التقاط إصلاح الأنسجة في الزرد اليرقات مع الوقت الفاصل بين Brightfield Stereomicroscopy

Summary

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Abstract

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

Introduction

The ability of an organism to orchestrate tissue repair processes after injury is crucial for its survival ¹. While all animals have the capacity to heal their wounds, the extent to which tissues regenerate differs greatly among species. Vertebrate species such as zebrafish, salamanders and frog tadpoles have the remarkable ability to regenerate lost tissues, including their appendages, portions of their eyes, heart, and central nervous system ^2-4. Mammalian species, such as the African spiny mouse and rabbits, are capable of regenerating holes in their pinnae ^5-7, and humans and mice regenerate portions of their liver as well as their digit tips during fetal and juvenile stages ^8-12. Although it is not well understood yet why and how certain species regenerate tissues more effectively than others, the presence of similar genetic pathways suggests that these mechanisms may lie dormant in species without great regeneration potential ^13,14. Thus elucidating tissue repair and regeneration mechanisms in species with satisfactory regeneration outcomes will benefit regeneration in humans.

We have chosen the larval zebrafish tail fin as a paradigm to demonstrate its regeneration with time-lapse brightfield stereomicroscopy. The zebrafish larval tail fin is anatomically simple as compared to the more complex adult structures, consisting of a two-layered, infolded epithelium with somatosensory axons innervating the skin that surrounds medially located mesenchymal cells ¹⁵. Despite the anatomical differences, larval tail fin regeneration is somewhat comparable to adult fin regeneration in terms of the molecular signatures and the outgrowth responses ^16,17. As compared to the adult fin, imaging larval tail fin regeneration has however several advantages: 1) larval fin regeneration is completed within just 2-3 days ¹⁶, 2) larvae can be mounted in low-melt agarose, and 3) larvae do not require feeding until ~ 5 days post fertilization (dpf) due to the presence of the yolk sac. This makes zebrafish larvae ideal for observing tissue repair dynamics in vivo.

The presented method enables the capture of detailed dynamics underlying the early processes of fin regeneration. Many studies have utilized fluorescence-based confocal microscopy to study cellular and subcellular biological processes in embryonic and larval zebrafish. Sophisticated confocal imaging setups are however often not accessible to everyone and highly expensive as compared to other imaging techniques. In contrast, the presented methodology utilizes a Discovery V12 stereomicroscope equipped with Axiovision software and a time-lapse module, thus providing a more affordable alternative to expensive imaging equipment to examine tissue behaviors. We demonstrate that this method can be utilized for imaging tissue regeneration with high temporal resolution at a minimal cost. The implications for this method could extend beyond basic biology to advance mammalian regeneration studies using organ cultures, for therapeutic development through pharmacological and genetic screens, and it can serve as a teaching tool in a classroom setting.

Protocol

كانت ولدت الزرد (سلالة الصدف) ورفعت وفقا لبروتوكولات المعمول بها. وقدمت كل الجهود للحد من المعاناة، وذلك باستخدام 0.4 ملي تريكين للتخدير و1 ملم تريكين للقتل الرحيم. تم التعامل مع الأجنة الزرد واليرقات وفقا صارم مع ممارسة الحيوان جيدة كما وافقت عليها اللجنة المناسبة (مختبر MDI البيولوجية الحيوانية الأساسية IACUC عدد 13-20). وافقت هذه الدراسة من قبل لجنة معهد بحوث الجينوم البشري رعاية الحيوان واستخدام الوطني، MDIBL ضمان المؤسسي # A-3562-01 تحت بروتوكول # 14-09.

ملاحظة: إجراء التصوير الذي يلتقط تجديد الزعانف في يتلخص في الخطوات التالية الزرد اليرقات:

1. رفع من اسماك الزرد إلى مراحل اليرقات

1. جمع البيض ووضع ما يقرب من 50 البيض إلى 100 × 25 مم طبق بتري تحتوي على 0.03٪ ملح المحيط الفوري في الماء منزوع الأيونات تستكمل مع 0.00004٪ الميثيلين الأزرق. احتضان O / N في 28.5 درجة مئوية الحاضنة.
<لى> في صباح اليوم التالي إزالة الأجنة الميتة مع ماصة الزجاج وشطف البيض في مصفاة مع 0.03٪ ملح المحيط الفوري في الماء منزوع الأيونات (وهو ما يسمى المتوسطة الجنين).
ملاحظة: متوسطة مثل قارعو الأجراس ^{18، 18} هانكس، E2 ^{19، 20} E3، وDanieau ^{21 مايو} يكون من المفضل.
2. سوب> إضافة المتوسطة الجنين الطازجة إلى الطبق. إذا باستخدام سلالات المصطبغة، اختياريا إضافة 0.2 ملي 1-فينيل-2-ثيوريا (PTU)، وPTU سيمنع استحداث الميلانين وبالتالي تصبغ اليرقات. السماح للأجنة مواصلة تطوير في الحاضنة حتى 2 أيام بعد الإخصاب أو أي مرحلة اليرقات الأخرى المطلوبة.

2. إعداد غرفة التصوير

1. طريقة 1: التصوير غرف مصنوعة من PVC أو تفلون أنابيب (الشكل 1)
   ملاحظة: هذه الطريقة مشابهة لكونشا وآدامز (1998) ^22.
   1. الحصول على مياه الشرب البلاستيكية الصف أو تفلون أنابيب من متجر لاجهزة الكمبيوتر مع 25 ملم والخارجيدا 20 مم القطر الداخلي. قطع أنابيب لجعل حلقات من حوالي 10 مم سمك حتى مع سطح على كل جانب. استخدام> 200 حصى الصنفرة لتنعيم الحواف.
   2. تنظيف حلقات مع الماء الدافئ والايثانول 70٪ والسماح لهم الهواء الجاف.
   3. مع طرف ماصة، وتطبيق الشحوم السيليكون لنصف حلقة وإرفاق حلقة إلى 75 مم × 25 مم غطاء زجاجي زلة. بدلا من ذلك، استخدم حقنة 3 مل مليئة الشحوم السيليكون بدلا من غيض ماصة.
      ملاحظة: لأنه من الصعب إدراج الشحوم السيليكون في حقنة 3 مل، إضافة الشحوم السيليكون لحقنة 30 مل أولا واستخدام هذا لملء حقنة 3 مل.
2. طريقة 2: إعداد طبق بتري بمثابة غرفة التصوير.
   1. الحصول على 35 أو 60 مم أطباق بتري مع ساترة الزجاج تعلق على غطاء (الشكل 2A). بدلا من ذلك، كما هو مبين في الشكل (3) من ديستل وكوستر (2007) ^23، حفر فتحة صغيرة بما يكفي لحساترة القديمة إلى غطاء طبق بتري الصغيرة وتطبيق الشحوم السليكون إلى الخارج مع حقنة 3 مل. باستخدام طرف ماصة نظيفة، ونعلق بعناية جولة أو ساترة مربع من سمك المطلوب إلى الخارج (الشكل 2B).
3. للتأكد من أن الاغاروز تستخدم لتركيب إقامة ترتبط بقوة أثناء إجراء التصوير، وإرفاق شبكة بلاستيكية الجميلة داخل الحلبة. أولا، وقطع شبكة مصنوعة من نافذة الشاشة تم الحصول عليها من متجر لاجهزة الكمبيوتر، في حجم قطرها الدائري الداخلي باستخدام مقص غرامة مع زاوية. ثم قطع مستطيل صغير> ضعف حجم اليرقة إلى منتصف شبكة (الشكل 1، 2).
4. تطبيق أربعة نقاط صغيرة من غير سامة السيليكون الشحوم إلى الواجهة بين انزلاق الغطاء وحلقة الغرفة (الشكل 1A).
5. استخدام ملقط لإرفاق شبكة بقوة إلى أسفل ساترة الزجاج.

3. تركيب والتصوير من قبل ينجمحكم اليرقة (هذه الخطوة اختيارية)

ملاحظة: هذه الخطوة هي مناسبة لإجراء مقارنات بين طول الزعانف بتر ومجدد، حيث أن الطائرة بتر بعد تجديد الزعانف ليست معترف بها في يرقات الزرد.

1. يعد حل الاغاروز 0،5-1،2٪ المنخفضة للذوبان في المتوسط ​​الجنين عن تجميد للعينة.
2. تسخين الاغاروز في الميكروويف ونقل الاغاروز السائل إلى 1.5 مل أنابيب التي يتم قبل تحسنت إلى 42 درجة مئوية في كتلة التدفئة.
3. السماح للالاغاروز الساخن يبرد إلى 42 درجة مئوية، والتي لا يمكن الحفاظ عليه على مدى عدة أسابيع في درجة الحرارة هذه. في محاولة لتجنب pipetting لاليرقات إلى الاغاروز فوق 42 ° C، وهذا سيكون ضارا للحيوانات.
4. تخدير عدة اليرقات باستخدام 10 مل من 0.4 ملي تريكين (الرقم الهيدروجيني 7) في المتوسط ​​الجنين في 60 مم طبق بتري. إعداد تريكين وفقا لكتاب وصفات اسماك الزرد ^18.
   1. بدلا من ذلك، استخدم 10 مل من 1: 1000 تخفيف من 99٪ 2-فينوكسييثانول في 60 مم طبق بتري. كزة اليرقات مع توج طرف microloader ماصة لتقييم استجابة اتصال بهم قبل المتابعة. استخدام اليرقات غير متجاوبة فقط.
5. نقل يرقة واحدة إلى 42 ° C حل الاغاروز باستخدام الماصة الزجاج باستور. لا نقل السائل المفرط في الاغاروز، وإلا فإن الاغاروز سوف تضعف جدا ولا يصلب.
6. تجاهل السائل المتبقي من الماصة ونقل اليرقة مع قطرة واحدة من الاغاروز في طبق بيتري صغير (35 أو 60 مم). ضع اليرقة على جانبها للتصوير من زعنفة الذيل.
7. السماح للالاغاروز ليصلب. تقييم الاغاروز مع ماصة غيض من البلاستيك؛ سوف غيض تزج في الاغاروز إذا كان السائل أيضا. مرة واحدة وقد عززت agarose، فإن المسافة البادئة الصغيرة تكون مرئية على لمس مع طرف ماصة. وبعد التصلب، إضافة حل تريكين والمضي قدما للstereomicroscope التي سيتم استخدامها في وقت لاحق للتصوير مرور الزمن. ملاحظة: يمكن أيضا هذه الخطوة أن يؤديها من خلال وضع اليرقة تخدير على طبق بتري المغلفة مع 1.5٪ الاغاروز في المتوسط ​​الجنين.
8. استخدام stereomicroscope مع برنامج مرور الزمن. تحديد الهدف المناسب والتكبير، والتي سيتم استخدامها في وقت لاحق للتصوير مرور الزمن. هنا، استخدم 3.5 × 16 ملم العمل عن بعد عدسة الهدف على stereomicroscope. كما هو مطلوب، استخدام المجاهر البديلة والعدسات موضوعية ولكن اختيار التكبير الصحيح لتفسير محتمل س ص العائمة ونمو الزعنفة أثناء إجراء التصوير.
9. حدد طريقة الكشف عن الكاميرا على المجهر.
10. في البرنامج، حدد وضع "حي" لعرض يرقة على الشاشة.
11. فتح نافذة "خصائص" للكشف تلقائيا سطوع.
12. ضبط التباين في المجهر قاعدة العابرة للإضاءة يدويا.
13. نقل اليرقة من مجال الرؤية وتحديد ميزة تصحيح تظليل للحد من أي خلفيةايسي.
14. ضع يرقة مرة أخرى في مجال الرؤية وأخذ لقطة. حفظ الصورة.
15. إزالة الاغاروز من اليرقة عن طريق كشط لأول مرة الاغاروز قبالة الرأس. بهذه الطريقة يمكن انزلق اليرقة من الاغاروز عن طريق سحب بلطف رأسه بعيدا عن الاغاروز المتبقية مع طرف microloader الماصة توج أو دبوس الحشرات.
16. مع كوب باستور الماصة نقل اليرقة إلى حل تريكين الطازجة.

4. بتر الفحص

1. يعد حل الاغاروز 1.5٪ باستخدام الجنين المتوسطة وتصب طبقة رقيقة في طبق بتري. السماح للالاغاروز يصلب.
2. تحت stereomicroscope، وضع sideward يرقة على الاغاروز طدت وبتر زعنفة الذيل مع 23 G حقنة إبرة مع ضغط طفيف (الشكل 3A).

5. تركيب اليرقة التصوير الوقت الفاصل

1. المضي قدما كما هو موضح في الخطوات 3،1-3،5 (الشكل 3B).
2. نقل قطرة من الاغاروز السائل 0،5-1،2٪ عند 42 ° C تحتوي على اليرقة إلى الحلبة غرفة التصوير (الخطوة 2.1)، توجيه اليرقة والسماح للالاغاروز يصلب. ملء حلقة مع حل تريكين. بدلا من ذلك، إذا تم استخدام غرفة طبق بتري (الخطوة 2.2)، جبل اليرقة على ساترة غطاء وملء غطاء مع حل تريكين.
3. السماح التئام الجروح السليم أو تجديد الأنسجة أن يحدث، كشط بعناية قبالة الاغاروز المحيطة زعنفة الذيل البعيدة باستخدام طرف microloader ماصة توج أو دبوس الحشرات. حاول أن لا تجرح الزعنفة مرارا وتكرارا (الشكل 3C).
4. صب الحل تريكين تحتوي على إزالة الاغاروز وملء حلقة الغرفة مع الحل تريكين الطازجة.
5. تطبيق الشحوم السيليكون إلى أعلى الحلبة غرفة وإرفاق 75 مم × 25 مم الزجاج الشرائح. في محاولة لتجنب جيوب الهواء في الغرفة، لأنها سوف تتداخل مع التصوير brightfield وتيبس اليرقة مع مرور الوقت.
6. في حالة استخدام طبق بتري كمالغرفة التصوير، وتطبيق الشحوم السيليكون إلى حافة العلوية للغرفة السفلى وملء الغرفة السفلى مع حل تريكين. صب بعناية الحل تريكين في غطاء وتحويل غطاء على أن تزج اليرقة إلى حل تريكين من الغرفة السفلى في زاوية طفيف لتفادي جيوب الهواء. سوف تكون مختومة الغرفة بسبب الشحوم السيليكون.

التصوير 6. الوقت الفاصل

1. تجميع غرفة الحضانة ساخنة كما هو موضح في ^23،24 (الشكل 4). مكان في غرفة الحضانة في جميع أنحاء المجهر وبدوره على الحرارة. ضبط درجة الحرارة إلى 28 درجة مئوية لمدة 10 - 20 دقيقة أو حتى استقرت درجة الحرارة.
2. فتح أمام غرفة الحضانة ساخنة ووضع غرفة التصوير على موقف المجهر مع ساترة تواجه صعودا نحو الهدف.
3. ضع زعنفة اليرقات بطريقة 2/3 من مجال الرؤية تبقى غير مأهولة. وهذا يضمن القبض علىالنمو وتجديد للزعنفة على مدار إجراء التصوير دون الحاجة إلى إعادة اليرقة.
   1. ضبط اليرقة محمولة إلى 28 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ~ قبل بدء تسجيل مرور الزمن لتجنب التغيرات في كثافة brightfield أو التحولات المحتملة للالاغاروز. بدلا من ذلك، استخدام عازلة استعد مسبقا لبدء التصوير بعد الوقت للتكيف أقصر.
4. لإعداد تسجيل مرور الزمن، وفتح نافذة 6D متعددة الأبعاد اقتناء في البرنامج Axiovision وحدد الخيار ض المكدس والوقت الفاصل.
5. اختياري) في علامة التبويب ض المكدس ووضع شريحة، حدد سمك شريحة ثم اختيار وضع بدء / إيقاف.
6. تحديد موقف العلوي والسفلي من المكدس.
7. في علامة التبويب مرور الزمن، حدد الفاصل ومدة الفيلم ومن ثم يبدأ الفيلم عن طريق الضغط على زر البداية. وجدنا أن 30 دقيقة فترات كافية وهذا الفاصل الزمني لا يولد البيانات المفرط. ومع ذلك shorteويمكن استخدام فترات ص.
8. التحقق من موقف وض المكدس الأبعاد خلال الساعة الأولى إذا اليرقة لم تعدل مسبقا. إذا لزم الأمر، إعادة اليرقة مرة أخرى بعد يوم، كما يرقة قد تحولت.
9. حفظ الملف في نهاية تسجيل الوقت الفاصل بين والمضي قدما في مرحلة ما بعد المعالجة وquantifications باستخدام برامج التحليل متاح الصورة، مثل Imaris ²⁵ أو مفتوحة المصدر حزم البرمجيات صورة J ²⁶ و ²⁷ فيجي.

7. تحليل البيانات

1. تحديد طول الزعانف.
   1. فتح الفيلم الوقت الفاصل في برامج التصوير وحفظ الملفات في تنسيق ملف الملكية لتعزيز أداء البرمجيات.
   2. حدد عرض متعامد لعرض المقاطع الفردية كما مداخن المتوقعة. لتصحيح الانحراف، ضمن القائمة فيجي، حدد الإضافات، ثم التسجيل، و "3D الانجراف الصحيح". هذا وسوف تفتح نافذة فيجي وإجراء التصحيحات الانجراف. صحيحالانجراف التناوب في وظيفة البقع Imaris. بدلا من ذلك، تثبيت الإضافات StackReg وTurboReg في صورة J واستيراد لفيجي. اختيار خوارزمية التحول المطلوب في البرنامج المساعد StackReg.
   3. لقياس المسافات (على سبيل المثال، قطر الجرح أو طول الزعانف)، حدد الخيار "إضافة نقاط قياس جديدة" في شريط الأدوات العلوي الأيسر.
      1. تحت عنوان "قائمة تكوين للإحصاء مرئية القيم" في القائمة اليسرى السفلى، حدد القيم إحصاءات ليتم عرضها.
      2. في 'وضع خط "تحت علامة التبويب إعدادات اختر' أزواج (AB، CD ...)".
      3. في "تسميات خصائص" حدد "اسم" و "القطر"، لعرض المسافة بين النقطتين A و B المقبل إلى خط القياس.
      4. التبديل إلى الوضع "تحرير" والضغط على زر التحول لتحديد النقطة الأولى في نهاية الحبل الظهري. ثم استخدام نفس التكوين لتحديد النقطة الثانية على الهامش الزعنفة البعيدة.
      5. ضمن علامة التبويب "الإحصائيات"، حدد زر القرص (تصدير جميع) في أسفل اليمين لعرض وتصدير المسافة في الصورة.
      6. تكرار القياسات في أوقات محددة عن طريق تحريك شريط التمرير أسفل الصورة إلى اليمين. بدلا من إنشاء نقاط القياس الجديدة، تلك السابقة يمكن تعديل أوضاعها من خلال اختيار أول نقطة مع زر الماوس الأيسر، ثم في وقت واحد الضغط على التحول وعلى زر الماوس الأيسر في موقف جديد.
   4. بدلا من ذلك إلى الخيار نقاط القياس، واستخدام المشاهد شريحة لقياس المسافات. في وضع العرض شريحة، انتقل إلى الموضع المطلوب وانقر على المركز الأول والثاني مع زر الماوس الأيسر. سيتم عرض المسافة. هذا الخيار ولكن لا يسمح للتصدير البيانات.
2. تحديد طول الزعانف ومنطقة في يماغيج.
   1. فتح الفيلم الوقت الفاصل في يماغيج باستخدام البرنامج المساعد الذي يعترف تنسيق ملف .zvi. بدلا من ذلك، تحميل في تشوملف ickTime أو تسلسل شجار.
      ملاحظة: في حالة استخدام تنسيق ملف غير مضغوط تشاحن، لا تحتاج أبعاد الصورة لا بد من تحديدها.
   2. إذا فتح تنسيق ملف مختلف دون معلومات الملف، اختر 'مقياس تعيين "ضمن القائمة" تحليل "لتحديد أول مسافة صورة وحدة. في 'تعيين القائمة مقياس "، اكتب في" القطر بالبكسل "، تحت نوع في' المسافة المعروفة" لقيمة بكسل (وهذا يمكن الحصول عليها عن طريق قياس عدد البكسلات على شريط النطاق الذي تمت إضافته إلى الصورة ، ثم انقر فوق قياس للحصول على النتيجة)، و "وحدة من طول" (عادة "ميكرون). ثم انقر فوق موافق.
   3. لقياسات منطقة الزعانف حدد أداة "اختيار حر" في شريط الأدوات والخطوط العريضة للمنطقة الزعانف بواسطة الضغط على زر الماوس الأيسر باستمرار أثناء الرسم على طول الخطوط العريضة للزعنفة. لقياس طول الزعانف، حدد "مستقيم" أداة الخط ورسم خط بين النقاط المرادقياس.
   4. انقر فوق الخيار "قياس" تحت عنوان "تحليل" لعرض المنطقة وطول الزعنفة. كرر هذه الخطوة بقدر ما اللازمة للحصول على نقاط زمنية متعددة من الفيلم.
3. باستخدام الإحصاءات البرمجيات البيانات يمكن عرضها بيانيا.

النتائج

تقنية عرض مناسبة لتوضيح ديناميات إصلاح الأنسجة ردا على بتر. يوضح الفيلم الذي بتر الزعنفة مشغلات البداية تأثير محفظة سلسلة، وتتميز تقلصات عبر كابلات الأكتين الميوسين التي تكون موجودة في الزعنفة أضعاف ²⁸ (الشكل 5 A، B). وفي الوقت نفسه، تنبثق الخلايا من الجرح (انظر الفيلم). وبالتالي قد تقلص يكون وسيلة لطرد الخلايا التي من المرجح الموجهة للخضوع لموت الخلايا. تظهر نتائجنا أيضا أن النمو التنموي لليرقة يحدث بشكل مستقل عن تجديد (فيلم)، في حين لا بدء تجديد الزعانف حتى حوالي 14 ساعة بعد بتر مقاسا طول الزعانف والمنطقة على مدار الساعة من 36 ساعة بعد بتر (الشكل 5C ، D). وبلغ إجمالي النمو زعنفة التجدد بعد 1.5 أيام حوالي 60٪ من طول الزعانف الأصلي (الشكل 5E). أخذت معا، وهذه النتائج تثبت أن آر البتر iggers انكماش الزعانف، وقذف من الخلايا من الجرح، واستجابة التجدد تأخر زمنيا. في حين أن الخلايا مقذوف من المرجح متجهة للخضوع لموت الخلايا، وطبيعة هذه الخلايا تحتاج إلى مزيد من التوضيح.

الشكل 1. التصوير التجمع حلقة الغرفة

(A) يظهر هو حلقة من البلاستيك التي يتم تركيبها على ساترة مع الشحوم السيليكون. ومرفق شبكة بلاستيكية إلى داخل الغرفة مع أربعة نقاط صغيرة من الشحوم السيليكون. (B) يتم تعبئة غرفة تحتوي على يرقة مزودة حل تريكين ويتم إرفاق شريحة زجاجية إلى الأعلى. (C) والتي شنت يوم 2-القديم يرقة (السهم) ويظهر في أعلى التكبير لتصوير حجمه بالنسبة للشبكة."_blank"> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. التصوير غرفة جعلت الجمعية من أطباق بتري. (A) يظهر هو الزجاج التجاري الزجاج العلوي طبق بتري السفلي مع شبكة بلاستيكية تعلق على ساترة الزجاج. (ب) يظهر هو طبق بتري الغرفة التي شيدت الذاتي مع وجود ثقب حفر في غطاء وساترة المرفقة من الخارج مع الشحوم السيليكون. شبكة واليرقة هي التي شنت داخل غرفة تحتوي على حل تريكين. لختم الغرفة، يتم تطبيق الشحوم السليكون إلى العليا، الحافة الخارجية للغرفة السفلى وغطاء رأس المرفقة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

بديل ملغ = "الشكل 3" SRC = "/ الملفات / ftp_upload / 52654 / 52654fig3.jpg" />
الشكل 3. مخطط البتر وتصاعد ليرقة للتصوير. (A) لبتر، وضع اليرقة تخدير على أي طبق بتري المغلفة الاغاروز وبتر زعنفة الذيل مع إبرة حقنة. (B) للتركيب، ونقل اليرقة مع ماصة نقل في أنبوب 1.5 مل مليئة 42 ° C الاغاروز السائل وماصة قطرة تحتوي على اليرقة إلى غرفة التصوير، توجيه الأسماك وتغطية عزز الاغاروز مع الجنين المتوسطة. (C) كشط قبالة الاغاروز من زعنفة الذيل باستخدام microloader ماصة توج أو أداة مماثلة، واستبدال الجنين المتوسطة مع المتوسطة الطازجة. (D) صورة زعنفة الذيل تحت stereomicroscope. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

ithin صفحة = "دائما">
الرقم 4. غرفة الحضانة ساخنة-شيدت الذاتي. (AC) يظهر هو غرفة الحضانة ساخنة مصنوعة من الورق المقوى، والتفاف فقاعة والفيلكرو. وترد سخان قبة سلكي (المصممة أصلا لبيضة الدجاج الحضانة) إلى غرفة باستخدام شريط الألمنيوم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5. ديناميات تجديد مؤشرات مالية (A) مخطط الذيل تستخدم الزعانف فحص البتر والكمي طريقة لتحديد طول الزعانف (السهم الأحمر) والمنطقة (مخطط الحمراء للزعنفة). (B) الذيل بتر الزعنفة مشغلات البداية انكماش الزعنفة، تليها REGEثمرة الأنسجة nerative. يخضع الزعنفة أيضا النمو التنموي، كما يتضح من زيادة حجم الجانبية. (C) يظهر هو طول الزعانف بوصفها وظيفة من الزمن، وكشف عن انطلاق النمو التجديدي الخطي في ~ 14 HPA. (D) الكمي لمنطقة الزعانف يكشف عن انخفاض في البداية في الحجم، والتي يمكن أن تعزى إلى تقلص الزعنفة. بعد ~ 14 ساعة، ويزيد من حجم الزعانف بمعدل خطي. (E) مقارنة طول الزعنفة قبل بتر وبعد 36 ساعة معارض ~ 60٪ إعادة نمو. شريط مقياس: 100 ميكرون المختصرات: قبل أمبير، قبل بتر. آخر ساعة البتر، HPA. مغذي، وتجديد. أمبير، بتر الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيلم . تجديد زعنفة على مدار الساعة من 36ساعة. المعروضة زعنفة ذيل يرقة القديمة 2.5 يوما خلال التجدد. وبدءا تصوير 30 دقيقة بعد بتر النمو التجديدي في 30 دقيقة فترات على stereomicroscope باستخدام عدسة الهدف 3.5X.

Discussion

يسمح الطريقة المعروضة لرصد التئام الجروح وترميم الأنسجة في العيش اليرقات الزرد في الجسم الحي مع مرور الزمن التصوير على stereomicroscope brightfield، وذلك باستخدام بسيط نسبيا مجموعة المتابعة. يتطلب هذا الإجراء بعض الجوانب الهامة التي اختبرناها، والتي سوف تحسين نتائج: 1) تركيزات منخفضة الاغاروز (~ 0.5٪) وتقليل العوائق نمو اليرقات الزرد تزايد مستمر، 2) إزالة الاغاروز حول زعنفة مهمة لا لإخفاء عملية الشفاء، 3) محاصرة الاغاروز في شبكة بلاستيكية تحتفظ الاغاروز والحيوانية في وضع مستقر في جميع أنحاء الداخلي، و4) بيئة تسيطر عليها درجة الحرارة المناسبة، وهو أمر ضروري لبقاء اليرقات. تكيفنا حضانة غرفة ساخنة ^23،24، الذي يستخدم التفاف فقاعة التي سجلت على الورق المقوى، وسخان قبة سلكي للسيطرة على درجة الحرارة ودوران الهواء السليم مع تقلبات طفيفة خلالإجراء التصوير. هذه الغرفة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة يمكن أن تكون على استعداد لتناسب أي المجهر. وقد استخدمت وغرفة الحضانة ساخنة مماثلة أيضا بالنسبة للفئران التصوير والتنمية فرخ ^24،29.

ونقترح أن اليرقات بترت قبل هي التي شنت لصورة ما قبل البتر، demounted للبتر، وremounted للتصوير مرور الزمن. على الرغم من أنه من الممكن لتنفيذ هذه الخطوات في خطوة واحدة في غرفة التصوير النهائية، في تجربتنا وجدنا أن بتر زعنفة الذيل على ساترة الزجاج ليس الأمثل، لأنه يمزق الأنسجة و لا يؤدي إلى قطع نظيفة. طريقة بتر القائم على الاغاروز باستخدام إبرة حقنة ووصف في الأصل من قبل كواكامي وزملاؤه (2004) ¹⁶ وأيضا، في تجربتنا، مثالية لأداء بتر الأطراف. وهكذا، فإن سلسلة معقدة بدلا من الخطوات التي قدمناها له ما يبرره جيدا ويضمن نتيجة تجديد المثلى.

أظهرنا أن larvآل الزرد في 2 DPF ولا يمكن تصوير ما يصل إلى 1.5 أيام في الاغاروز وحل تريكين. كنا تريكين (PH7) الحل الأمثل درجة الحموضة أعد مع الملح المحيط الفوري، والتي لا تتعارض مع صحة العينة للفترة التصوير المقدمة. ونحن مع ذلك سابقا أظهرت أيضا أن استخدام تريكين في Danieau المتوسطة يسمح الوقت الفاصل بين التصوير من 2.5 DPF الزرد اليرقات على المجهر متحد البؤر لا يقل عن 2 أيام ^30. وهكذا، يمكن أن الظروف المثلى عازلة تمتد الصحة اليرقات وطول التصوير. بدلا من ذلك، يمكن استخدام تركيزات أقل تريكين للتخدير، أو 2-فينوكسييثانول، التي وجدنا جيد التحمل خلال مراحل اليرقات والكبار عند 28 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 60 ساعة.

لتجنب عيوب في تجديد الزعانف، ونحن إزالة الاغاروز من زعنفة الذيل قبل التصوير. بياناتنا تظهر أنه في غضون 1.5 أيام تمت إعادة إنشاء الزعنفة إلى حوالي 60٪. هذا المعدل تجديد يتسق مع دراسة سابقة تحديد 3 أيام فيليالي متوسط ​​الوقت للزعنفة الذيل تجديد في يرقات الزرد تصل إلى 6 DPF ^16. بيد أنه يمكن استخدام أساليب بديلة لالاغاروز لتركيب الأسماك للتصوير. على سبيل المثال، جلطات البلازما رقيقة ³¹ أو المفلورة الإثيلين والبروبيلين (محطة إثراء الوقود) أنابيب المغلفة مع ميثيل ومليئة تركيزات الاغاروز منخفضة جدا (0.1٪) وقد أوصى للضوء ورقة المجهري ³² و قد تكون مناسبة لأسلوبنا المقدمة. ومع ذلك، فإننا لا ننصح ميثيل و 0.1٪ الاغاروز، لأنها تتطلب أن العينة هي التي شنت على الجزء السفلي من الغرفة نظرا لعدم وجود تصلب هذه الوسائط. سوف تركيزات عالية جدا من ميثيل تولد علاوة على ذلك جيوب الهواء بناء على خبرتنا، وهذه قد تتداخل مع إجراء التصوير. إذا فضلت وسائل الإعلام هذه مع استخدام الغرفة السفلى، من المهم أن المسافة العمل المناسبة بين عدسة موضوعية والعينة موجودة. وتجدر الإشارة إلى أن مويوصى إيثيل سيللولوز كوسيلة تصاعد فقط لمدة تصل إلى 1 في اليوم، لأنها قد تتداخل مع صحة اليرقات ^32.

تركيب العينة في الغطاء قد يؤدي إلى بطء الانجراف نحو الانخفاض الجاذبية. لذا فمن المستحسن أن صورة مقاطع متعددة في كل نقطة زمنية، والتي يمكن أن تكون إما المتوقعة في طائرة واحدة أو الصور فقط التي هي في المستوى البؤري يمكن استخراجها لتجميع الفيلم النهائي. يمكن تصوير العينة في الغرفة السفلى تكون منهجية بديلة لتجنب الانجراف نحو الانخفاض المحتمل. جلطات البلازما يمكن أن تكون مفيدة لتجنب الانجراف، والبلازما ستتمسك طبقة يغلف الخارجية (EVL، محيط بالأدمة) ^31، وبالتالي قد استقرار العينة. ولكن هذا يحتاج لفحصها، وكذلك كيف يمكن الحفاظ على الزرد اليرقات طويلة في تجلط البلازما دون التدخل في الصحة اليرقات أو تجديد الزعانف.

تم تجميعها دينا فيلم استخدام المقاطع الفردية (26 ميكرون)من سجلت ض المكدس، الذي غطى سمك الكامل للزعنفة (~ 10 ميكرون)، والتي تمثل المحتملين ض الانجراف الزعنفة أثناء إجراء التصوير. من أجل الحفاظ على المعلومات 3-D، فمن الممكن أيضا أن المشروع مداخن-Z في الصور واحدة. لأن هذا قد يؤدي إلى التشويش من الصورة، قد يكون المطلوب brightfield إزالة التفاف. البرامج، مثل Deconvolve أو X3 Autoquant يمكن استخدامها لهذا الغرض. بدلا من ذلك، خوارزميات رياضية (الموصوفة في تادرس ³³⁾ يمكن تطبيقها للحصول على وظيفة نقطة انتشار نسبة عالية إشارة إلى الضوضاء (SNR). الحصول على SNR عالية تمثل واحدة من العقبات الرئيسية في brightfield إزالة التفاف. على الرغم من أن هذه الطريقة يتطلب التباين العالي ورقيقة سمك العينة، سيكون من المناسب للتصوير من زعنفة الذيل نتيجة لانخفاض عرضه.

وهناك ميزة واضحة عن طريقة التصوير قدمت هو أنه قابل للتكيف بسرعة إلى أي stereomicroscope مجهزة كاميرا CCDد البرمجيات الوقت الفاصل بين ويقدم بديلا منخفض التكلفة لأنظمة التصوير متحد البؤر أكثر تكلفة. في حين أن هذا الأسلوب لا تستخدم مضان للكشف عن الخلايا، ويمكن تمديدها لهذه التطبيقات من خلال استخدام نظام آلي للتحكم في مصراع وبعد التصوير إزالة التفاف البرمجيات ^34. وهذا من شأنه تمكين المستخدمين لمواصلة مراقبة عمليات إصلاح الجرح وتجديد مع خلية واحدة أو قرار التحت خلوية على مدى فترات زمنية أطول.

وضوح بصري والسهولة التي الجنينية والزرد اليرقات يمكن التعامل معها، والقدرة على التكيف من هذا الأسلوب لأي stereomicroscope يجعلها مناسبة لتدريس علم الأحياء الفقارية الأساسي في إعداد الفصول الدراسية. يمكن لهذا الأسلوب تزويد الطلاب بفهم أفضل للعمليات البيولوجية الأساسية الكامنة وراء إصلاح الأنسجة وتجديدها. العمليات البيولوجية الأخرى التي تم التقاطها باستخدام طريقة مماثلة هي التطور الجنيني الزرد ^23،34 والقلبوظيفة (غير منشورة). هذا الأسلوب يوفر أيضا إمكانية لإصلاح مراقبة الجرح وتجديد في اليرقات التي تم التلاعب بها وراثيا ودواء.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Bullseye Agarose (MidSci, Cat. No. BE-GCA500)
Low-melt agarose (Fisher BioReagents, Cat No. BP1360-100)
1-phenyl-2-thiourea [Alfa Aesar, Cat No. L06690]
Instant Ocean Aquarium Salt (Pet store)
Methylene Blue (0.1% solution) (Sigma, Cat. No. M9140)
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, Sigma-Aldrich, Cat. No. E10505)
2-Phenoxyethanol (Sigma-Aldrich, Cat. No. 77699)
Petri Dish 35 x 15 mm (BD Falcon, Cat. No 351008)
Petri Dish 60 x 15 mm (BD Falcon, Cat. No 351007)
Petri Dish 100 x 25 mm (BD Falcon, Cat. No 351013)
5.75 inch boroschillate glass pipets (Fisher)
35 mm Glass Top Glass Bottom Dish (MatTek Corporation, Cat No. D35-20-0-TOP) Glass: 0.085-0.115mm
Superfrost/Plus microscope slides (Fisherbrand, Cat No. 12-550-15)
Glass coverslips (Electron Microscopy Services, Cat No. 72191-75)
Glass coverslips (Warner Instruments, Cat. No. CS-18R15)
Phifer Phiferglass Insect Screen Charcoal - 48" (Home Depot)
DOW CORNING® HIGH VACUUM GREASE
Microloader pipette tips 20 µl (Eppendorf, Cat. No. 930001007)
Fine Scissors - Sharply Angled Up (Fine Science Tools, Cat. No. 14037-10)
3 mL Luer-Lok™ disposable syringe (BD, Cat. No. 309657)
60 mL Luer-Lok™ disposable syringe (BD, Cat. No. 309653)
23-gauge syringe needles (BD, Cat. No. 305145)
Dumont #5 Forceps (Fine Science Tools, Cat. No. 11295-00)
Equipment
LabDoctor Mini Dry Bath (MidSci)
Zeiss Discovery.V12 compound microscope
Zeiss Plan Apo S 3.5X objective
Zeiss AxioCam MRm
Zeiss Axiovision software, Release 4.8.2SP1 (12-2011)