle seminate su PA Rigidità Assay

1. Celle di immagine direttamente sul test rigidità PA.
   NOTA: Qualsiasi microscope - invertito, fluorescenza o confocale, può essere utilizzata per l'imaging cellulare.
   NOTA: Il supporto di plastica flessibile utilizzato per costruire il test di rigidità è completamente trasparente e non possiede autofluorescenza o interferire con l'imaging cellulare. Tuttavia, anche se il supporto flessibile di plastica è trasparente, capacità di imaging saranno limitati dalla distanza di lavoro dell'obiettivo. Il supporto di plastica flessibile ha uno spessore di 0,23 mm e una distanza di lavoro tipica di un obiettivo 10X è ~ 4 mm bruscamente decrescente per ingrandimenti maggiori.
   1. Per l'imaging cellulare dal vivo, posizione PA rigidità test in portatarga microscopio e immagine. Tenere sessioni di imaging in 2 ore, o utilizzare un microscopio equipaggiato con una camera climatica per tempi più lunghi di imaging.
   2. Quando im cellulare dal vivol'invecchiamento non è l'obiettivo, fissare le cellule in soluzione di formaldeide 4% integrato con 0,1% di detergente. Immergere le cellule in fissante a temperatura ambiente per un minimo di 2 ore. Risciacquare con PBS due volte. Smaltire i rifiuti fissativo in un contenitore per rifiuti designato.
      NOTA: Le celle possono essere esposte immediatamente o conservate immersi in PBS a 4 ° C fino a 2 settimane. ATTENZIONE: La formaldeide è tossica su inalazione e contatto. Maneggiare con guanti in una cappa.
      NOTA: il protocollo di fissazione delle cellule deve essere scelto in base ai protocolli di colorazione e di trattamento delle cellule successive, in quanto alcuni fissativi danneggiano alcune proteine ​​cellulari.
   3. Per l'imaging fluorescente, macchia cellule con colorazione cella desiderata direttamente nel piatto pozzetti fisso. Immagine immediatamente.

Risultati

Poliacrilammide (PA) idrogel sono ampiamente usati per testare le risposte delle cellule rigidità-dipendente. ^17,24 Miscelando varie concentrazioni di acrilammide (A) e bis-acrilamide (B) si possono fare gel PA che abbracciano la gamma di maggior rigidità tessuti molli in il corpo - 0,3 -.. 300 modulo di kPa giovane ¹ Tuttavia, la preparazione di gel di poliacrilammide è noioso e che richiede tempo, spesso limitando la loro utilità in applicazioni "high throughput" come per lo screeni...

Discussione

Gel di poliacrilammide, originariamente sviluppati per elettroforesi, ²⁸ sono oggi utilizzati di routine come substrati di coltura cellulare per studiare gli effetti di substrato rigidità sulla morfologia delle cellule, la motilità e la comunicazione ^3,24,29 tra le altre caratteristiche cellulari. Poliacrilammide consente la manipolazione del substrato rigidità che comprende la rigidità di tutti i tessuti molli del corpo (0,3 - 300 kPa) ¹ con una semplice variazione della concentrazi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
40% Acrylamide	Bio-Rad	161-0140
2% Bis-acrylamide	Bio-Rad	161-0142
Ammonium Persulfate	Bio-Rad	161-07000
TEMED	Sigma Aldrich	T9281
Sulfo-SANPAH	Thermo Scientific	22589
Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/ml	BD Biosciences	354236
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100
Hydrophobic solution — Repel Silane	GE Healthcare Bio-Sciences	17-1332-01
PBS (1x), pH 7.4	HyClone	SH30256.01
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit]	Elsworth Adhesives	3097358-1004
Tyrpsin/EDTA (10x)	Sigma Aldrich	44174
RPMI-1640 Medium (1x)	HyClone	SH30027-02
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30073-03
Penicillin Streptomycin	MP Biomedicals	1670046
Detergent: Triton-X	Sigma Aldrich	T8787
Formaldehyde 37% Solution	Sigma Aldrich	F1635
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A2153
BSA-based cell adhesion blocking kit — ECM Cell Adhesion Array Kit	Chemicon International	ECM540
Disposable lab equipment
flexible plastic support — GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels	GE Healthcare Bio-Sciences	309819
Glass Plates	Slumpys	GBS4100SFSL
50 ml conical tubes	Fisher Scientific	3181345107
15 ml conicals tubes	FALCON	352097
Micro centrifuge tubes	Fisher Scientific	2 ml: 02681258
96-well plate (flat bottom)	Fisher Scientific	12565501
Disposable Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml)	Fisher Scientific	1 ml: 13-678-11B, 2 ml: 05214038, 5 ml (FALCON): 357529, 10 ml: 13-678-11E, 25 ml: 13-678-11, 50 ml: 13-678-11F
Glass Transfer Pipettes	Fisher Scientific	5 3/4": 1367820A, 9":136786B
Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl)	Fisher Scientific	2707509
Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes	Fisher Scientific	13-711-9D
Parafilm	PARAFILM	PM992
Powder Free Examination Gloves	Quest	92897
Silicone spacers — Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm	Grace Bio-Labs	JTR-S-0.5
Large/non-disposable lab equipment
Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M)	Zeiss	3820005619
Microscope Software	Zeiss	AxioVision Rel. 4.8.2
UV oven	UVITRON	UV1080
Vacuum chamber/degasser	BelArt	999320237
Vacuum pump for degasser	KNF Lab	5097482
Tissue Culture Hood	NUAIRE	NU-425-600
Chemical Fume Hood	KEWAUNEE	99151
Inverted Microscope (Axiovert 25)	Zeiss	663526
Incubator	NUAIRE	NU-8500
Pipette Aid	Drummond Scientific Co.	P-76864
Hemacytometer	Bright-Line	383684