الماوس السذاجة CD4<sup&gt; +</sup&gt; عزل T خلية و<em&gt; في المختبر</em&gt; التمايز إلى T مجموعات فرعية خلية

Summary

Naïve CD4⁺ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of naïve CD4⁺ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Abstract

Antigen inexperienced (naïve) CD4⁺ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a naïve CD4⁺ T cell. Although the cytokine environment during naïve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4⁺ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4⁺ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of naïve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing naïve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Introduction

مفهوم الأنساب متميزة أو مجموعات فرعية من CD4 ⁺ T المساعد وكانت (ث) خلايا موجودة منذ الجزء الأخير من القرن ^التاسع 20 ^1. الاعتراف مستضد وما شابه ذلك بحضور النتائج إشارات costimulatory في عدة جولات من انتشار الخلوي والتمايز في نهاية المطاف إلى المستجيب ث الخلايا. نوع ث الخلايا المولدة خلال هذه العملية يتوقف على البيئة خلوى الحالية خلال تفعيل ^2. في البداية، كان يعتقد خلايا ث ساذجة لاستقطاب في 2 الأنساب المتميزة التالية مستقبلات الخلايا التائية (TCR) التنشيط، costimulatory CD28 ربط، وخلوى الإشارات. وتتميز نوع 1 الخلايا المساعدة (TH1) من خلال إنتاج المستجيب لها من خلوى IFNγ فضلا عن احتياجاتهما لIL-12 الإشارات خلال ^3،4 عملية التمايز. في نهاية المطاف تم اكتشاف أن خلايا TH1 متباينة لديها الصورة الجينية التي تتميز معظم متميز بذ التعبير عن مربع T عامل النسخ الأسرة، Tbx21 (T-رهان)، والتي تعتبر المنظم الرئيسي للبرنامج جيني TH1 ^5. وعلاوة على ذلك، يمكن أن IL-12 وكذلك IFNγ تعزيز T-رهان التعبير ^6،7. في الاستجابة المناعية، وخلايا TH1 مهمة للدفاع المضيف ضد مسببات الأمراض داخل الخلايا وكذلك المروجين قوي للالتهاب المناعة الذاتية. في المقابل، خلايا من النوع 2 المساعد (TH2) تتطلب IL-4 لتنميتها والسيتوكينات المستجيب، بما في ذلك IL-4 و IL-5، وIL-13، هي مهمة للقيادة استجابات الخلايا B وهي المسببة للأمراض في الحساسية ^{8، 9.} وعلى غرار TH1 الخلايا، تم العثور على خلايا TH2 للتعبير عن نفسه منظم النسخي سيدهم، ووصف GATA-3 ^10،11. ومن المثير للاهتمام، فإن وجود السيتوكينات استقطاب وتوليد نسب ث المحددة هي معادية لتطوير الآخرين ^2،12، مما يوحي بأن مجموعة فرعية فقط ث معينة قد تصبح المهيمنة خلال إعادة المناعياستجابته.

منذ التعرف على Th1 و TH2 الأنساب، وقد أثبت المزيد من العمل حتى أكثر فريدة من نوعها مجموعات فرعية من الخلايا التائية المساعدة، بما في ذلك مسامي المساعد (TFH)، IL-9-إنتاج (Th9)، وIL-22-إنتاج (Th22) (مؤخرا استعراضها في ^13). لأغراض التجارب في المختبر التمايز، وهذا البروتوكول تركز فقط على اثنين من مجموعات فرعية ث إضافية، ووصف خلايا T التنظيمية (Treg) وIL-17-إنتاج خلايا CD4 ⁺ T (Th17). CD25 ⁺ خلايا T التنظيمية يمكن أن يحدث بشكل طبيعي (nTreg) في الغدة الصعترية. ويمكن أيضا أن يتسبب خلايا ث ساذجة (iTreg) لتصبح التنظيمية في محيط (استعراضها في ^14،15). كلا النوعين من Tregs تعبر عن عامل النسخ مميزة، يطلق مربع forkhead P3 (Foxp3)، وهو أمر حاسم لآليات قمع المستجيب لها والتي تشمل إنتاج قابل للذوبان المضادة للالتهابات الوسيط، IL-2 الاستهلاك، وآليات الخلية التي تعتمد على الاتصال ^14،15. عدم وجود Foxp3 النتائج في التعبير الشديد، الأعضاء المتعددة اضطراب المناعة الذاتية وصفته ديسريغولاتيون المناعي، polyendocrinopathy، الأمعاء، ومتلازمة X-مرتبط (IPEX)، مما يدل على الدور الحاسم لهذا فرعية ث في حل التهاب وتنظيم التسامح الطرفية في تقرير المصير مستضدات ^16. في المختبر، الخلايا المساعدة CD4 ⁺ T ساذجة يصل تنظيم Foxp3 وأصبح ملتزما برنامج Treg على التحفيز مع IL-2 و TGF-β ^14،15. قد يكون هناك معتدلة إلى اللدونة كبيرة في CD4 ⁺ T الأنساب الخلية، وخاصة عند النظر في إنتاج السيتوكينات الوحيد (استعراضها في ^17،18). ومع ذلك، لأغراض في المختبر بروتوكولات التمايز، وسوف نناقش كل مجموعة فرعية كما نسب فريدة من نوعها.

مؤخرا، تم تحديد مجموعة فرعية من خلايا Th17 التي تنتج خلوى IL-17 كما نسب فريدة من نوعها مع وظائف الموالية للالتهابات التي هي المسببة للأمراض وخاصة أثناء التهاب المناعة الذاتية ^19-21. خلايا Th17 تعبر عن عامل النسخ فريدة من نوعها، ووصف المتعلقة ريتينويد اليتيم مستقبلات غاما ر (RORγt) التي تنسق برنامج جيني Th17 ^22. TGFβ المهم لتوليد Th17 النسب من خلال تحريض RORγt. ومع ذلك، يعتقد أن تأثير TGFβ إشارات للحث على الالتزام فقط Th17 على التآزر مع IL-6 (استعراضها في ^12). وقد أظهرت دراسات أخرى أن مجموعة متنوعة من الإشارات الأخرى التي يمكن أن تنظم بشكل إيجابي التزام Th17، بما في ذلك IL-1β، وزيادة الصوديوم، وTLR اشارة ^23-26. وأشارت تقارير أخرى إلى أن خلايا Th17 المسببة للأمراض في الجسم الحي هي تلك التي تجاوز الواقع TGFβ الإشارات وبدلا من ذلك تعتمد على مزيج من IL-1، IL-6، وIL-23 للتمايز على ^27. وبالتالي، قد تكون مشتقة خلايا Th17 من مجموعة متنوعة من مسارات الإشارات. لأغراض هذا البروتوكول، وشائعة الاستخدام (TGFβ وIL-6) مسارا لTh17 التزام النسبوستعرض.

البروتوكولات التمايز هو موضح أدناه لجميع الأنساب المستجيب تعتمد على الأجسام المضادة ثابت كما المحفزات لTCR وCD28 في جميع أنحاء كامل التجربة. ومع ذلك، فقد أظهرت آخرون أن تفعيل TCR مع الخلايا العارضة للمستضد ²⁸ أو مكافحة CD3 وأضداد CD28 مع الهامستر الأجسام المضادة ربط عبر لمدة 2 أيام ²⁹ هي أيضا وسيلة فعالة للغاية من تحريض جيل من مختلف مجموعات فرعية ث. بروتوكول المعروضة هنا يبني على أساليب ذكرت سابقا لعزل خلايا CD4 ⁺ T الفئران من الأجهزة اللمفاوية الثانوية ³⁰ و توليد خلايا Th17 ^31. احد الفرق الرئيسي هو أن هذا البروتوكول يعتمد على استخدام فارز خلية لعزل خلايا CD4 ⁺ T ساذجة من الأنسجة اللمفاوية. ومع ذلك، العديد من الشركات تقدم الآن مجموعات فصل السريعة التي يمكن أن تثري للخلايا CD4 ⁺ T السذاجة، والتي قد تكون قادرة على تجاوز شرط وأو الفرز اعتمادا على التجربة. الطرق والكواشف الواردة في هذا البروتوكول هي التي نستخدمها بشكل روتيني وتجد أن تكون الأكثر فعالية. ومع ذلك، نضع في اعتبارنا أن الكواشف ومنهجيات بديلة موجودة لكثير من الخطوات الواردة أدناه، والأمر متروك إلى المختبر الفردية لتحديد ما سوف تعمل بشكل أفضل لتحقيق أغراضهم.

Protocol

يتم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية باستخدام بروتوكولات المعتمدة من قبل مكتب الصحة البيئية والسلامة في جامعة روزاليند فرانكلين الطب والعلوم. وتم إيواء C57BL / 6 الفئران (تم شراؤها من NCI) المستخدمة لهذا البروتوكول في ظل ظروف خالية من مسببات الأمراض المحددة، وأجريت جميع التجارب على الحيوانات باستخدام بروتوكولات التي وافقت عليها لجنة رعاية واستخدام المؤسسية الحيوان (IACUC) في جامعة روزاليند فرانكلين الطب و العلم.

1. إعداد الأدوات والمستلزمات والكواشف

1. معطف 48-جيدا أو 24-جيدا لوحات مع مكافحة CD3 ومكافحة CD28 (الجدول 1) في برنامج تلفزيوني العقيمة، والغطاء والتفاف في بارافيلم لمنع التبخر وتلوث، ومن ثم احتضان O / N عند 4 ^درجة مئوية قبل يوم واحد T العزلة الخلية. بدلا من ذلك، الآبار معطف 1 ساعة عند 37 ^{درجة مئوية.} أداء الظروف Th0، TH1، TH2، وiTreg بواسطة طلاء على حد سواء لمكافحة CD3 ومكافحة CD28 في 1μg / مل في 0.5-1 مل لحجم التل (لوحة 48 أيضا). لTh17، ونحن عادة معطف مكافحة CD3 في 2 ميكروغرام / مل ومكافحة CD28 في 1 ميكروغرام / مل.
   ملاحظة: لقد وجدنا أن أقل تركيز مكافحة CD3 هو الأمثل لتوليد TH1، TH2، وiTreg في حين أن أعلى تركيز لمكافحة CD3 هو الأمثل لتوليد Th17. وهكذا، ومكافحة CD3 وتركيزات مكافحة CD28 يجب معاير والأمثل للمختبرات الفردية (الجدول 2).
2. تعقيم مجموعة من الأدوات تشريح (مقص وملقط) من خلال حل الأوتوكلاف أو مطهر. ستكون هناك حاجة إلى أنبوب أو كوب صغير يحتوي على 70٪ من الإيثانول لتعقيم سريع من الأدوات بين تشريح. وأخيرا، سوف تكون هناك حاجة إلى زجاجة رذاذ يحتوي على 70٪ من الإيثانول لتعقيم سطح الماوس قبل تشريح.
3. إعداد سطح تشريح بلف قطعة مسطحة من الستايروفوم أو corkboard في رقائق الألومنيوم. وتستخدم تشريح دبابيس أو الإبر لإصلاح الحيوان في المكان.
4. إعداد أطباق أو لوحات لجمع منظمة الشفافية الدوليةssues. إذا الأنسجة تجميع، 60MM أطباق منفصلة تحتوي على 3ML من معقمة PBS + 1٪ FBS (PBS +) لأنسجة الطحال والعقد اللمفاوية غير كافية. إذا حفظ الأنسجة من الفئران الفردية منفصلة، ​​وإعداد 1ML 24 لوحة جيدا تحتوي على من برنامج تلفزيوني + في العدد المرغوب فيه من الآبار.
5. إعداد كاملة وسائل الاعلام RPMI للثقافة الخلية وقبل الدافئ قبل الاستخدام (الجدول 1).
   ملاحظة: نحن عادة استخدام RPMI ولكن وسائل الإعلام الأخرى مثل IMDM وDMEM قد تكون فعالة بنفس القدر أو متفوقة اعتمادا على المختبر والتجربة.
6. قطع 2X2 سم الساحات من النايلون شبكة مع 120 ميكرون حجم المسام والأوتوكلاف لتعقيم (الجدول 1).
7. اختياري: في حالة استخدام الخلية مغناطيسية عالية السرعة نظام الفرز مثل autoMACS لتخصيب خلايا CD4 ^+، وتشغيل ما قبل دافئ والشطف مخازن في 37 ^س C حمام الماء لمنع تلف الجهاز.
8. ملاحظة: يوصى التخصيب لزيادة الغلة الفرز وتقليل فرز الوقت.
9. جميعخطوات التحضير، باستثناء تشريح، يجب أن يؤديها في نسيج الثقافة العقيمة غطاء محرك السيارة.

2. عزل الغدد الليمفاوية والطحال من الفئران

1. الموت ببطء العدد المطلوب من الحيوانات باستخدام تقنية افق مؤسسيا. استخدام C57BL / 6 إناث الفئران، سن 5-10 أسبوعا، بسبب نسبتهم عالية من خلايا T ساذجة وانخفاض الدهون في الجسم بالمقارنة مع الذكور أو الفئران الأكبر سنا.
   ملاحظة: سوف الخلايا المشتقة من الفئران الذكور أداء مماثل في المختبر، وتبقى الخطوات البروتوكول نفسه. سوف إناث الفئران، 5-10 أسبوعا من العمر، وعادة ما تسفر 3-6 × 10 ⁶ خلايا CD4 ⁺ ساذجة T في الماوس. ومع ذلك، باستخدام سلالات مختلفة من الفئران قد تؤثر على المحصول والأداء. على سبيل المثال، الخلايا من C57BL / 6 الفئران هي أفضل لتوليد خلايا TH1 في حين أن الخلايا من الفئران Balb.c أفضل لتوليد خلايا TH2.
2. نشر أطرافه من الحيوان ويعلقون لهم في المكان كما هو مبين في الشكل 1. قطع الجلد طويلitudinally من فتحة الشرج إلى الذقن مع الحرص على عدم ثقب الأنسجة العميقة.
3. انتشار فتح الجلد مع ملقط ودبوس الجلد في مكان للسماح سهولة الوصول إلى الغدد الليمفاوية كما هو مبين في الشكل (1).
4. حصاد الغدد الليمفاوية يمكن الوصول إليها من المواقع هو مبين في الشكل 1. الاستيلاء على العقدة الليمفاوية مع زوج من ملقط حين فصل الأنسجة مع زوج آخر من ملقط سيسمح لسهولة إزالة. وضع الأنسجة في طبق جمع.
5. حصاد الطحال من الموقع هو مبين في الشكل (1). وفي هذه الحالة، لا بد من قطع دقيق في الصفاق للوصول إلى الطحال. وضع الأنسجة في طبق جمع.
6. كرر الإجراء إذا كان سيتم حصادها المزيد من الأنسجة. المضي قدما إلا إلى الخطوات التالية. عند هذه النقطة، نفذ كل الخطوات المتبقية على الجليد حتى الطلاء للخلايا T بعد الفرز.

3. تجهيز الأنسجة وCD4 ⁺ التخصيب

1. معالجة الغدد الليمفاوية والطحال في أطباق مختلفة لزيادة الغلة كما الاستعدادات خلية العقدة الليمفاوية لا تتطلب كرات الدم الحمراء تحلل، والتي قد تؤدي إلى الوفاة طفيفة الكريات البيض. ولذلك، تصف الخطوات التالية طريقة لمعالجة الطحال والعقد اللمفاوية السكان تليها بشكل منفصل من خلال الجمع بين قبل وضع العلامات للفرز.
2. إزالة الأنسجة (الطحال أو الغدد الليمفاوية المجمعة) من الطبق جمع ومكان في جديد 60 ملم صحن يحتوي على 3 مل من برنامج تلفزيوني +. ضع مربع من النايلون العقيمة شبكة على الأنسجة باستخدام ملقط معقم.
3. اتخاذ جانب الإبهام من المكبس حقنة (3-10 مل)، وسحق بلطف الأنسجة ضد شبكة. جميع الأنسجة تقريبا يجب ان تذهب الى تعليق. بدلا من ذلك، ضع الأنسجة بين شريحتين بلوري تعقيمها ومطحون إلى تعليق.
4. ماصة تعليق صعودا وهبوطا عدة مرات لتفريق كتل قابلة للذوبان المتبقية. ضع قطعة مربع جديد من شبكة من النايلون خلال افتتاح15 مل أنبوب مخروطي الشكل وتصفية تعليق من خلال لازالة الانقاض المتبقية.
5. كرر الخطوات من 2-4 العقدة الليمفاوية إضافية والأنسجة الطحال.
6. مرة واحدة وقد تم تصفيتها تعليق في أنبوب 15ML ملء ما تبقى من الأنبوب مع برنامج تلفزيوني + وعكس عدة مرات. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 475 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 ^{درجة مئوية.}
7. للخلايا الطحال، ونضح طاف الطرد المركزي التالية و resuspend بيليه خلية في 1 مل من الجليد الباردة 1X ACK حل في الطحال لمدة 1 دقيقة لليز كريات الدم الحمراء. ثم إضافة 10 مل من PBS + على رأس ACK، عكس الأنبوب، وأجهزة الطرد المركزي 475 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 ^{درجة مئوية.}
8. لخلايا العقدة الليمفاوية، نضح في وطاف resuspend في من 2ml PBS +. إذا رغبت هذه يمكن دمجها مع الخلايا الطحال بعد تحلل ACK وخطوة الغسيل.
9. نضح طاف بعد الطرد المركزي من splenocytes وresuspend في 10 مل أخرى من برنامج تلفزيوني +. عند هذه النقطة تعليق العقدة الليمفاوية يمكن أن يكونdded على رأس تعليق الطحال إذا كان مطلوبا تجميع الأنسجة للفرز. أجهزة الطرد المركزي أنبوب مرة أخرى في 475 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 ^{درجة مئوية.}
10. ويمكن الآن بيليه الخلية تكون مستعدة لتخصيب CD4. إذا لن يتم تنفيذ هذه الخطوة، انتقل إلى خطوات إعداد الفرز.
11. لتخصيب CD4 باستخدام الخلايا فرز نظام مغناطيسي فائق السرعة، resuspend الكرية الخليوي مع حبات CD4. وعادة ما تستخدم 15 ميكرولتر من الخرز مخففة في 85 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني + لتسمية الأنسجة من 1 الماوس. تكثيف حجم خليط حبة حسب الحاجة، resuspend الكرية، واحتضان لمدة 15-30 دقيقة في 4 ^{درجة مئوية.}
12. غسل الخلايا مع 10 مل من برنامج تلفزيوني +، تمرير تعليق من خلال النايلون في أنبوب جديد 15 مل لإزالة الأنقاض، وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 475 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 ^{درجة مئوية.}
13. Resuspend وبيليه في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني + في الماوس، والشروع في اختيار إيجابية على الخلية مغناطيسية عالية السرعة نظام الفرز. في حالة استخدام نظام الفصل اليدوي، وollow إرشادات الشركة المصنعة لتخصيب اليورانيوم. بدلا من ذلك، resuspend والعينات في المخزن FACS: PBS مع 1MM EDTA (الرقم الهيدروجيني = 8) و 1٪ BSA، عقيم، تمت تصفيتها.
14. إزالة جزء إيجابي ويغسل مرة أخرى مع 10ML من برنامج تلفزيوني +. وأثرى CD4 ⁺ جزء هو الآن على استعداد ليكون المسمى لفرز.

4. خلايا الفرز السذاجة CD4 ⁺ T

1. تسمية الخلية بيليه مع PBS + تحتوي على الأجسام المضادة الفلورسنت موجهة ضد CD62L، CD44، CD25، وCD4. إذا باستخدام الأجسام المضادة المدرجة في الجدول 1، وتقدم التخفيفات لكل منها. لتلطيخ، يتم استخدام حجم 100 ميكرولتر من الكوكتيل الأجسام المضادة في الأنسجة من ماوس واحدة.
2. Resuspend وبيليه في الضد كوكتيل واحتضان لمدة 15-30 دقيقة في 4 ^درجة مئوية في الظلام.
3. غسل الخلايا مع 10ML من برنامج تلفزيوني + وأجهزة الطرد المركزي 475 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 ^{درجة مئوية.}
4. تمرير الخليط على مرشح النايلون أو مصفاة خلية غطاء آخر لإعادةنقل أي بقايا الحطام. ماصة الخلايا المسمى في أنبوب متوافق لفارز الخلية. تبقي الخلايا على الجليد ومحمية من الضوء حتى هذا القبيل.
5. إعداد أنابيب جمع من قبل pipetting 1-2ml من وسائل الإعلام كاملة RPMI FBS أو في الجزء السفلي من أنابيب متوافقة لجمع على فارز الخلية.
6. ترتيب الخلايا الساذجة CD4 ⁺ T باعتباره CD4 ⁺ CD25 ^- CD62L ⁺ CD44 ^- السكان (الشكل 2). غسل الخلايا التي تم جمعها مع وسائل الإعلام كاملة RPMI وأجهزة الطرد المركزي كما هو موضح أعلاه.
7. Resuspend وبيليه في RPMI كاملة، عد خلايا ساذجة، وضبط تركيز إلى 1 × 10 ⁶ خلية / مل.

5. إعداد والتمايز في المختبر

1. نضح آبار مكافحة CD3 ومكافحة CD28 لوحات المغلفة وغسل كل بئر مع 1ml من برنامج تلفزيوني العقيمة (لا FBS). لوحات 48-جيدا، لوحة 0.5 × 10 ⁶ خلية / جيدا في 0.5 مل من RPMI. ل24 لوحات جيدا، والثقافة، 1 × 10 ⁶ خلية / جيدا في 1.0 مل من RPMI.
2. إذا اختبار تأثير عامل مثل المخدرات إضافة مادة إلى آبار المناسبة سواء قبل أو أثناء أو بعد عملية التمايز اعتمادا على التجربة. وبعد ذلك، تكملة سائل الإعلام والثقافة مع السيتوكينات والأجسام المضادة ومنع وفقا لذلك. Th0: 30 U / مل HIL-2. TH1: 15 نانوغرام / مل rmIL-12، 30 U / مل HIL-2، و 5،000 نانوغرام / مل 11B11.Th2: 10 نانوغرام / مل rmIL-4، 30 U / مل HIL-2، 2،000 نانوغرام / مل للذوبان 37.51، و 5،000 نانوغرام / مل XMG1.2. iTreg: 15 نانوغرام / مل hTGFβ، 30 U / مل HIL-2، 5،000 نانوغرام XMG1.2 / مل، و 5،000 نانوغرام / مل 11B11. Th17: 20 نانوغرام / مل rmIL-6، 3 نانوغرام / مل hTGFβ، 5،000 نانوغرام XMG1.2 / مل، و 5،000 نانوغرام / مل 11B11.
   وعثر على الشروط الواردة أعلاه لتكون الأمثل لتعظيم إنتاج السيتوكينات التي تقاس في نهاية التجربة التمايز (القسم ممثل النتائج): ملاحظة. ومع ذلك، ينبغي أن يكون الأمثل لكل حالة للمختبرات الفردية (الجدول 2 ). وعلاوة على ذلك، تم العثور على إضافة ذوبان مكافحة CD28 بالإضافة إلى لوحة ملزمة لمكافحة CD28 لتعزيز إنتاج السيتوكينات TH2 في المختبر لدينا، ولكن ليس له تأثير على غيرها من مجموعات فرعية الخلايا T:
3. احتضان لوحة عند ³⁷ درجة مئوية مع 5٪ CO ₂ لمدة 4-5 د قبل تحليل التعبير الجيني وإنتاج السيتوكينات. بدلا من ذلك، إزالة الخلايا من المحفزات TCR بعد 2 د، بعد تعديلها ل1 × 10 ⁶ خلية / مل مع وسائل الإعلام الجديدة، وصفيحة في آبار جديدة (غير المغلفة) لتعزيز انتشار والعائد النهائي. في هذه الحالة، ليست هناك حاجة السيتوكينات استقطاب الطازجة والأجسام المضادة ولكن يجب إضافة 10 U / مل من IL-2 إلى وسائل الإعلام الجديدة لTh0، TH1، TH2، والثقافات iTreg.

6. تحليل التمايز

1. لتحليل خلوى بواسطة التدفق الخلوي، restimulate كل بئر مع 10ng / مل سلطة النقد الفلسطينية و 1،000 نانوغرام / مل ionomycin أو 1 ميكروغرام / مل مكافحة CD3 لمدة 4-6 ساعة في وجود المانع جولجي مثل brefeldin ألف (الجدول1). أداء الخلايا تلطيخ خلوى اعتمادا على التجربة (الشكل 3).
   ملاحظة: وصمة عار غير نسب محددة السيتوكينات أو عوامل النسخ، مثل IL-4 (لا يظهر) وIFNγ (الشكل 3) للثقافات Th17، لكل حالة والضوابط السلبية وكمؤشر على كفاءة التمايز. وعلاوة على ذلك، قد تحدث Foxp3 وصمة عار للثقافات Th17 إلى تطوير متبادلة من Tregs مع إضافة TGFβ.
2. لالبروتين الكمي، وجمع supernatants من كل فحص جيدا وخلوى محددة ELISA (الشكل 3). إذا كان هناك قلق من أن عامل يجري اختبارها أثرت انتشار مقارنة عينات السيطرة، وخلايا يمكن غسلها، عدها، وقد تمت تسويته، ثم restimulated مع 1 ميكروغرام / مل من مكافحة CD3 لمدة 24 ساعة قبل جمع supernatants لفحوصات ELISA. إذا يعاير IL-4 من TH2 الشروط والغسيل وrestimulating ضروري لإزالة IL-4 التي قد تكون لeftover من ثقافة التمايز الأولية.
3. لتحليل التعبير الجيني من قبل في الوقت الحقيقي PCR، وخلايا الحصاد بعد فترة الحضانة، وغسل، تطبيع، وإعادة تنشيط ل2-6 ساعة مع 1 ميكروغرام / مل من مكافحة CD3 قبل الحصاد مرنا (الشكل 3).

النتائج

النقطة الوقت لتحليل التمايز يمكن أن تختلف تبعا لحالة ث يجري اختبارها فضلا عن قوة T تنشيط مستقبلات الخلية. بعد 2-3 أيام من التمايز، والخلايا يمكن تصور بواسطة المجهر الضوئي لتحديد مدى انتشار الخلايا T. سوف الآبار واظهار انتشار واسع والتثاقل من خلايا من المرجح أن تكون جاه?...

Discussion

في حين أن الطحال يحتوي على خلايا ث الساذجة، فإن نسبة هذه الفئة من السكان في الغدد الليمفاوية هو أعلى من ذلك بكثير. والفشل في تحديد بشكل صحيح وإزالة العقد اللمفاوية في هذا البروتوكول يؤدي إلى العائد الضعيف للخلايا ساذجة. وهذا يمكن أن يكون من الصعب وخصوصا في الفئران الأ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Complete RPMI:			Warm in a 37 oC water bath before use
RPMI 1640 Media	Life Technologies	11875119
10 % FBS	Life Technologies	26140-079
1000X 2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
100X Pen/Strep	Life Technologies	15140122
100X L-glutamine	Life Technologies	25030081
120 micron nylon mesh	Amazon	CMN-0120-10YD	Cut into 2 cm2 squares and autoclave
Alternative: 100 micron cell strainers	Fisher	08-771-19	Alternative to cutting nylon mesh
autoMACS running buffer	Miltenyi	130-091-221	Warm in a 37 oC water bath before use
autoMACS rinsing solution	Miltenyi	130-091-222	Warm in a 37 oC water bath before use
CD4 beads	Miltenyi	130-049-201
ACK lysis buffer	Life Technologies	A10492-01
Cytokines:
Human (h) IL-2	Peprotech	200-02
Recombinant mouse (rm) IL-4	Peprotech	214-14
rmIL-6	R & D Systems	406-ML-025
rmIL-12	Peprotech	210-12
hTGFb	R & D Systems	240-B-010
Antibodies:
2C11 (anti-CD3)	BioXcell	BE0001-1
37.51 (anti-CD28)	BioXcell	BE0015-1
11B11 (anti-IL-4)	BioXcell	BE0045
XMG1.2 (anti-IFNg)	BioXcell	BE0055
anti-CD62L-FITC	BioLegend	104406	Use at 1:100
anti-CD25-PE	BioLegend	102008	Use at 1:400
anti-CD4-PerCP	BioLegend	100434	Use at 1:1000
anti-CD44-APC	BioLegend	103012	Use at 1:500
Phorbol  12-myristate 13 acetate (PMA)	Sigma-Aldrich	P-8139	Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I-0634	Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC
Brefeldin A	eBioscience	00-4506-51	Use at 1:1000