Fare Naif CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Hücre İzolasyonu ve<em&gt; In vitro</em&gt; T hücre alt içine Farklılaşma

Özet

Naïve CD4⁺ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of naïve CD4⁺ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Özet

Antigen inexperienced (naïve) CD4⁺ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a naïve CD4⁺ T cell. Although the cytokine environment during naïve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4⁺ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4⁺ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of naïve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing naïve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Giriş

farklı soy veya CD4 ⁺ T helper altkümelerinden kavramı (Th) hücreleri ^20. yüzyılın ikinci yarısında ¹ beri civarında olmuştur. Hücre çoğalması ve efektör Th hücreleri içinde nihai farklılaşmasının birkaç tur birlikte uyaran sinyallerin sonuçlar mevcudiyetinde aynı kökenli antijenin tanınması. Bu işlem sırasında oluşan Th hücre tipi aktivasyonu ² sırasında, bu sitokin ortama bağlıdır. Başlangıçta, naif Th hücreleri T hücre reseptörü (TCR) aktivasyonu, birlikte uyaran CD28 ligasyonu ve sitokin sinyalizasyon aşağıdaki 2 farklı soy içine polarize düşünüldü. Tip 1 yardımcı hücreleri (TH1) olan IFNy sitokin, bunların etki edici üretiminin yanı sıra farklılaştırma işlemi ^3,4; IL-12 sinyalleme duyulan gereksinimi ile karakterize edilir. Sonunda farklılaşmış Th1 hücreleri en belirgin b karakterize bir genetik profile sahip olduğu keşfedildiy Th1 genetik programın ⁵ ana regülatörü olarak kabul edilir T kutusu aile transkripsiyon faktörü ifadesi, Tbx21 (T-bahis). Bundan başka, IL-12, hem IFNy gibi T bahis ifade ^6,7 teşvik edebilir. Immün yanıt olarak, Th1 hücreleri, hücre içi patojenler hem de oto-bağışıklık iltihap kuvvetli promotörler karşı konakçı savunması için önemlidir. Bunun aksine, tip 2 yardımcı hücreleri (Th2) kendi gelişimi için IL-4 ve IL-4, IL-5 de dahil olmak üzere, bunların etki edici sitokinler ve IL-13 gerektiren, B hücre yanıtları tahrik etmek için önemlidir ve alerji ^{8-patojen, 9.} Th1 hücrelerinin benzer, Th2 hücreleri kendi ana transkripsiyonel regülatör ifade etmek bulundu, GATA'nın-3 ^10,11 olarak adlandırılan. İlginçtir, polarize sitokinlerin varlığı ve belirli bir Th soyun nesil sadece belirli bir alt kümesi Th bir bağışıklık yeniden sırasında baskın hale gelebilir düşündüren, başkalarının ^2,12 gelişimine antagonistiktiryanıtlarının yokluğu.

Th1 ve Th2 soylarının belirlenmesi için, daha fazla çalışma son folikül yardımcı (TFH), (Th9), IL-9-üreten ve IL-22 üreten (Th22) dahil (T yardımcı hücrelerinin daha bile eşsiz bir alt küme, gösterdi ^{), 13} gözden. In vitro olarak farklılaşma deneylerin amaçları doğrultusunda, bu protokol regülatör T hücreleri (regülatör) ve IL-17 üreten CD4 ⁺ T hücreleri (Th17) olarak adlandırılan, yalnızca iki ek Th alt kümelerini odaklanacaktır. CD25 ^{+ regülatör} T hücrelerinin timüsteki doğal (nTreg) oluşabilir; naif Th hücreleri de ^(14,15 gözden) çevre düzenleyici olmak üzere (iTreg) bağlı olabilir. Tregs Her iki tür karakteristik transkripsiyon faktörü, çözünür anti-inflamatuar aracıların üretimini, IL-2, tüketimi ve hücre temas yoluyla mekanizmaları ^14,15 içerir, bunların etki edici bastırma mekanizmaları için kritik öneme sahiptir forkhead kutu P3 (Foxp3) olarak adlandırılan ifade eder. FoxP eksikliğiCiddi, çoklu organ otoimün bozukluğunun 3 ekspresyonu, bağışıklık düzensizliği, poliendokrinopati, enteropati olarak adlandırılan, enflamasyon çözme ve kendi çevresel tolerans düzenlemede, bu Th alt-grubun önemli bir rol gösteren X-bağlantılı sendromu (IPEX), ¹⁶ antijenleri. İn vitro olarak, saf CD4 ⁺ T yardımcı hücreleri, Foxp3 yukarı doğru regüle ve IL-2 ve ^14,15, TGF-β uyarılan regülatör programına kararlı hale gelir. ^(17,18 gözden) sadece sitokin üretimini göz önüne alındığında, özellikle CD4 ⁺ T hücre soyları içinde önemli bir plastisite orta olabilir. Ancak, in vitro farklılaşma protokolleri amacıyla, benzersiz bir soy olarak her alt kümesi görüşecekler.

Son zamanlarda, IL-17 sitokin üreten, Th17 hücrelerinin bir alt kümesi, otoimmün iltihabı ^19-21 sırasında özellikle patojenik pro-iltihap fonksiyonları ile benzersiz bir soy olarak tanımlanmıştır. Th17 hücreleri benzersiz bir transkripsiyon faktörü ifade, Th17 genetik programı ²² koordinatları olarak adlandırılan retinoid ilgili yetim reseptör gama t (RORγt). TGFβ RORγt indüksiyonu ile Th17 soyunun üretimi için önemlidir. Ancak, TGFβ sinyal etkisi sadece ⁽¹² gözden), IL-6 ile sinerji üzerine Th17 taahhüdünü neden olduğuna inanılmaktadır. Daha ileri çalışmalar için diğer pozitif IL-1β de dahil olmak üzere, Th17 kararlılığını düzenleyen sinyallerin, artan sodyum ve TLR çeşitli ^23-26 sinyal olduğunu göstermiştir. Diğer raporlar, in vivo olarak, patojenik Th17 hücreleri aslında TGFβ sinyal bypass olanlardır ve bunun yerine farklılaşma ^27, IL-1, IL-6 ve IL-23 arasında bir kombinasyonuna bağlıdır olduğunu ileri sürmüşlerdir. Bu nedenle, Th17 hücre sinyal yollarının çeşitli türetilebilir; Th17 soy bağlılığı için bu protokolün amaçları için, yaygın olarak kullanılan (TGFβ ve IL-6) yolusunulacaktır.

Tüm efektör soyları için aşağıda tarif edilen farklılaşma protokolleri tüm deney süresi boyunca TCR ve CD28 için uyaranı sabit antikor dayanır. Bununla birlikte, diğer göstermiştir ki antijen sunan hücreler ²⁸ veya çapraz bağlama, anti-CD3 ve Hamster antikoru anti-CD28 antikorları, 2 gün ²⁹ aynı zamanda çeşitli Th alt-üretilmesini indükleme son derece etkili araçlardır ile TCR aktivasyonu. Burada sunulan protokol Th17 hücreleri ³¹ ikincil lenfoid organlara ³⁰ kemirgen CD4 ⁺ T hücreleri izole ve üretmek için daha önce bildirilen yöntemler üzerine inşa. Önemli bir farklılık, bu protokol, lenfoid dokulardan naif CD4 ⁺ T hücreleri izole etmek için bir hücre ayıklayıcısıyla kullanımına dayanır olmasıdır. Ancak, birçok şirket artık gereksinimi f atlamak mümkün olabilir ki, naif CD4 ⁺ T hücreleri için zenginleştirebilirsiniz hızlı ayırma kitleri teklifveya sıralama deneye bağlı olarak. yöntemler ve bu protokolde sunulan reaktifler rutin kullanımı ve en etkili bulmak ne. Ancak, alternatif reaktifler ve metodolojiler aşağıda sunulan adımları birçok mevcut olduğunu akılda tutmak ve onların amaçları için en iyi çalışacaktır belirlemek için bireysel laboratuvara kadar.

Protokol

Tüm deneysel prosedürler Tıp ve Bilim, Rosalind Franklin Üniversitesi Çevre Sağlığı ve Güvenliği dairesince onaylı protokolleri kullanılarak gerçekleştirilir. Bu protokol için kullanılan (NCI satın alınmıştır), C57BL / 6 fareleri, spesifik patojenden serbest durumlar altında muhafaza edildi ve her hayvan deneyleri Tıp Rosalind Franklin Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan protokoller kullanılarak testi gerçekleştirildi ve Bilim.

Araçların, Sarf Malzemeleri, ve Reaktifler 1. Hazırlık

1. Anti-CD3 ve anti-CD28 ile kaplayın 48 kuyucuklu veya 24-yuvalı plakalar (Tablo 1) steril PBS, kapak ve parafilm sarın buharlaşmayı ve kirlenmeyi önlemek için, ve daha sonra, T bir gün önce ^cı 4 ° C'de O / N kuluçkalanması hücre izolasyonu. 37 ^o C de Alternatif, kat kuyular 1 saat 0.5-1 ml 1 ug / ml anti-CD3 ve anti-CD28 hem de kaplanarak Th0 Th1, Th2 ve iTreg şartları yerinetal hacmi (48 çukurlu plaka) eritin. Th17 için, tipik haliyle kaplama, anti-CD3 1 ug / ml'de ml anti-CD28 2 ug / ml'de.
   NOT: Bu daha yüksek bir anti-CD3 konsantrasyonu Th17 üretimi için en uygun süre daha düşük bir anti-CD3 konsantrasyonu, Th1, Th2 ve iTreg üretimi için uygun olduğunu bulduk. Bu nedenle, anti-CD3 ve anti-CD28 konsantrasyonları titre ve her laboratuvar (Tablo 2) için optimize edilmelidir.
2. Otoklav veya dezenfektan çözeltisi ile diseksiyon araçları (makas ve forseps) bir dizi sterilize. Bir tüp veya% 70 etanol içeren küçük beher disseksiyonlarında arasındaki araçların hızlı sterilizasyon için gerekli olacaktır. Son olarak,% 70 etanol ihtiva eden bir sprey şişesi diseksiyon önce fare yüzey sterilize etmek için gerekli olacaktır.
3. Alüminyum folyo düz strafor parçası veya Corkboard sararak bir diseksiyon yüzey hazırlayın. Kesme veya iğne yerine hayvan sabitlemek için kullanılır.
4. Ti toplanması için yemekler ya da tabak hazırlayınssues. Havuzu dokular halinde, 3 ml ihtiva eden ayrı bir 60 mm tabaklar steril PBS + dalak ve lenf düğümü dokular için FBS (PBS +) yeterlidir% 1. Tek tek farelerden tutmak dokular ayrı ise, kuyulara, arzu edilen sayıda PBS + 'nın bir 24-çukurlu plaka ihtiva eden 1 ml hazırlar.
5. Kullanmadan önce, hücre kültürü ve ön sıcak için tam RPMI ortamı hazırlanması (Tablo 1).
   NOT: Biz rutin RPMI kullanmak ancak IMDM'de ve DMEM gibi diğer medya eşit derecede etkilidir ya da laboratuarda deney ve bağlı üstün olabilir.
6. Naylon kareler sterilize etmek için bir 120 um gözenek büyüklüğü ve otoklav ile örgü Kesme 2x2 sm (Tablo 1).
7. İsteğe bağlı: CD4 ⁺ hücre zenginleştirme öncesi sıcak koşma için autoMACS olarak sisteme sıralama yüksek hızlı manyetik hücre kullanarak ve makineye zarar görmesini önlemek için 37 ^o C su banyosunda tamponlar durulama ise.
8. Not: Zenginleştirme ayırma verimi artırmak ve zaman ayırma azaltmak için tavsiye edilir.
9. Tümhazırlama aşamaları, diseksiyon için hariç olmak üzere, bir steril doku kültürü kaputu yapılmalıdır.

Fareler gelen Lenf Nodu ve Dalak 2. izolasyonu

1. Bir kurumsal onaylı tekniği kullanılarak hayvanların gerekli sayıda Euthanize. Olarak, erkek göre naiv T hücreleri ve alt vücut yağ yüksek oranda veya daha yaşlı farelerin C57BL / 6 dişi fareler, yaş, 5-10 hafta boyunca, kullanın.
   Not: erkek farelerden elde edilen hücreler in vitro olarak benzer gerçekleştirir ve protokol safhaları aynı kalır. 5-10 hft dişi fareler, genellikle fare başına 3-6 x 10 ⁶ naif CD4 ⁺ T hücreleri verecektir. Ancak, fareler kullanılarak çeşitli tipleri verim ve performansını etkileyebilir. Örneğin, C57BL / 6 farelerinden alınan hücreler Balb.c farelerden aldıkları hücreler kullanarak, Th2 hücrelerin üretilmesi için daha iyi ise, Th1 hücrelerinin üretilmesi için daha iyidir.
2. Hayvan uzuvları yaymak ve Şekil 1'de gösterildiği gibi yerde pin. Uzun cildi kesinDikkatli olmak itudinally çene anüs değilken derin doku delinme.
3. Yayılması forseps ile cildi açın ve Şekil 1'de gösterildiği gibi lenf düğümlerine kolay erişim sağlamak için yerinde cilt pin.
4. Şekil 1'de gösterilen yerlerden erişilebilir lenf düğümleri Hasat. Forseps bir çift ile lenf düğümü kapma forseps başka bir çift ile doku ayıran kolay çıkarılması için izin verir ise. Toplama kabındaki doku yerleştirin.
5. Şekil 1 'de gösterilen konumdan dalak hasat edilir. Bu durumda, periton içine dikkatli bir kesme dalak erişmek için gereklidir. Bir toplama kabına doku yerleştirin.
6. Daha fazla dokular hasat edilecektir işlemi tekrarlayın. Aksi takdirde bir sonraki adımlara geçin. Bu noktada, sıralama sonra T hücrelerinin kaplama kadar buz üzerinde kalan tüm adımları.

3. Doku İşleme ve CD4 ⁺ Zenginleştirme

1. Küçük lökosit ölümle sonuçlanabilir eritrosit lizis gerekmez lenf nodu hücre preparatları olarak verimi artırmak için farklı yemekler lenf düğümleri ve dalak işleyin. Bu nedenle, aşağıdaki adımlar ayrıca sıralama için etiketleme önce araya getirilmesi, sonra dalak ve lenf düğümü popülasyonlarının işlenmesi için bir yöntem açıklanmaktadır.
2. PBS + 3 ml içeren yeni bir 60 mm çanak toplama çanak ve yerden doku (dalak veya toplanmış lenf nodları) sökün. Sterilize forseps kullanarak doku üzerinde örgü steril naylon bir kare yerleştirin.
3. Bir şırınga pistonu başparmak tarafına (3-10 ml) alın ve yavaşça örgü karşı doku şut. Hemen hemen tüm doku süspansiyonu gitmek gerekir. Alternatif olarak, iki Otoklavlanmış buzlu slaytlar arasındaki doku yerleştirmek ve süspansiyon içine öğütülmüş.
4. Süspansiyon yukarı Pipet ve bir kaç kez aşağı kalan çözünebilir öbekler kırmak için. Bir açılması üzerine naylon örgü yeni bir kare parça yerleştirin15 ml konik tüp ve kalan enkaz kaldırmak yoluyla süspansiyon filtre.
5. Tekrar ek lenf nodu ve dalak dokusu için 2-4 adımları.
6. Süspansiyon 15 ml tüp içine süzüldü sonra PBS + ile borunun kalan dolgu ve birkaç kez ters çevirin. 4 ^o C'de 5 dakika boyunca 475 xg'de hücreleri santrifüj
7. Dalak hücreleri için, yüzer, aşağıdaki santrifüj aspire ve eritrositleri lizise uğratmak üzere, 1 dakika için dalak başına buzla soğutulmuş 1X ACK çözeltisi, 1 ml hücre pelletini. Daha sonra, ACK üstünde PBS + 10 ml ilave tüp ters ve santrifüj 475 x g 4 ^O ° C'de 5 dakika boyunca
8. Lenf nodu hücreleri için, PBS + 2 ml süpernatant ve tekrar süspansiyon aspire. Arzu edildiği takdirde, bu da ACK liziz ve yıkama aşamasından sonra, dalak hücreleri ile birleştirilebilir.
9. PBS + ve bir 10 ml splenositlerin santrifüj ve tekrar süspansiyon sonra süpernatan aspire. Bu noktada, lenf nodu süspansiyon birdalak süspansiyon üstünde dded doku havuzu sıralamak için gerekli ise. 4 ^O ° C'de 5 dakika boyunca 475 x g hızında tekrar santrifüj tüpü
10. Hücre pelet şimdi CD4 zenginleşmesi için hazırlanmış olabilir. Bu adımı gerçekleştirilmez ise, sıralama hazırlık adımlara devam edin.
11. Yüksek hızlı manyetik hücre sıralama sistemini kullanarak CD4 zenginleştirme için, CD4 boncuklar ile hücresel pelletini. Tipik haliyle, PBS + 85 ul seyreltilmiş boncuk 15 ul 1 fare dokuları etiketlemek için kullanılır. Gerektiği gibi, boncuk karışımı sesini rampa pelletini ve 4 ^o C'de 15-30 dakika inkübe
12. PBS + 10 ml hücreleri yıkayın 4 ^O ° C'de 5 dakika boyunca 475 x g hızında tekrar artıkları ve santrifüj çıkarmak için yeni bir 15 ml tüp içine naylondan süspansiyon geçmesi
13. Fare başına PBS + 100 ul pelet yeniden süspanse edin ve yüksek hızda manyetik hücre sınıflandırma sistemi üzerinde olumlu seçim geçin. Manuel ayırma sistemi, f kullanıyorsanızzenginleştirme için üreticinin talimatlarını ollow. Seçenek olarak ise, FACS tampon çözeltisi içinde tekrar süspansiyon örnekleri PBS, 1 mM EDTA (pH = 8) ve% 1 BSA, steril olarak filtreden geçirilmiş olan.
14. Pozitif kısmını çıkarın ve PBS + 10ml ile tekrar yıkayın. zenginleştirilmiş CD4 ⁺ fraksiyonu şimdi sıralamak için etiketli hazırdır.

4. Ayırma Naif CD4 ⁺ T hücreleri

1. PBS CD62L, CD44, CD25, CD4 ve karşı yöneltilmiş içeren floresan antikorlar + hücre pelet etiketleyin. Tablo 1 'de listelenen antikorlar kullanılarak, her biri için seyreltme sağlanır. Boyama için, antikor kokteylinin bir 100 ul hacim, bir fare doku başına kullanılır.
2. Antikor kokteyli pelletini tekrar ve karanlıkta 4 ^o C'de 15-30 dakika inkübe.
3. 4 ^O ° C'de, PBS + 10 ml santrifüj 475 x g 5 dakika boyunca hücreleri yıkayın
4. Yeniden başka bir naylon filtre veya hücre süzgeç kapağı üzerinde karışımı geçmekherhangi bir artık enkaz taşıyın. Hücre sıralayıcı ile uyumlu olan bir tüp içine etiketli hücreler Pipet. Buz üzerinde hücreleri tutun ve tür kadar ışıktan korunmalıdır.
5. Bir hücre sıralayıcı toplama uyumlu tüplerin dibine tam RPMI ortam veya FBS 1-2ml pipetleme toplama tüpleri hazırlayın.
6. Sıralama bir CD4 ⁺ CD25 gibi naif CD4 ⁺ T hücreleri ^- CD62L ⁺ CD44 ^- nüfusun (Şekil 2). Tam RPMI ortamı ile toplanan hücreler yıkanır ve yukarıda tarif edildiği gibi santrifüj.
7. Tam RPMI içinde pelletini saf hücrelerin sayısı ve 1 x 10 ⁶ hücre / ml konsantrasyonu ayarlanır.

5. in vitro Farklılaşma Kurma

1. Anti-CD3 ve anti-CD28 kaplı plakalara çukurlarına aspire ve steril PBS (hiç FBS) ve 1 ml her bir yıkayın. 48 oyuklu plakalar için, RP 0.5 x 10 ⁶ hücre / oyuk olarak 0.5 ml plakaMI. 24 oyuklu plakalar, kültür 1 x 10 ⁶ hücre RPMI / oyuk içinde 1.0 ml.
2. Bu tür bir ilaç olarak, bir faktör etkisi test sırasında ya da daha önce, uygun oyuklara madde ekleme veya deneye bağlı olarak farklılaşma sonra ise. Sonraki, buna göre sitokinler ve engelleme antikorlar ile kültür ortamı tamamlamaktadır. Th0: 30 U / ml hIL-2. Th1: 15 ng / ml rmIL-12, 30 U / ml hIL-2 ve 5000 ng / ml 11B11.Th2: 10 ng / ml rmIL-4, 30 U / ml hIL-2, 2.000 ng 37,51 çözünür / ml, 5000 ng / ml XMG1.2. iTreg: 15 ng / ml hTGFβ, 30 U / ml hIL-2, 5.000 ng / ml XMG1.2 ve 5.000 ng / ml 11B11. Th17: 20 ng / ml rmIL-6, 3 ng / ml hTGFβ, 5000 ng / ml XMG1.2 ve 5.000 ng / ml 11B11.
   Not: Yukarıda belirtilen koşullar farklılaşma deneyinde (Örnek Sonuçlar bölümü) sonunda ölçülen sitokin üretimini maksimize etmek için en uygun olduğu bulunmuştur. Ancak, her koşul her laboratuvar (Tablo 2 için optimize edilmelidir ). Ayrıca, plakaya bağlı anti-CD28 ile birlikte çözünür anti-CD28 eklenmesi laboratuvarımızda Th2 sitokin üretimini arttırdığı bulunmuştur, fakat diğer T hücresi alt kümelerinin herhangi bir etkiye sahip olduğu bulunmuştur:
3. Önceden gen ifadesi ve sitokin üretimi analizine d 4-5 için% 5 _CO2 ile ³⁷ C 'de plaka inkübe edin. Seçenek olarak ise, hücre proliferasyonunu ve son verimi artırmak için, taze ortam ile 1 x 10 ⁶ hücre / ml olacak şekilde ayarlandı, 2 gün sonra, TCR uyaranlara hücreleri çıkarmak ve yeni bir kuyu (kaplamasız) plaka. Bu durumda, taze polarize sitokinler ve antikorlar gerekli değildir, ancak, IL-2, 10 U / ml Th0, Th1, Th2 ve iTreg kültürleri için yeni ortama ilave edilmelidir.

Farklılaşma 6. Analizi

1. Akış sitometrisi ile sitokin analizi için, / ml iyonomisin veya 1 ug (örneğin, bir Brefeldin bir Golgi inhibitörünün varlığında 4-6 saat süre ile, anti-CD3 / ml Tablo ng 10ng / ml PMA ve 1000 ile her bir yeniden uyarmak1). Hücre içi sitokin boyama deney bağlı (Şekil 3) gerçekleştirin.
   Not: Leke olmayan soy spesifik sitokinler ya da (gösterilmemiştir), IL-4 ve IFNy gibi transkripsiyon faktörleri, negatif kontroller olarak ve farklılaşma verimliliği bir göstergesi olarak her bir durum için, Th17 kültürler için (Şekil 3). Ayrıca, Tregs karşılıklı bir gelişme olarak, Th17 kültürleri için leke Foxp3 TGFβ eklenmesi ile meydana gelebilir.
2. Protein ölçümü için, sitokine spesifik ELISA (Şekil 3), her bir sıra ve testte süpernatantlar toplamak. Test edilen faktör kontrol numuneleri ile karşılaştırıldığında hücre proliferasyonunu etkilediğini endişe varsa, hücreler, yıkanabilir, normalize sayılır ve ELISA tahlilleri için süpernatanların toplanması önce 24 saat boyunca anti CD3 1 ug / ml ile yeniden uyarılan. L kadar olabilecektir, IL-4 koşulları, yıkama ve tekrar uyarılmasından gereklidir Th2'den IL-4 kaldırmak için tahlil halindeİlk türev kültüründen eftover.
3. Gerçek zamanlı PCR ile gen ekspresyon analizi için hasat hücreleri kuluçka döneminden sonra, yıkama, normalize, ve anti-CD3 ve 1 ug / ml hasat mRNA önce (Şekil 3) ile 2-6 saat boyunca tekrar harekete geçirir.

Sonuçlar

İnci durumuna bağlı olarak değişebilir farklılaşma analizi için zaman noktası T hücresi reseptör aktivasyonunun gücü gibi test edilir. Farklılaşma 2-3 gün sonra hücreler, T-hücresi çoğalması derecesini tespit etmek için ışık mikroskobu ile görselleştirilebilir. Hücrelerin çoğalmasını ve geniş topaklanma sergileyen Wells muhtemelen büyük olasılıkla kültüründe 4 gün sonra ortam tüketecektir, eksojen IL-2, örneğin, Th1 ve Th2 olarak ilave dayanarak günde 4 Farklılaşma koşulla...

Tartışmalar

Dalak saf Th hücreleri içerir, lenf düğümleri, bu nüfus oranı çok daha yüksektir. Düzgün, bu protokolde lenf düğümleri tespit ve kaldırmak için Başarısızlık saf hücrelerin kötü verim neden olacaktır. Bu daha çok yağ dokusu olması yaşlı farelerin ya da erkek farelerde özellikle zor olabilir. Hayvan bacaklarda ve cilt Şekil 1, uygun bir sabitleme ve çivileme gösterildiği gibi erişilebilir dış lenf nodu kolay görselleştirme için izin verir. Lenf düğümleri ve dalak...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Complete RPMI:			Warm in a 37 oC water bath before use
RPMI 1640 Media	Life Technologies	11875119
10 % FBS	Life Technologies	26140-079
1000X 2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
100X Pen/Strep	Life Technologies	15140122
100X L-glutamine	Life Technologies	25030081
120 micron nylon mesh	Amazon	CMN-0120-10YD	Cut into 2 cm2 squares and autoclave
Alternative: 100 micron cell strainers	Fisher	08-771-19	Alternative to cutting nylon mesh
autoMACS running buffer	Miltenyi	130-091-221	Warm in a 37 oC water bath before use
autoMACS rinsing solution	Miltenyi	130-091-222	Warm in a 37 oC water bath before use
CD4 beads	Miltenyi	130-049-201
ACK lysis buffer	Life Technologies	A10492-01
Cytokines:
Human (h) IL-2	Peprotech	200-02
Recombinant mouse (rm) IL-4	Peprotech	214-14
rmIL-6	R & D Systems	406-ML-025
rmIL-12	Peprotech	210-12
hTGFb	R & D Systems	240-B-010
Antibodies:
2C11 (anti-CD3)	BioXcell	BE0001-1
37.51 (anti-CD28)	BioXcell	BE0015-1
11B11 (anti-IL-4)	BioXcell	BE0045
XMG1.2 (anti-IFNg)	BioXcell	BE0055
anti-CD62L-FITC	BioLegend	104406	Use at 1:100
anti-CD25-PE	BioLegend	102008	Use at 1:400
anti-CD4-PerCP	BioLegend	100434	Use at 1:1000
anti-CD44-APC	BioLegend	103012	Use at 1:500
Phorbol  12-myristate 13 acetate (PMA)	Sigma-Aldrich	P-8139	Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I-0634	Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC
Brefeldin A	eBioscience	00-4506-51	Use at 1:1000