Catturare Tissue Repair in Zebrafish Larve con Time-lapse Brightfield stereomicroscopia

Riepilogo

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Abstract

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

Introduzione

The ability of an organism to orchestrate tissue repair processes after injury is crucial for its survival ¹. While all animals have the capacity to heal their wounds, the extent to which tissues regenerate differs greatly among species. Vertebrate species such as zebrafish, salamanders and frog tadpoles have the remarkable ability to regenerate lost tissues, including their appendages, portions of their eyes, heart, and central nervous system ^2-4. Mammalian species, such as the African spiny mouse and rabbits, are capable of regenerating holes in their pinnae ^5-7, and humans and mice regenerate portions of their liver as well as their digit tips during fetal and juvenile stages ^8-12. Although it is not well understood yet why and how certain species regenerate tissues more effectively than others, the presence of similar genetic pathways suggests that these mechanisms may lie dormant in species without great regeneration potential ^13,14. Thus elucidating tissue repair and regeneration mechanisms in species with satisfactory regeneration outcomes will benefit regeneration in humans.

We have chosen the larval zebrafish tail fin as a paradigm to demonstrate its regeneration with time-lapse brightfield stereomicroscopy. The zebrafish larval tail fin is anatomically simple as compared to the more complex adult structures, consisting of a two-layered, infolded epithelium with somatosensory axons innervating the skin that surrounds medially located mesenchymal cells ¹⁵. Despite the anatomical differences, larval tail fin regeneration is somewhat comparable to adult fin regeneration in terms of the molecular signatures and the outgrowth responses ^16,17. As compared to the adult fin, imaging larval tail fin regeneration has however several advantages: 1) larval fin regeneration is completed within just 2-3 days ¹⁶, 2) larvae can be mounted in low-melt agarose, and 3) larvae do not require feeding until ~ 5 days post fertilization (dpf) due to the presence of the yolk sac. This makes zebrafish larvae ideal for observing tissue repair dynamics in vivo.

The presented method enables the capture of detailed dynamics underlying the early processes of fin regeneration. Many studies have utilized fluorescence-based confocal microscopy to study cellular and subcellular biological processes in embryonic and larval zebrafish. Sophisticated confocal imaging setups are however often not accessible to everyone and highly expensive as compared to other imaging techniques. In contrast, the presented methodology utilizes a Discovery V12 stereomicroscope equipped with Axiovision software and a time-lapse module, thus providing a more affordable alternative to expensive imaging equipment to examine tissue behaviors. We demonstrate that this method can be utilized for imaging tissue regeneration with high temporal resolution at a minimal cost. The implications for this method could extend beyond basic biology to advance mammalian regeneration studies using organ cultures, for therapeutic development through pharmacological and genetic screens, and it can serve as a teaching tool in a classroom setting.

Protocollo

Zebrafish (ceppo madreperla) sono stati allevati e cresciuto secondo i protocolli stabiliti. Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo la sofferenza, con 0,4 Tricaine mM per l'anestesia e 1 Tricaine mM per l'eutanasia. Zebrafish embrioni e larve sono state gestite in stretto accordo con le buone pratiche animale come approvato dalla commissione competente (Laboratorio MDI Biological animale nucleo IACUC numero 13-20). Questo studio è stato approvato dall'Istituto Human Genome Research cura degli animali e uso Comitato Nazionale, MDIBL istituzionale Assurance # A-3562-01 sotto protocollo # 14-09.

Nota: La procedura di imaging in grado di catturare la rigenerazione pinna zebrafish larvale è riassunta nei seguenti punti:

1. Raccolta di Zebrafish di stadi larvali

1. Raccogliere le uova e mettere circa 50 uova in una capsula di Petri di 100 x 25 mm contenente 0,03% di sale Ocean istantanea in acqua deionizzata integrato con 0,00004% blu di metilene. Incubare O / N in un incubatore a 28.5 °.
2. Il mattino dopo rimuovere gli embrioni morti con una pipetta di vetro e lavare le uova in un colino con il 0,03% di sale Ocean istantanea in acqua deionizzata (medio dell'embrione chiamato).
   Nota: Media come Ringers ^18, Hanks ^18, E2 ^19, E3 ^20, e Danieau ²¹ può essere preferibile.
3. sup> Aggiungi medio embrione fresco al piatto. Se utilizzando ceppi pigmentati, opzionalmente aggiungere 0,2 mM 1-fenil-2-tiourea (PTU), come PTU impedirà melanogenesi e quindi la pigmentazione delle larve. Lasciate che gli embrioni si sviluppano ulteriormente in incubatrice fino a 2 giorni dopo la fecondazione o qualsiasi altra fase larvale desiderato.

2. Preparazione di sezione Imaging

1. Metodo 1: Imaging camere in PVC o tubi in Teflon (Figura 1)
   Nota: Questo metodo è simile a Concha e Adams (1998) ^22.
   1. Acquisire grado di plastica di acqua potabile o di tubi in Teflon da un negozio di ferramenta con una esterna 25 millimetrida 20 millimetri di diametro interno. Tagliare il tubo per fare anelli di circa 10 mm di spessore con una superficie piana su ogni lato. Utilizzare> 200 carta vetrata a grana per lisciare i bordi.
   2. Pulire gli anelli con acqua calda e il 70% di etanolo e lasciare asciugare all'aria.
   3. Con un puntale, applicare grasso al silicone alla metà di un anello e fissare l'anello a x 25 mm vetrino di vetro 75 mm. In alternativa, utilizzare una siringa da 3 ml riempita con grasso al silicone al posto di una punta della pipetta.
      Nota: Poiché è difficile inserire il grasso siliconico nella siringa 3 ml, aggiungere il grasso al silicone in una siringa da 30 ml prima e di utilizzare per il riempimento della siringa 3 ml.
2. Metodo 2: Preparazione di un piatto Petri come camera di imaging.
   1. Acquisire 35 o 60 mm di diametro Petri con un coprioggetto di vetro fissato al coperchio (Figura 2A). In alternativa, come illustrato nella figura 3 Distel & Koester (2007) ^23, praticare un'apertura piccola abbastanza da hvecchio un coprioggetto nel coperchio di una piccola capsula di Petri e applicare grasso al silicone all'esterno con una siringa 3 ml. Usando una pipetta pulita, applicare accuratamente una rotonda o quadrata coprioggetto di spessore desiderato verso l'esterno (Figura 2B).
3. Per garantire che l'agarosio utilizzato per soggiorni saldamente attaccati durante la procedura di imaging di montaggio, collegare una rete di plastica multa all'interno dell'anello. In primo luogo, tagliare la maglia fatta di schermo di finestra ottenuto da un negozio di ferramenta, nella dimensione del diametro dell'anello interno con le forbici bene con un angolo. Poi tagliare un piccolo rettangolo> due volte la dimensione della larva al centro della maglia (figura 1, 2).
4. Applicare quattro piccoli punti di grasso al silicone non tossico per l'interfaccia tra il vetrino e l'anello camera (Figura 1A).
5. Usare pinze per fissare la maglia saldamente al fondo del vetrino di vetro.

3. Montaggio e imaging del Pre-injrato Larva (questo passaggio è facoltativo)

Nota: Questo passaggio è adatto per il confronto tra la lunghezza della pinna amputata e rigenerata, mentre l'aereo amputazione dopo la rigenerazione pinna non è riconoscibile in larve di zebrafish.

1. Preparare una soluzione di agarosio 0.5-1.2% bassofondente nel mezzo embrioni per l'immobilizzazione del campione.
2. Riscaldare l'agarosio in un forno a microonde e trasferire il liquido in agarosio 1,5 ml tubi che vengono pre-riscaldato a 42 ° C in un blocco di riscaldamento.
3. Sia l'agarosio calda raffreddare a 42 ° C, che può essere mantenuta per diverse settimane a questa temperatura. Cercate di evitare pipettare le larve in agarosio sopra 42 ° C, in quanto questo sarà dannoso per gli animali.
4. Anestetizzare vari larve utilizzando 10 ml di 0,4 Tricaine mM (pH 7) in mezzo embrione in un piatto Petri del diametro di 60 mm. Preparare il Tricaine secondo le Zebrafish libro Ricette ^18.
   1. In alternativa, utilizzare 10 ml di una diluizione 1: 1000 99% 2-fenossietanolo in un piatto Petri del diametro di 60 mm. Poke le larve con una punta microloader pipetta capped per valutare la loro risposta al tocco prima di procedere. Utilizzare solo le larve non risponde.
5. Trasferire una larva nel C soluzione di agarosio 42 ° con una pipetta Pasteur di vetro. Non trasferire il liquido eccessivo nella agarosio, altrimenti il ​​agarosio sarà troppo diluito e non solidificare.
6. Eliminare il liquido rimanente dalla pipetta e trasferire la larva con una goccia di agarosio in una piccola scatola di Petri (35 o 60 mm di diametro). Posizionare la larva su un lato per l'imaging della pinna caudale.
7. Lasciare che il agarosio solidificare. Valutare l'agarosio con una pipetta di plastica; la punta si immergono nel agarosio se è troppo liquido. Una volta che l'agarosio si è solidificato, una piccola rientranza sarà visibile dopo aver toccato con la punta della pipetta. A seguito di solidificazione, aggiungere la soluzione Tricaine e procedere alla stereomicroscopio che verrà utilizzato in seguito per l'imaging time-lapse.
   Nota: Questa fase può essere eseguita anche posizionando la larva anestetizzato su un piatto Petri rivestito con 1,5% agarosio in mezzo embrione.
8. Utilizzare uno stereomicroscopio con software time-lapse. Selezionare un obiettivo e l'ingrandimento del caso, che sarà utilizzato in seguito per l'imaging time-lapse. Qui, utilizzare un 3.5 x 16 millimetri, distanza di lavoro lente obiettiva su uno stereomicroscopio. Come desiderato, utilizzare microscopi alternativi e lenti dell'obiettivo, ma scegliere un ingrandimento adeguato per tenere conto di potenziali xy-drift e la crescita della pinna durante la procedura di imaging.
9. Selezionare la modalità di rilevazione telecamera sul microscopio.
10. Nel software, selezionare la modalità 'live' per vedere la larva sullo schermo.
11. Aprire la finestra 'Proprietà' per rilevare automaticamente la luminosità.
12. Regolare manualmente il contrasto al microscopio trans-illuminazione di base.
13. Spostare la larva fuori del campo visivo e selezionare la funzione Correzione Shading per minimizzare sfondo noise.
14. Posizionare la larva di nuovo nel campo visivo e scattare una foto. Salvare l'immagine.
15. Rimuovere l'agarosio dalla larva dalla prima raschiando il agarosio la testa. In questo modo la larva può essere scivolato fuori dal agarosio tirando delicatamente la testa dal agarosio rimanente con una ridotta punta microloader pipetta o un perno insetto.
16. Con una pipetta Pasteur di vetro trasferire la larva in soluzione Tricaine fresco.

4. Amputazione Assay

1. Preparare una soluzione di agarosio 1,5% con media embrione e versare uno strato sottile in una capsula di Petri. Lasciate che il agarosio solidificare.
2. Sotto uno stereomicroscopio, posizionare il sideward larva sul agarosio solidificato e amputare la pinna di coda con un G siringa 23 con una leggera pressione (Figura 3A).

5. Montaggio del Larva per Time-lapse imaging

1. Procedere come descritto nei passaggi 3,1-3,5 (Figura 3B).
2. Trasferire un calo del 0,5-1,2% agarosio liquido a 42 ° C contenente la larva nell'anello camera di imaging (passo 2,1), orientare la larva e lasciare che il agarosio solidificare. Riempire l'anello con soluzione Tricaine. In alternativa, se la camera di scatola di Petri (punto 2.2) è utilizzato, montare la larva sul vetrino coperchio e riempire il coperchio con la soluzione Tricaine.
3. Per consentire una corretta guarigione della ferita o la rigenerazione dei tessuti a verificarsi, raschiare con cura l'agarosio circonda la pinna caudale distale con un tappo tip microloader pipetta o un perno insetto. Cercate di non danneggiare la pinna ripetutamente (Figura 3C).
4. Decantare la soluzione Tricaine contenente il rimosso agarosio e riempire l'anello da camera con soluzione Tricaine fresca.
5. Applicare grasso al silicone all'inizio dell'anello camera e collegare un x 25 mm vetrino 75 mm. Cercate di evitare sacche d'aria nella camera, in quanto interferiscono con l'imaging campo chiaro e essiccare la larva nel tempo.
6. Se si utilizza una capsula di Petri comeuna camera di imaging, applicare grasso al silicone al bordo superiore della camera inferiore e riempire la camera inferiore con soluzione Tricaine. Decantare attentamente la soluzione Tricaine nel coperchio e ruotare il coperchio verso immergere la larva nella soluzione Tricaine della camera inferiore con una leggera angolazione per evitare sacche d'aria. La camera viene sigillato a causa del grasso al silicone.

6. Time-lapse imaging

1. Assemblare una camera di incubazione riscaldata come descritto in ^23,24 (figura 4) .Rimontare camera umida intorno al microscopio e accendere il calore. Regolare la temperatura a 28 ° C per circa 10 - 20 min o fino a quando la temperatura si è stabilizzata.
2. Aprire la parte anteriore della camera di incubazione riscaldata e posizionare la camera di imaging sul supporto microscopio con coprioggetto rivolto verso l'alto verso l'obiettivo.
3. Posizionare la pinna larvale in modo che 2/3 del campo visivo rimane non occupato. Questo assicura la cattura delcrescita e la rigenerazione della pinna nel corso della procedura di imaging senza dover riposizionare la larva.
   1. Regolare la larva montato a 28 ° C per ~ 30 minuti prima di iniziare la registrazione time-lapse di evitare cambiamenti di intensità campo chiaro o potenziali spostamenti della agarosio. In alternativa, utilizzare buffer di pre-riscaldato per avviare l'imaging dopo tempo di regolazione più brevi.
4. Per impostare la registrazione time-lapse, aprire la finestra 6D Multidimensionale acquisizione nel software AxioVision e selezionare l'opzione z-stack e time-lapse.
5. Opzionale) Nella scheda z-stack e modalità Slice, selezionare lo spessore della fetta e quindi selezionare la modalità di Start / Stop.
6. Definire la posizione superiore e inferiore della pila.
7. Nella scheda time-lapse, selezionare l'intervallo e la durata del film e quindi avviare il filmato premendo il pulsante di avvio. Abbiamo scoperto che intervalli di 30 min sono sufficienti e questo intervallo non genera dati eccessivo; tuttavia shortepossono essere utilizzati intervalli r.
8. Controllare le dimensioni di posizione e z-stack durante la prima ora, se la larva non è stato pre-regolato. Se necessario, riposizionare la larva dopo un giorno, come la larva può essere spostato.
9. Salvare il file alla fine della registrazione time-lapse e procedere con la post-elaborazione e quantificazioni utilizzando disponibili software di analisi dell'immagine, come ad esempio Imaris ²⁵ o l'open source software Immagine J ²⁶ e ²⁷ Fiji.

Analisi 7. I dati

1. Determinare la lunghezza della pinna.
   1. Aprire il filmato time-lapse nel software di imaging e salvare i file nel formato file proprietario per migliorare le prestazioni del software.
   2. Selezionare la vista ortogonale per visualizzare le sezioni individuali come stack proiettate. Per la correzione della deriva, sotto il menu Fiji, selezionate Plugin, quindi registrazione, e 'corretto deriva in 3D'. Si aprirà una finestra Fiji ed effettuare le correzioni di deriva. Correttoderiva di rotazione in funzione Spots Imaris. In alternativa, installare i plugin StackReg e TurboReg in immagine J e importare a Fiji. Scegliere l'algoritmo trasformazione desiderata nel plugin StackReg.
   3. Per misurare le distanze (ad esempio, diametro della ferita o lunghezza fin), selezionare l'opzione 'aggiungere nuovi punti di misura "nella barra degli strumenti in alto a sinistra.
      1. Sotto 'lista Configura Statistiche visibili valori' nel menu in basso a sinistra, selezionare i valori delle statistiche da visualizzare.
      2. Nella 'Modalità Line' nella scheda Impostazioni selezionare 'Pairs (AB, CD ...).
      3. In 'Etichette Proprietà' select 'Nome' e 'Distance', per mostrare la distanza tra i punti A e B accanto alla linea di misura.
      4. Passare alla modalità 'Modifica' e tenere premuto il tasto Maiusc per selezionare il primo punto alla fine della notocorda. Quindi utilizzare la stessa configurazione per selezionare il secondo punto sul margine distale della pinna.
      5. Nella scheda 'Statistiche', selezionare il pulsante del disco (Esporta tutto) in basso a destra per visualizzare ed esportare la distanza nell'immagine.
      6. Ripetere le misurazioni a volte selezionati spostando il cursore sotto l'immagine a destra. Invece di creare nuovi punti di misura, quelli precedenti possono essere riposizionati selezionando prima il punto con il tasto sinistro del mouse, quindi contemporaneamente premendo il cambio e il tasto sinistro del mouse nella nuova posizione.
   4. In alternativa all'opzione punti di misura, utilizzare lo spettatore fetta per misurare le distanze. Nella modalità di visualizzazione fetta, scorrere fino alla posizione desiderata e fare clic sulla prima e seconda posizione con il tasto sinistro del mouse. Verrà visualizzata la distanza. Questa opzione però non consente l'esportazione di dati.
2. Determinare la lunghezza della pinna e l'area in ImageJ.
   1. Aprire il filmato time-lapse in ImageJ utilizzando un plugin che riconosce il formato di file .zvi. In alternativa, caricare in un Qufile di ickTime o una sequenza tiff.
      Nota: Se si utilizza un formato di file TIFF non compresso, le dimensioni dell'immagine non devono essere specificati.
   2. Se l'apertura di un formato di file diverso senza le informazioni sul file, selezionare 'Set Scale' nel menu 'Analizza' per definire prima la distanza dell'immagine e l'unità. Nel 'Set menu Scala', digitare il 'Distanza in pixel', sotto digitare la 'distanza nota' per il valore di pixel (questo può essere ottenuto misurando il numero di pixel su una barra di scala che è stato aggiunto all'immagine , quindi fare clic su Misura per ottenere il risultato), e la 'Unità di lunghezza' (tipicamente 'micron'). Quindi fare clic su OK.
   3. Per pinna misurazioni dell'area selezionare lo strumento 'selezione a mano libera' nella barra degli strumenti e delineano l'area fin tenendo premuto il tasto sinistro del mouse mentre si disegna lungo il contorno della pinna. Per le misure di lunghezza pinna, selezionare la 'dritta' strumento linea e tracciare una linea tra i punti desiderati per esseremisurata.
   4. Selezionare l'opzione 'Misura' sotto 'Analizza' per visualizzare l'area e la lunghezza della pinna. Ripetere questo passo con la frequenza necessaria per più punti di tempo del film.
3. Utilizzando le statistiche software i dati possono essere visualizzati graficamente.

Risultati

La tecnica presentato è adatto per chiarire dinamiche riparazione tissutale in risposta all'amputazione. Il film dimostra che amputazione della pinna innesca inizialmente un effetto a borsa di caratterizzata da contrazioni tramite cavi actina-miosina presenti nella pinna volte ²⁸ (Figura 5 A, B). Contemporaneamente, le cellule vengono estrusi dalla ferita (vedi filmato). La contrazione può quindi essere un mezzo per espellere cellule che sono probabilmente destinati a subire morte cellulare. I nostri risultati dimostrano inoltre che la crescita dello sviluppo della larva si verifica indipendentemente rigenerazione (film), mentre la rigenerazione pinna non avvia fino a circa 14 ore dopo l'amputazione, misurata in base alla lunghezza della pinna e l'area nel corso tempo di 36 ore dopo l'amputazione (Figura 5C , D). La crescita fin rigenerativa totale dopo 1,5 giorni è stato circa il 60% della lunghezza della pinna originale (Figura 5E). Presi insieme, questi risultati dimostrano che l'amputazione tr Iggers contrazione pinna, estrusione di cellule dalla ferita, e una risposta rigenerativa temporalmente ritardata. Mentre le cellule estrusi sono probabilmente destinate a subire la morte delle cellule, la natura di queste cellule deve essere ulteriormente chiarita.

Figura 1. Imaging gruppo anello di camera

(A) si riporta un anello di plastica che è collegato a un coprioggetto con grasso al silicone. Una maglia di plastica è attaccato all'interno della camera con quattro piccoli punti di grasso al silicone. (B) La camera contenente la larva montato è riempito con una soluzione Tricaine e un vetrino è attaccato alla parte superiore. (C) Un sospesa 2 giorni di età larva (freccia) è mostrato un ingrandimento maggiore per descrivere la sua dimensione in relazione alla mesh."_blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Camera Imaging montaggio fatto da piastre di Petri. (A) si riporta un bicchiere top bottom capsula di Petri di vetro commerciale con una rete di plastica attaccato al coprioggetto di vetro. (B) mostrato è un piatto Petri camera di auto-costruito con un foro nel coperchio e un coprioggetto attaccato dall'esterno con grasso siliconico. La rete e la larva sono montati all'interno della camera contenente soluzione Tricaine. Per sigillare la camera, grasso siliconico è applicato alla tomaia, bordo esterno della camera di fondo e il coperchio superiore fissato. Fare click qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Schema di amputazione e il montaggio di una larva per l'imaging. (A) per amputazione, posizionare un larva anestetizzato su un piatto Petri agarosio rivestite e amputare la pinna di coda con un ago della siringa. (B) Per il montaggio, trasferire la larva con una pipetta di trasferimento in una provetta da 1,5 ml riempito con 42 ° C agarosio liquido e pipetta una goccia contenente la larva nella camera di imaging, orientare il pesce e coprire il solidificato agarosio con media embrione. (C) Raschiare il agarosio dalla pinna caudale con una microloader pipetta punta ridotta o un attrezzo simile e sostituirlo media embrione con terreno fresco. (D) Immagine pinna caudale allo stereomicroscopio. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Self-costruito camera di incubazione riscaldata. (AC) si riporta una camera di incubazione riscaldata in cartone, pluriball e velcro. Un riscaldatore cupola cablata (originariamente progettato per uova di gallina incubazione) è collegato alla camera con del nastro di alluminio. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. dinamiche di rigenerazione Fin. (A) Schema del metodo amputazione analisi e quantificazione pinna caudale utilizzato per determinare la lunghezza della pinna (freccia rossa) e l'area (contorno rosso della pinna). (B) Tail amputazione fin innesca inizialmente contrazione della pinna, seguito da Regeescrescenza tessuti nerative. La pinna subisce anche la crescita dello sviluppo, come dimostra l'aumento delle dimensioni laterali. (C) è riportata la pinna di lunghezza in funzione del tempo, rivelando una partenza crescita rigenerativa lineare a ~ 14 hpa. (D) Quantificazione dell'area fin rivela un inizialmente diminuire in dimensioni, che può essere attribuito alla contrazione della pinna. Dopo ~ 14 ore, gli aumenti pinna dimensioni a una velocità lineare. (E) Il confronto della lunghezza pinna prima amputazione e dopo 36 ore mostra ~ 60% ricrescita. Scala bar: 100 micron Abbreviazioni: pre-amp, pre-amputazione; ore dopo l'amputazione, hpa; rigenerazione, rigenerazione; amp, amputazione Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Movie . Fin rigenerazione nel corso del tempo 36hr. Mostrato è una pinna coda di un 2,5 giorni vecchia larva nel corso della rigenerazione. Avvio di 30 min dopo l'amputazione crescita rigenerativa è ripreso in 30 min intervalli su uno stereomicroscopio utilizzando una lente obiettivo 3.5x.

Discussione

Il metodo presentato permette di osservare la guarigione delle ferite e la rigenerazione dei tessuti nel vivere larve zebrafish con in vivo time-lapse imaging su uno stereomicroscopio chiaro, con un relativamente semplice set-up. Questa procedura richiede alcuni aspetti importanti che abbiamo testato, che ottimizzano il risultato: 1) Basse concentrazioni agarosio (~ 0,5%) ridurrà al minimo gli ostacoli di crescita della continua crescita zebrafish larvale, 2) Rimozione del agarosio intorno alla pinna è importante non oscurare il processo di guarigione, 3) Trapping l'agarosio in una maglia di plastica mantiene l'agarosio e animale in una posizione stabile durante la procedura, e 4) un ambiente a temperatura controllata corretta, che è essenziale per la vitalità delle larve. Abbiamo adattato una camera riscaldata incubazione ^23,24, che utilizza involucro di bolla che viene registrato sul cartoncino, e un riscaldatore cupola cablata per controllare la temperatura e la corretta circolazione dell'aria con fluttuazioni minime durante laprocedura di imaging. Questa camera semplice e conveniente può essere preparato per adattarsi a qualsiasi microscopio. Un simile camera di incubazione riscaldata è stato anche utilizzato per i topi di imaging e sviluppo pulcino ^24,29.

Suggeriamo che le larve pre-amputato sono montati per un'immagine pre-amputazione, smontati per amputazione, e rimontati per l'imaging time-lapse. Anche se è fattibile per eseguire queste operazioni in un unico passo nella camera di imaging finale, nella nostra esperienza abbiamo scoperto che amputare la pinna di coda su un vetrino di vetro non è ottimale, in quanto si strappa il tessuto e non comporta un taglio netto. Il metodo di amputazione basato agarosio-usando un ago della siringa è stato originariamente descritto da Kawakami e colleghi (2004) ^16, ed è anche, nella nostra esperienza, ideale per eseguire le amputazioni. Così, la serie piuttosto complessa di passaggi che abbiamo presentato è ben giustificata e garantisce un risultato ottimale rigenerazione.

Abbiamo dimostrato che larval zebrafish a 2 dpf può essere ripreso fino a 1,5 giorni in agarosio e soluzione Tricaine. Abbiamo usato pH della soluzione ottimizzata Tricaine (pH7) preparato con sale Instant Ocean, che non interferisce con la salute delle provino per il periodo di imaging presentato. Abbiamo precedentemente però anche dimostrato che l'uso di Tricaine in Danieau medio permette time-lapse imaging di 2,5 dpf zebrafish larvale su un microscopio confocale per almeno 2 giorni ^30. Pertanto, le condizioni ottimali tampone possono estendere salute larvale e la lunghezza di imaging. In alternativa, le concentrazioni tricaine inferiori possono essere utilizzati per l'anestesia, o 2-fenossietanolo, che abbiamo trovato è ben tollerata durante stadi larvali e adulti a 28 ° C per almeno 60 ore.

Per evitare difetti di rigenerazione pinna, abbiamo rimosso il agarosio dalla pinna caudale prima di imaging. Nostri dati mostrano che entro 1,5 giorni pinna ha rigenerato a circa il 60%. Questo tasso di rigenerazione è coerente con uno studio precedente che definisce 3 giorni as un tempo medio per la rigenerazione pinna caudale in larve di zebrafish fino a 6 dpf ^16. Metodi alternativi per agarosio potrebbero comunque essere utilizzate per montare il pesce per imaging. Ad esempio, il plasma sottile coagula ³¹ o fluorurati etilene propilene (FEP) tubi rivestiti di metilcellulosa e riempiti di concentrazioni molto basse agarosio (0,1%) sono stati raccomandati per foglio microscopia ottica ³² e può essere adatto per il nostro metodo presentato. Tuttavia, non è consigliabile metilcellulosa e 0,1% agarosio, in quanto richiedono che i campioni sono montati nella parte inferiore della camera a causa della mancanza di solidificazione di questi mezzi. Molto alte concentrazioni di metilcellulosa saranno inoltre generare bolle d'aria sulla base della nostra esperienza, e questi possono interferire con la procedura di imaging. Se questi mezzi sono preferiti con utilizzando la camera inferiore, è importante che un'opportuna distanza di lavoro tra la lente obiettivo e il campione è presente. Va notato che metilcellulosa come mezzo di montaggio è consigliato solo per un massimo di 1 giorno, in quanto potrebbe interferire con la salute larvale ^32.

Montaggio il campione del coperchio può provocare una lenta deriva gravitazionale verso il basso. Si raccomanda pertanto di immagine più sezioni in ogni tempo, che può essere proiettata in un unico piano o solo immagini che si trovano nel piano focale può essere estratto per il montaggio del filmato finale. Imaging il campione alla camera inferiore potrebbe essere un metodo alternativo per evitare potenziali deriva verso il basso. Coaguli plasma potrebbero essere utili al fine di evitare la deriva, come il plasma si attacchi allo strato avvolgente esterna (EVL, periderm) ³¹ e, pertanto, possono stabilizzare i campioni. Questo però deve essere testato, così come per quanto tempo zebrafish larvale può essere mantenuta in grumi plasma senza interferire con la salute delle larve o la rigenerazione della pinna.

Il nostro film è stato assemblato utilizzando singole sezioni (26 micron)di z-stack registrata, che copriva l'intero spessore della pinna (~ 10 micron) e che rappresenta il potenziale z-drift della pinna durante la procedura di imaging. Al fine di conservare le informazioni 3-D, è anche possibile proiettare z-stack in immagini singole. Poiché questo può causare sfocatura dell'immagine, campo chiaro deconvoluzione può desiderare. Software, come Deconvolve o X3 Autoquant potrebbe essere utilizzato per questo scopo. In alternativa, algoritmi matematici (descritti in Tadrous ³³⁾ possono essere applicati per ottenere una funzione point-diffusione di alto rapporto segnale-rumore (SNR). Ottenere un elevato SNR rappresenta uno dei principali ostacoli nel campo chiaro deconvoluzione. Anche se questo metodo richiede un elevato contrasto e spessore del campione sottile, sarebbe opportuno per l'imaging della pinna caudale causa della sua larghezza ridotta.

Un chiaro vantaggio del metodo di imaging presentato è che è rapidamente adattabile a qualsiasi stereomicroscopio dotato di una telecamera CCDd software time-lapse e offre un basso costo un'alternativa ai sistemi di imaging confocale più costosi. Mentre questo metodo non utilizza fluorescenza per il rilevamento delle cellule, può essere esteso per tali applicazioni utilizzando un sistema automatico per il controllo dell'otturatore e post-immagini software deconvoluzione ^34. Ciò consentirebbe agli utenti di osservare ulteriormente i processi di riparazione e rigenerazione della ferita con singola cella o risoluzione subcellulare su periodi di tempo più lunghi.

La chiarezza ottica e la facilità con cui embrionale e larvale zebrafish possono essere gestiti, e l'adattabilità di questo metodo per qualsiasi stereomicroscopio lo rende adatto per l'insegnamento della biologia dei vertebrati di base in classe. Questo metodo può fornire agli studenti una migliore comprensione dei processi biologici fondamentali sottostanti riparazione dei tessuti e la rigenerazione. Altri processi biologici che sono stati catturati con un metodo simile sono zebrafish sviluppo embrionale ^23,34 e cardiacafunzione (inedito). Questo metodo offre anche la possibilità per la riparazione e rigenerazione monitoraggio della ferita in larve geneticamente e farmacologicamente manipolato.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Bullseye Agarose (MidSci, Cat. No. BE-GCA500)
Low-melt agarose (Fisher BioReagents, Cat No. BP1360-100)
1-phenyl-2-thiourea [Alfa Aesar, Cat No. L06690]
Instant Ocean Aquarium Salt (Pet store)
Methylene Blue (0.1% solution) (Sigma, Cat. No. M9140)
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, Sigma-Aldrich, Cat. No. E10505)
2-Phenoxyethanol (Sigma-Aldrich, Cat. No. 77699)
Petri Dish 35 x 15 mm (BD Falcon, Cat. No 351008)
Petri Dish 60 x 15 mm (BD Falcon, Cat. No 351007)
Petri Dish 100 x 25 mm (BD Falcon, Cat. No 351013)
5.75 inch boroschillate glass pipets (Fisher)
35 mm Glass Top Glass Bottom Dish (MatTek Corporation, Cat No. D35-20-0-TOP) Glass: 0.085-0.115mm
Superfrost/Plus microscope slides (Fisherbrand, Cat No. 12-550-15)
Glass coverslips (Electron Microscopy Services, Cat No. 72191-75)
Glass coverslips (Warner Instruments, Cat. No. CS-18R15)
Phifer Phiferglass Insect Screen Charcoal - 48" (Home Depot)
DOW CORNING® HIGH VACUUM GREASE
Microloader pipette tips 20 µl (Eppendorf, Cat. No. 930001007)
Fine Scissors - Sharply Angled Up (Fine Science Tools, Cat. No. 14037-10)
3 mL Luer-Lok™ disposable syringe (BD, Cat. No. 309657)
60 mL Luer-Lok™ disposable syringe (BD, Cat. No. 309653)
23-gauge syringe needles (BD, Cat. No. 305145)
Dumont #5 Forceps (Fine Science Tools, Cat. No. 11295-00)
Equipment
LabDoctor Mini Dry Bath (MidSci)
Zeiss Discovery.V12 compound microscope
Zeiss Plan Apo S 3.5X objective
Zeiss AxioCam MRm
Zeiss Axiovision software, Release 4.8.2SP1 (12-2011)