Simples Multiwell Rigidez Ensaio para o Estudo das respostas das células Rigidez dependentes base de poliacrilamida

Resumo

Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Resumo

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 – 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn’t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Introdução

A maioria dos tecidos do corpo são materiais viscoelásticos moles com um módulo de Young na gama de 0,1 kPa para o cérebro a 100 kPa durante cartilagem mole, ainda, a maior parte da investigação de células in vitro é realizada em culturas de tecidos de poliestireno (TCP), que tem um módulo de ~ 1 GPa . ¹ Esse descompasso rigidez afeta significativamente a forma como as células respondem ao seu meio ambiente. Um crescente corpo de pesquisa é, assim, dedicado a elucidar o efeito de rigidez do substrato sobre o destino de vários tipos de células, incluindo células estaminais ^{2,3 4} Como resultado., Vários hidrogéis têm sido desenvolvidos para auxiliar no entendimento de células dependente de rigidez biologia incluindo poliacrilamida (PA), ^5-7 polietileno glicol (PEG), ^8,9 polidimetilsiloxano (PDMS), ¹⁰ e ^{11 de} alginato. Embora a evidência de que a rigidez substrato tem um impacto substancial sobre o destino celular está crescendo, a maioria dos estudos são realizados em uma pequena escala com um pequeno número de samples. Multidimensionais, estudos sistemáticos sobre o efeito da rigidez substrato para uma variedade de tipos de células ou condições ambientais são raros. ¹²

Várias tecnologias de hidrogel de alto rendimento promissoras foram desenvolvidas, incluindo microarranjos baseados em PEG, ¹³ dispositivos microfluídicos para a produção de microesferas de agarose de hidrogel, ¹⁴ ou micro e nano-hastes onde rigidez é modulada pelo diâmetro e altura das microrods. ¹⁵ No entanto , as tecnologias para preparar tais substratos são sofisticados e disponível para um número limitado de laboratórios. Muita pesquisa envolvendo rigidez modulado respostas das células utiliza poliacrilamida (PA) géis que não só são baratos e simples de implementar, mas também exibem uma gama fisiologicamente relevante de módulo de Young, a saber, 0,3 -. 300 kPa ^16-22 No entanto, os métodos existentes para fabricar PA géis para cultura de células são intensivos de trabalho e, consequentemente, prepared em pequenos lotes. Algumas das dificuldades associadas com a preparação de géis PA como substratos de células-tronco a partir da exigência de que os géis tem que estar preparado: 1) na ausência de oxigênio para permitir a polimerização completa, 2) com uma superfície plana e lisa para permitir a célula uniforme ligação e de espalhamento, e 3) fixada permanentemente na parte inferior da placa de cultura de células para prevenir flutuação.

Diversos grupos tentaram produzir géis PA para cultura de células em grandes lotes. Semler et al., Folhas de espessura preparados de géis de PA, que foram depois "cortado" com um furador e colocadas em placas de 96 poços. ²³ No entanto, este método está limitado a géis mais duras, ou seja,> 1 kPa no módulo de Young, porque mais suave géis são "pegajoso", difícil de cortar, e facilmente danificada. Mih et ai. Desenvolveram uma técnica mais sofisticado que permite que os géis a ser polimerizado directamente em uma placa com múltiplas cavidades com fundo de vidro. ^{6 Isto foi conseguido através de derramamento as soluções de gel em placas com fundo de vidro funcionalizados e formando géis por "imprensando-los" com uma matriz lamela personalizado. 6 embora muito promissores, efeitos ligeira vantagem ainda foram observados com esta técnica. Além disso, a técnica requer uma matriz de design personalizado não imediatamente acessível para muitos laboratórios, bem como placas com múltiplas cavidades com fundo de vidro caros.}

Este artigo descreve uma maneira simples e barata para montar géis PA em um prato com vários poços que poderiam ser facilmente adotado por qualquer laboratório. Aqui, um suporte de plástico flexível é utilizado, que tem dois lados - um um hidrofóbico, que é repelente para géis de PA, e um uma hidrofílica, que liga covalentemente o gel PA sobre deposição. Uma vez que as folhas de gel de PA são depositados e permanentemente fixo ao suporte de plástico flexível, que permite manipular géis de qualquer espessura ou rigidez e cortando-os em qualquer forma desejada. Este aproxoach não só produz personalizados lamelas '' plásticas em tamanhos não anteriormente disponíveis no mercado, mas também elimina a necessidade de superfícies de vidro-tratamento pré, quer lamelas de vidro ou os poços de placas de múltiplos poços com fundo de vidro caros, com uma solução de ligação PA, que é uma tediosa e um passo consumidor de tempo. Finalmente, as folhas de geles uniformes PA pode ser preparado em grandes lotes e armazenados de-hidratado durante vários meses.

Em resumo, o ensaio aqui apresentado constitui uma melhoria em relação aos métodos existentes em vários aspectos. Em primeiro lugar, o processo de montagem de placa de poços múltiplos é eficaz, e o custo global dos materiais necessários é baixo. Em segundo lugar, os hidrogéis são produzidas em grandes lotes de um único filme em gel homogénea. Finalmente, apenas os materiais que se encontram comercialmente disponíveis são necessários. A utilidade do ensaio é ilustrada a explorar o efeito da rigidez do substrato na morfologia celular e a área de difusão.

Protocolo

1. Preparação de Soluções de Hidrogel Alíquotas e associadas

1. Preparação da solução precursora de gel de poliacrilamida.
   1. Preparar solução precursora em gel de poliacrilamida através da mistura de acrilamida (A) (40% w / v, M _r 71,08 g / mol), a bisacrilamida reticulador (B) (2% w / v, _r M 154,17 g / mol), e de- água ionizada nos percentuais de volume especificados na Tabela 1.
      NOTA: Estas soluções podem ser preparadas em grandes lotes e guardadas a 4 ° C durante até vários meses.
      1. ATENÇÃO: A acrilamida é tóxico por inalação ou ingestão, particularmente, quando em forma de pó: assim, de preferência, utilizar 40% w solução / v para reduzir os riscos de toxicidade. Manusear somente enquanto vestindo roupas de proteção, como luvas, óculos de proteção e um jaleco. Guarde em um recipiente resistente à luz, bem fechado na geladeira (<23 ° C, área bem ventilada).
      2. CUIDADO: bis-acrilamida é tóxico por inalação ou ingestão, particularmente,quando na forma de pó: assim, utilizar de preferência 2% w solução / v para reduzir os riscos de toxicidade. Manusear somente enquanto vestindo roupas de proteção, como luvas, óculos de proteção e um jaleco. Guarde em um recipiente resistente à luz, bem fechado na geladeira (<4 ° C, área bem ventilada).
2. Preparação e utilização de N -Sulfosuccinimidyl-6- (4'-azido-2'-nitrofenilamino) hexanoato (sulfo-SANPAH, M _r 492,40 g / mol) alíquotas. CUIDADO: Sulfo- SANPAH causa irritação ocular grave; lidar com luvas e adequada para os olhos ou a protecção face. Armazenar a -20 ° C após o recebimento e antes de alíquotas.
   1. Para armazenar sulfo-SANPAH: dissolver Sulfo-SANPAH em dimethylsulfoxane (DMSO) a 50 mg / ml. Alíquota da solução estoque em tubos de centrífuga de 50 micro de 20 ul por tubo. Congelamento flash em gelo seco ou em azoto líquido (um passo opcional, mas preferido para preservar a máxima eficiência reticulador) e armazenar a -80 ° C.
      NOTA: As alíquotas can ser armazenados durante vários meses.
   2. Para utilizar sulfo-SANPAH: descongelar o brevemente aliquota e diluída em 480 ul de água desionizada. Use imediatamente. Sulfo- SANPAH hidrolisa rapidamente em água; por isso tome cuidado para realizar todas as etapas acima rapidamente.
3. Preparação de persulfato de amónio _(Mr 228,18 g / mol) alíquotas.
   NOTA: persulfato de amónio causa dos olhos, pele e irritação das vias respiratórias. Use equipamento de proteção individual adequados ao manusear. Pega de persulfato de amónio em pó em um exaustor química. Pó Armazenar em local seco, bem ventilado. Uma vez aliquotas, a solução diluída pode ser utilizada na bancada de trabalho.
   1. Dissolve-se o persulfato de amónio em água desionizada para se obter uma concentração final de persulfato de amónio de 10% w / v. Alíquotas e armazenar a -20 ° C. Descongelar imediatamente antes da utilização.
4. Preparação de colágeno tipo I solução.
   1. Preparar solução de colagénio a 0,2 mg / ml por diluição do stock assimlução em 1x tampão fosfato salino (PBS) de pH 7,4. Guarde em breve gelo ou usar imediatamente após a diluição.

2. Preparação Hidrogel (Veja a Figura 1)

1. Preparação das lâminas de vidro hidrofóbicas.
   1. Coloque algumas gotas de uma solução hidrofóbica sobre uma placa de vidro e usar papel de seda para se espalhar por toda a superfície. Deixe o ar seco e limpe com um lenço de papel novamente para uniformizar o revestimento hidrofóbico.
      NOTA: Loja solução hidrofóbica em um gabinete inflamável à temperatura ambiente. Use equipamento de proteção individual ao manusear. Trabalhar em uma área bem ventilada.
2. Preparação do suporte de plástico flexível.
   1. Cortar o suporte de plástico flexível para corresponder ao tamanho da placa de vidro com revestimento hidrofóbico.
   2. Marcar o lado hidrofóbico do suporte de plástico flexível, arranhando a superfície levemente com uma ferramenta afiada, como um bisturi.
      NOTA: Uma vez que o gel - que é totalmente transparente - Seca, As marcas de arranhões vai ajudar a distinguir de que lado o apoio de plástico flexível contém o gel.
      NOTA: O suporte de plástico flexível tem um lado hidrofóbico e um hidrofílico. Uma vez depositado, poliacrilamida adere permanentemente ao lado hidrofílica do suporte de plástico que facilita o manuseio fácil hidrogel subseqüente.
3. Preparação de Gel (exemplo volumes são dados para 5 ml de soluções precursoras de gel).
   NOTA: 5 ml seria suficiente para produzir 40 ~ géis quando a espessura inicial de gel é de 0,5 mm. Mais géis podem ser produzidos, se a espessura do gel é reduzida.
   1. Colocar 4972,5 ul de solução precursora de poliacrilamida de concentração final desejada (Tabela 1) para um tubo de 50 ml. Colocar em uma câmara de desgaseificação durante 30 minutos, com a tampa aberta.
      NOTA: O oxigênio age como uma armadilha de radicais livres e, quando presente, ele inibe a polimerização.
   2. Adicionar 25 ul de 10% w / v de persulfato de amónio (ver ponto 1.3) para alcançar a solução definitivapersulfato de amónio concentração de 0,05%.
   3. Adicionar 2,5 mL de N, N, N ', N'-tetrametiletilenodiamina (TEMED, M _r 116,24 g / mol) para a solução de gel desgaseificado para obter uma concentração de TEMED final de 0,5%.
      NOTA: Loja TEMED em um gabinete inflamável à temperatura ambiente. Manusear de um fume hood química quando vestindo equipamentos de proteção individual adequados. Manter hermeticamente fechada sob um gás inerte, uma vez que é altamente sensível à humidade e ar.
   4. Misture a solução suavemente por pipetagem cima e para baixo 3-5 vezes. Não vórtice para evitar a difusão do oxigênio na solução precursor gel.
   5. Pipeta a solução de gel para o lado hidrofílica do suporte de plástico flexível e sanduíche com hidrofóbica revestido lâmina de vidro. Separa-se as duas lâminas com espaçadores de silicone de espessura desejada (por exemplo, 0,5 mm). Deixar um pequena quantidade (~ 100 mL) de solução de precursor de polímero no tubo de 50 ml para usar como um indicador de gelificação.
      NOTA:Qualquer espaçador pode ser utilizado. Por exemplo, uma única tira de Parafilm dá uma espessura de gel inchado definitiva entre 100 - 120 um.
   6. Coloque outra placa de vidro em cima do sanduíche apoio / gel de plástico flexível para averiguar uma superfície uniforme hidrogel após polimerização.
   7. Deixe o gel polimerizar durante 45 minutos, embora menos tempo pode ser usado para géis de maior% em peso, se desejado. Para verificar se o gel tenha polimerizado, observar a solução restante no tubo de 50 ml; se a solução restante foi gelificada, então é provável que a gelificação na placa de vidro ter sido iniciado assim. No entanto, note que a abertura prematura do molde vai evitar a polimerização completa.
   8. Uma vez formado o gel, retire o suporte de plástico flexível com o gel de poliacrilamida covalentemente ligado no topo, e do lado do gel de definir-se secar ao ar.
      NOTA: convecção de calor ou de secagem também podem ser utilizados para acelerar este passo. Depois secou-se sobre o suporte de plástico flexível, o gel pode ser lojad indefinidamente.
      1. Marcar algum ponto desencapado do suporte de plástico flexível, onde géis de poliacrilamida não formam devido a bolhas. Mark, enquanto o gel ainda é hidratado, pois isso vai misturar-se com o apoio de plástico flexível, uma vez que o gel é seco.

3. Assembléia Multiwell Plate, Collagen Coating, e Esterilização

1. Conjunto da placa Multiwell.
   1. Uma vez seca, cortada géis PA nas formas desejadas.
      1. Para uma placa de 96 poços, usar um furador pesado com um diâmetro de ~ 6 mm. Use um cortador de papel pesados ​​para cortar géis em formas quadradas ou retangulares. Como alternativa, use uma tesoura.
   2. Prepare a cerca de 500 ul de PDMS por placa de 96 poços de acordo com as instruções do fabricante. Para os geles de cola para a parte inferior de uma placa com múltiplas cavidades, colocar uma pequena gota (~ 5 mL) de polidimetilsiloxano (PDMS) no centro de cada poço a. Utilizando uma pinça, coloque uma poliacrilamidae gel em cada lado de suporte de plástico bem, flexível para baixo. Para permitir que o PDMS para curar, deixar a placa montada a 37 ° C durante um mínimo de 4 h.
2. Revestimento de colagénio de géis de poliacrilamida.
   1. Com uma pipeta de transferência, coloque uma pequena quantidade (7-8 ul) de sulfo-SANPAH (vide ponto 1.2.2) em cada poço e redemoinho de lado a lado para revestir a superfície do gel uniformemente. Trabalhe rapidamente desde sulfo-SANPAH não é estável em água.
   2. Colocar a placa bem sob uma lâmpada de UV de alta intensidade (intensidade = 37 mW, λ = 302-365 nm) durante 5 min. Lavar os géis com PBS para remover o excesso de sulfo-SANPAH.
   3. Pipetar 50 ul de 0,2 mg / ml de colagénio tipo I solução (ver ponto 1.4) em cada poço. Deixar a placa coberta à temperatura ambiente durante pelo menos 2 horas ou O / N a 4 ° C.
      NOTA: Para acelerar o processo de revestimento de colagénio, uma pipeta de transferência pode ser usado para adicionar a solução de colagénio. Tipicamente, 1-2 gotas da solução deve ser suficiente para completarly cobrir a superfície do gel.
   4. Deixar a placa com cavidades à temperatura ambiente durante pelo menos 2 h, para permitir a ligação do colagénio.
   5. Lavar com PBS para remover o excesso de solução de colagénio e esterilizar sob UV (λ = 200 nm) num capuz de cultura de tecido durante 2 horas.
   6. Mergulhe os géis em meio completo (veja seção 4.1 para médias composição) O / N para hidratar e equilibrar. Use para celular semear imediatamente ou guarde na geladeira por até 2 dias.

4. Sementeira celular no PA Rigidez Assay

NOTA: Embora típico para linhas de células de mamíferos comuns, o protocolo apresentado nesta seção é usado especificamente com o câncer de mama linha de células MDA-MB-231 (ver Figuras 4 e 5).

1. Recolher as células a partir de frascos de cultura de tecidos por exposição a 5% de tripsina / EDTA durante 5 minutos a 37 ° C. Use ~ 80 mL de tripsina / EDTA por cada cm ² de área garrafa de cultura; por exemplo, utilizar 2 ml de tripsina / EDTA fora T25 frasco de cultura de células. Re-suspender as células recolhidas em meio completo suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina a uma concentração celular final desejado. Tendo em conta o tempo de duplicação celular, bem como a duração do tempo as células serão semeadas no ensaio, escolher uma concentração de células sub-confluente apropriado. Certifique-se de que o meio adicionado é o suficiente para submergir completamente os hidrogéis.
   NOTA: Uma vez que os hidrogéis foram pré-equilibrada em mídia (consulte a etapa 3.2.6) 100 mL de volume deve ser suficiente. Os volumes médios típicos usados ​​para placas com múltiplas cavidades deve ser suficiente uma vez que os geles tenham sido pré-equilibrada em meios na etapa anterior.
   NOTA: O ensaio seria adequado para qualquer tipo de célula dependente de fixação.
   1. Contar o número de células em microscópio invertido usando um hemocitômetro. Carga de 10 ul de suspensão de células em cada porta de hemacitómetro e a média da contagem de células a partir de, pelo menos, 8 quadrantes. Para obter oconcentração celular final, multiplicar o número de células por 10 ^4.
      NOTA: Os melhores resultados de contagem de células são obtidos quando o número de células em cada quadrante hemacit�etro é 20-50.
2. Cultura das células para o ensaio de rigidez PA em um incubador humidificado a 37 ° C e 5% de CO _2. Mudança de mídia a cada 2-3 dias. Recolher as células, quando necessário por exposição a 5% de tripsina / EDTA a 37 ° C durante 5 min. Use ~ 80 mL de tripsina / EDTA por ^cm2 de garrafa de cultura de tecidos. Durante todas as etapas de manipulação celular, ter um cuidado especial para não perturbar a superfície do hidrogel: aspirado ou médio pipeta ligeiramente derrubando a placa com vários poços de lado e tocar a ponta da pipeta na parede lateral de cada bem, ao contrário de tocar o hidrogel.
   NOTA: Com excepção para tomar especial cuidado para não danificar a superfície do hidrogel durante a manipulação padrão de cultura de tecidos, as células semearam-se sobre o ensaio de rigidez podem ser manipulados da mesma maneira como se eles foram semeadas sobrepara uma placa com múltiplas cavidades regulares.

5. imagens de células semeadas em PA Rigidez Assay

1. Células de imagem diretamente sobre o ensaio de rigidez PA.
   NOTA: Qualquer microscópio - invertido, fluorescente, ou confocal, pode ser usado para imagens de células.
   NOTA: O suporte de plástico flexível utilizado para construir o ensaio de rigidez é totalmente transparente e não autofluoresce ou interferir com imagens de células. No entanto, apesar de o próprio suporte de plástico flexível é transparente, capacidades de imagem será limitada pela distância de trabalho do objectivo. O suporte de plástico flexível tem uma espessura de 0,23 mm e uma distância de trabalho típico de uma objectiva 10X é ~ a 4 mm, para diminuir acentuadamente maiores ampliações.
   1. Para imagens de células vivas, a posição de ensaio de rigidez PA no suporte da placa de microscópio e imagem. Mantenha as sessões de imagem com menos de 2 horas, ou usar um microscópio equipado com uma câmara ambiental para tempos mais longos de imagem.
   2. Quando estou de células vivasenvelhecimento não é o objetivo, corrigir as células em solução de formaldeído 4% suplementado com 0,1% de detergente. Soak células em fixador à temperatura ambiente durante um mínimo de 2 horas. Enxágüe com PBS duas vezes. Descarte de resíduos fixador em um recipiente de resíduos designada.
      NOTA: As células podem ser visualizados de imediato ou armazenados submersa em PBS a 4 ° C durante até 2 semanas. CUIDADO: O formaldeído é tóxico por inalação e contato. Manusear com luvas em uma coifa química.
      NOTA: protocolo de fixação celular tem que ser escolhido com base nos coloração celular e manipulação de protocolos posteriores, porque certos fixadores danificar algumas proteínas celulares.
   3. No caso da imagiologia fluorescente, mancha células com coloração de células desejada directamente na placa com múltiplas cavidades fixo. Imagem imediatamente.

Resultados

Poliacrilamida (PA) hidrogéis são amplamente usadas para testar as respostas celulares dependentes de rigidez. ^17,24 por mistura de várias concentrações de acrilamida (A) e bis-acrilamida (B) pode-se fazer géis PA que abrangem a gama de rigidez da maioria dos tecidos moles em o corpo - 0,3 -.. 300 módulo de kPa Jovem ¹ No entanto, a preparação de géis de poliacrilamida é tedioso e demorado, muitas vezes limitando a sua utilidade em aplicações "high-throughput", como para a se...

Discussão

Geles de poliacrilamida, originalmente desenvolvidos para electroforese, ²⁸ são rotineiramente utilizados como substratos de cultura celular para estudar os efeitos de rigidez do substrato sobre a morfologia celular, motilidade, ^3,24,29 e comunicação entre outras características celulares. Poliacrilamida permite a manipulação de rigidez do substrato para abranger a rigidez de todos os tecidos moles do corpo (0,3-300 kPa) ¹ com uma simples mudança na concentração de precursor de ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
40% Acrylamide	Bio-Rad	161-0140
2% Bis-acrylamide	Bio-Rad	161-0142
Ammonium Persulfate	Bio-Rad	161-07000
TEMED	Sigma Aldrich	T9281
Sulfo-SANPAH	Thermo Scientific	22589
Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/ml	BD Biosciences	354236
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100
Hydrophobic solution — Repel Silane	GE Healthcare Bio-Sciences	17-1332-01
PBS (1x), pH 7.4	HyClone	SH30256.01
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit]	Elsworth Adhesives	3097358-1004
Tyrpsin/EDTA (10x)	Sigma Aldrich	44174
RPMI-1640 Medium (1x)	HyClone	SH30027-02
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30073-03
Penicillin Streptomycin	MP Biomedicals	1670046
Detergent: Triton-X	Sigma Aldrich	T8787
Formaldehyde 37% Solution	Sigma Aldrich	F1635
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A2153
BSA-based cell adhesion blocking kit — ECM Cell Adhesion Array Kit	Chemicon International	ECM540
Disposable lab equipment
flexible plastic support — GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels	GE Healthcare Bio-Sciences	309819
Glass Plates	Slumpys	GBS4100SFSL
50 ml conical tubes	Fisher Scientific	3181345107
15 ml conicals tubes	FALCON	352097
Micro centrifuge tubes	Fisher Scientific	2 ml: 02681258
96-well plate (flat bottom)	Fisher Scientific	12565501
Disposable Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml)	Fisher Scientific	1 ml: 13-678-11B, 2 ml: 05214038, 5 ml (FALCON): 357529, 10 ml: 13-678-11E, 25 ml: 13-678-11, 50 ml: 13-678-11F
Glass Transfer Pipettes	Fisher Scientific	5 3/4": 1367820A, 9":136786B
Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl)	Fisher Scientific	2707509
Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes	Fisher Scientific	13-711-9D
Parafilm	PARAFILM	PM992
Powder Free Examination Gloves	Quest	92897
Silicone spacers — Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm	Grace Bio-Labs	JTR-S-0.5
Large/non-disposable lab equipment
Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M)	Zeiss	3820005619
Microscope Software	Zeiss	AxioVision Rel. 4.8.2
UV oven	UVITRON	UV1080
Vacuum chamber/degasser	BelArt	999320237
Vacuum pump for degasser	KNF Lab	5097482
Tissue Culture Hood	NUAIRE	NU-425-600
Chemical Fume Hood	KEWAUNEE	99151
Inverted Microscope (Axiovert 25)	Zeiss	663526
Incubator	NUAIRE	NU-8500
Pipette Aid	Drummond Scientific Co.	P-76864
Hemacytometer	Bright-Line	383684