העכבר נאיבי CD4<sup&gt; +</supו&gt; בידוד תא T<em&gt; במבחנה</em&gt; בידול לתוך תת תא T

Summary

Naïve CD4⁺ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of naïve CD4⁺ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Abstract

Antigen inexperienced (naïve) CD4⁺ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a naïve CD4⁺ T cell. Although the cytokine environment during naïve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4⁺ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4⁺ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of naïve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing naïve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Introduction

הרעיון של שושלות או תת קבוצות של עוזר CD4 ⁺ T מובחנים תאים (ה ') כבר בסביבות מאז שלהי המאה ^ה -20 ^1. הכרה של אנטיגן המקור בנוכחות תוצאות אותות costimulatory בכמה סבבים של התרבות תאים וההתמיינות הסופית למפעיל Th תאים. סוג Th תא שנוצר במהלך תהליך זה תלוי בסביבת ציטוקינים נוכחת במהלך ההפעלה ^2. בתחילה, תאי Th נאיביים נחשבו ללקטב לתוך 2 שושלות שונות הבאים קולט תא T הפעלה (TCR), קשירת CD28 costimulatory, ואיתות ציטוקינים. תאים מסוג 1 עוזר (Th1) מתאפיינים בייצור שלהם מפעיל של ציטוקינים IFNγ כמו גם הדרישה שלהם לאיתות IL-12 במהלך ^3,4 תהליך ההתמיינות. סופו של דבר התברר שיש לי תאי Th1 מובחנים פרופיל גנטי שמאופיין ב מובהק ביותרy הביטוי של גורם שעתוק משפחת תיבת T, Tbx21 (T-הימור), הנחשב לרגולטור הראשי של התכנית הגנטית Th1 ^5. יתר על כן, IL-12, כמו גם IFNγ יכול לקדם את ביטוי T-הימור ^6,7. בתגובה החיסונית, תאי Th1 חשובים להגנה מפני פתוגנים המארח תאיים, כמו גם יזמים חזקים של דלקת אוטואימונית. בניגוד לכך, תאים מסוג 2 עוזר (Th2) דורשים IL-4 לפיתוחם וציטוקינים מפעיל שלהם, כולל IL-4, IL-5, ו- IL-13, הם חשובים לנהיגת תגובות תא B והם פתוגניים באלרגיה ^{8, 9.} בדומה לתאי Th1, תאי Th2 נמצאו להביע רגולטור תעתיק הורים שלהם, כינה Gata-3 ^10,11. מעניין לציין, כי הנוכחות של ציטוקינים קיטוב והדור של שושלת Th ספציפית הם עוינות להתפתחותם של אחרים ^2,12, המצביע על כך רק קבוצת משנה Th מסוימת עשויה להיות דומיננטית במהלך מחדש חיסוניsponse.

מאז זיהוי של שושלות Th1 וTh2, עבודה נוספת הוכיחה עוד יותר ייחודי תת קבוצות של תאי T helper, כוללים עוזר זקיקים (TFH), IL-9-ייצור (Th9), וIL-22-ייצור (Th22) (לאחרונה בביקורת ב- ^13). לצורך ניסויי בידול במבחנה, פרוטוקול זה יתמקד רק בשני תת Th נוסף, המכונה תאי T רגולטורים (Treg) וIL-ייצור-17 תאי CD4 ⁺ T (TH17). CD25 ⁺ תאי T רגולטורים יכולים להתרחש באופן טבעי (nTreg) בבלוטת התימוס; תאי Th נאיביים יכולים להיות גם מושרה (iTreg) להפוך לרגולציה בפריפריה (שנסקרה ^ב14,15). שני הסוגים של Tregs להביע גורם שעתוק אופייני, כינה P3 forkhead התיבה (Foxp3), שהוא קריטי למנגנוני דיכוי מפעיל שלהם הכוללים ייצור אנטי דלקתי מסיס מתווך, IL-2 הצריכה, ותא מנגנוני קשר תלוי ^14,15. חוסר Foxp3 תוצאות ביטוי בהפרעה אוטואימונית חמורה, רב-איבר כינו dysregulation חיסוני, polyendocrinopathy, enteropathy, תסמונת X-צמוד (אייפקס), הממחישה את התפקיד הקריטי של קבוצת משנה Th זה בפתרון דלקת והסדרת סובלנות היקפית לעצמי אנטיגנים ^16. במבחנה, תאי CD4 ⁺ T helper נאיביים להסדיר את-Foxp3 ולהיות מחויבים לתכנית Treg על גירוי עם IL-2 וTGF-β ^14,15. ייתכן שיש מתון לפלסטיות רבה בשושלות תאי CD4 ⁺ T, במיוחד כאשר בוחנים ייצור ציטוקינים רק (שנסקר ^ב17,18). עם זאת, למטרות פרוטוקולי בידול במבחנה, נדונונו בכל תת-קבוצה כשושלת ייחודית.

לאחרונה, קבוצת משנה של תאי TH17 שמייצר ציטוקינים IL-17 זוהתה כשושלת ייחודית עם פונקציות פרו-דלקתיות הבמיוחד פתוגניים בדלקת אוטואימונית ^19-21. תאי TH17 להביע גורם שעתוק ייחודי, t גמא קולט היתום הקשורות retinoid מכונה (RORγt) המרכז את התכנית הגנטית TH17 ^22. TGFβ חשוב לדור של שושלת TH17 דרך האינדוקציה של RORγt. עם זאת, ההשפעה של איתות TGFβ הוא האמין כדי לגרום רק מחויבות TH17 על synergizing עם IL-6 (הנסקרת ב ^12). מחקרים נוספים הראו כי מגוון רחב של אותות אחרים שיכולה באופן חיובי להסדיר את מחויבות TH17, כולל IL-1β, נתרן מוגבר, וTLR איתות ^23-26. דיווחים אחרים לא הציעו כי תאי TH17 פתוגניים in vivo הם אלה שלמעשה לעקוף איתות TGFβ ובמקום להסתמך על שילוב של IL-1, IL-6, IL-23 והבידול שלהם ^27. כך, תאי TH17 ניתן לגזור ממגוון רחב של מסלולי איתות; מסלול למטרות פרוטוקול זה, משמש בדרך כלל-(TGFβ וIL-6) למחויבות שושלת TH17יוצג.

פרוטוקולי הבידול מתוארים להלן לכל שושלות מפעיל מסתמך על נוגדנים קבועים כגירויים לTCR וCD28 במהלך הקורס כולו של הניסוי. עם זאת, אחרים הראו כי הפעלת TCR עם תאי מציגי אנטיגן ²⁸ או אנטי-CD3 ונוגדנים נגד CD28 עם נוגדן אוגר cross-linking במשך 2 ימים ²⁹ גם אמצעי היעיל ביותר לגרימת הדור של תת Th השונים. הפרוטוקול המובא כאן מתבסס על שיטות שדווחו בעבר לבידוד תאי CD4 ⁺ T עכבריים מאיברי הלימפה משניים ³⁰ ויצירת תאי TH17 ^31. אחד הבדלים עיקריים הוא שפרוטוקול זה מסתמך על השימוש בסדרן תא לבודד תאי CD4 ⁺ T נאיביים מרקמות הלימפה. עם זאת, חברות רבות מציעות כעת ערכות הפרדה מהירות שיכול להעשיר לתאי CD4 ⁺ T הנאיבי, שייתכן שתוכל לעקוף את דרישת fאו מיון בהתאם לניסוי. השיטות וחומרים הכימיים שהוצגו בפרוטוקול זה מה שאנחנו משתמשים באופן שיגרתי ולמצוא להיות היעיל ביותר. עם זאת, יש לזכור כי חומרים כימיים ושיטות אלטרנטיביים קיימות עבור רבים מהצעדים שיוצגו להלן וזה תלוי למעבדה בודדת כדי לקבוע מה יעבוד הכי טוב למטרות שלהם.

Protocol

כל הליכי הניסוי מבוצעים תוך שימוש בפרוטוקולים שאושרו על ידי משרד בריאות הסביבה והבטיחות באוניברסיטת פרנקלין רוזלינד לרפואה ומדע. C57BL / 6 עכברים (שנרכשו מNCI) המשמשים לפרוטוקול זה שוכנו בתנאי הפתוגן ללא ספציפיים, וכל הניסויים בבעלי החיים בוצעו באמצעות פרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת טיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים (IACUC) באוניברסיטת פרנקלין רוזלינד לרפואה ו מדע.

1. הכנה של מכשירים, ציוד, וריאגנטים

1. צלחות מעיל 48 היטב או 24 גם עם אנטי CD3 ואנטי CD28 (טבלה 1) בPBS סטרילי, מכסים ולעטוף בparafilm על מנת למנוע אידוי וזיהום, ולאחר מכן דגירה O / N ב 4 ^o C היום לפני T תא בידוד. לחלופין, h 1 בארות מעיל ב 37 ^o C. בצע תנאי Th0, Th1, Th2, וiTreg על ידי ציפוי שני אנטי-CD3 ואנטי-CD28 ב1μg / מיליליטר ב0.5-1 מ"ל לטל נפח (צלחת 48-היטב). לTH17, אנחנו בדרך כלל מעיל אנטי-CD3 ב2 מיקרוגרם / מיליליטר ואנטי-CD28 ב1 מיקרוגרם / מיליליטר.
   הערה: מצאנו כי ריכוז אנטי-CD3 נמוך הוא אופטימלי עבור דור Th1, Th2, וiTreg תוך ריכוז אנטי-CD3 גבוה יותר הוא אופטימלי עבור דור TH17. לפיכך, יש טיטרציה אנטי-CD3 וריכוזים אנטי CD28 ומותאם למעבדות בודדות (טבלה 2).
2. לעקר סט של כלים לנתיחה (מספריים ומלקחיים) על ידי פתרון החיטוי או חומר חיטוי. צינור או כוס קטנה המכילה 70% אתנול יהיה צורך העיקור מהיר של כלים בין ניתוחים. לבסוף, בקבוק תרסיס המכיל 70% אתנול יהיה צורך לחיטוי את פני השטח של העכבר לפני הנתיחה.
3. הכן משטח לנתיחה על ידי לפפה חתיכה שטוחה של קלקר או לוח שעם ברדיד אלומיניום. סיכות או מחטים לנתח משמשות כדי לתקן את בעלי החיים במקום.
4. להכין מאכלים או צלחות לאיסוף tissues. אם רקמות איגום, 60mm מנות נפרדות המכילות 3ml של סטרילית PBS + 1% FBS (PBS +) לרקמות טחול ובלוטות לימפה הוא מספיק. אם רקמות שמירה מעכברים בודדים להפריד, להכין 1ml צלחת 24-המכיל גם של PBS + במספר הרצוי של בארות.
5. הכן תקשורת RPMI מלא לתרבית תאים וטרום חם לפני השימוש (טבלה 1).
   הערה: אנו משתמשים באופן שגרתי RPMI אבל מדיה אחרת כגון IMDM וDMEM עשויה להיות יעילה באותה מידה או מעולה בהתאם למעבדה והניסוי.
6. סנטימטר Cut 2x2 ריבועים של רשת ניילון עם גודל נקבובית 120 מיקרומטר וחיטוי לעקר (טבלת 1).
7. אופציונאלי: אם משתמש בתא המגנטי במהירות הגבוהה מיון מערכת כגון autoMACS להעשרת תאי CD4 ^+, ריצה טרום חמה ושטיפת מאגרים באמבט מים C 37 ^o כדי למנוע נזק למכונה.
8. הערה: העשרה מומלץ להגדיל את התשואה ולהקטין מיון מיון זמן.
9. כלצעדי הכנה, פרט לנתיחה, צריכים להתבצע בברדס רקמת סטרילית תרבות.

2. בידוד של בלוטות לימפה וטחול מעכברים

1. להרדים את המספר הדרוש של בעלי חיים באמצעות טכניקה שאושרה על-מוסדי. השתמש C57BL / 6 נקבות עכברים, גיל 5-10 wks, בשל אחוז הגבוה שלהם של תאי T נאיביים ושומן בגוף נמוך יותר בהשוואה לגברים או לעכברים מבוגרים.
   הערה: תאים שנלקחו מעכברים ממין זכר יהיו לבצע באופן דומה במבחנה והצעדים הפרוטוקול יישארו זהים. נקבות עכברים, ישנים 5-10 wks, בדרך כלל יניבו 3-6 x 10 ⁶ תאי CD4 ⁺ T נאיביים לכל עכבר. עם זאת, זנים השונים של עכברים באמצעות עלולים להשפיע על תשואה וביצועים. לדוגמא, תאים מעכברי C57BL / 6 הם טובים יותר ליצירת תאי Th1 תוך תאים מעכברי Balb.c טובים יותר ליצירת תאי Th2.
2. מורחים את הגפיים של בעלי החיים ולהצמיד אותם במקום, כפי שמוצג באיור 1. חותך את העור ארוךitudinally מפי הטבעת לסנטר והקפד לא לנקב רקמות עמוקות יותר.
3. התפשטות לפתוח את העור עם מלקחיים ולהצמיד את העור במקום לאפשר גישה קלה לבלוטות הלימפה, כפי שמוצגת באיור 1.
4. לקצור את בלוטות לימפה נגישות מהמקומות שמוצגים באיור 1. תופסת הבלוטה לימפה עם זוג המלקחיים תוך הפרדת רקמות עם עוד זוג המלקחיים תאפשר להסרת קלה. הנח את הרקמה בצלחת האוסף.
5. לקצור את הטחול מהמיקום שמוצג באיור 1. במקרה זה, יש צורך בחיתוך זהיר להצפק כדי לקבל גישה לטחול. הנח את הרקמה בצלחת אוסף.
6. חזור על התהליך אם יותר רקמות תהיה לקצור. אחרת להמשיך לשלבים הבאים. בשלב זה, לבצע את כל השלבים הנותרים על קרח עד הציפוי של תאי T לאחר המיון.

3. עיבוד רקמות וCD4 ⁺ העשרה

1. לעבד את בלוטות הלימפה וטחול במנות שונות כדי להגדיל את התשואה וההכנות בלוטה לימפה תא אינו דורשות תמוגה כדורית אדומה, אשר עלול לגרום למוות לויקוציטים קטין. לכן, בשלבים הבאים מתארים שיטה לעיבוד אוכלוסיות טחול ובלוטות לימפה בנפרד ואחריו שילוב לפני תיוג למיון.
2. להסיר את הרקמה (טחול או בלוטות לימפה ותקווינה) מצלחת האוסף ומניחים בצלחת 60 מ"מ חדשה המכילה 3 מיליליטר של PBS +. הנח זווית של ניילון סטרילי רשת על הרקמות באמצעות מלקחיים מעוקרים.
3. קח את צד האגודל של בוכנת מזרק (3-10 מיליליטר) ובעדינות לנפץ את הרקמה נגד הרשת. כמעט כל הרקמה צריך ללכת להשעיה. לחלופין, הנח את הרקמה בין שתי שקופיות חלבית autoclaved וחרק להשעיה.
4. פיפטה ההשעיה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לשבור את הגושים מסיסים שנותרו. מניחים חתיכה מרובעת חדשה של רשת ניילון על הפתיחהצינור חרוטי 15 מ"ל ולסנן את ההשעיה דרך להסיר את הפסולת שנותרה.
5. חזור על שלבים 2-4 לבלוטה לימפה נוספת ורקמת טחול.
6. ברגע שההשעיה סוננה לתוך צינור 15 מ"ל למלא את שארית הצינור עם PBS + ולהפוך כמה פעמים. צנטריפוגה התאים ב475 XG במשך 5 דקות ב 4 ^o C.
7. לתאי טחול, לשאוב צנטריפוגה הבאה supernatant ו resuspend התא גלולה ב 1 מיליליטר של קר כקרח פתרון 1X ACK לטחול דקות 1 לlyse אריתרוציטים. לאחר מכן להוסיף 10 מיליליטר של PBS + על גבי ACK, להפוך את הצינור, ו צנטריפוגות 475 XG במשך 5 דקות ב 4 ^o C.
8. לתאי בלוטה לימפה, לשאוב supernatant וגלול ב2ml של PBS +. אם ארצה ניתן לשלב הבאים עם תאי הטחול לאחר תמוגה ACK שלהם ושלב כביסה.
9. לשאוב supernatant לאחר צנטריפוגה של splenocytes וגלול בעוד 10 מיליליטר של PBS +. בשלב זה ההשעיה בלוטות לימפה יכולה להיותdded על גבי ההשעיה הטחול אם נדרש איגום רקמה למיון. צנטריפוגות הצינור שוב ב475 XG במשך 5 דקות ב 4 ^o C.
10. התא גלולה עכשיו יכול להיות מוכן להעשרת CD4. אם שלב זה לא יבוצע, להמשיך לשלבי הכנת המיון.
11. להעשרת CD4 באמצעות מערכת מיון תא המגנטית במהירות הגבוהה, resuspend גלולה הסלולרי עם חרוזים CD4. בדרך כלל 15 μl של חרוזים מדוללים ב -85 μl של PBS + משמש לתייג רקמות מהעכבר 1. כבש את הנפח של תערובת חרוז לפי צורך, resuspend גלולה, ודגירה של 15-30 דקות ב 4 ^o C.
12. לשטוף את התאים עם 10 מיליליטר של PBS +, להעביר את ההשעיה דרך ניילון לתוך צינור 15 מיליליטר חדש כדי להסיר שאריות, וצנטריפוגות שוב ב475 XG במשך 5 דקות ב 4 ^o C.
13. Resuspend גלולה ב+ של PBS לכל עכבר 100 μl ולהמשיך לבחירה חיובית על מערכת תא מגנטי במהירות הגבוהה מיון. אם אתם משתמשים במערכת הפרדה ידנית, וollow הוראות היצרן להעשרה. לחלופין, resuspend הדגימות במאגר FACS: PBS עם 1 המ"מ EDTA (pH = 8) ו -1% BSA, מסונן סטרילי.
14. הסר את החלק החיובי ולשטוף שוב עם 10 מ"ל של PBS +. חלק CD4 ⁺ המועשר מוכן להיות מתויג למיון עכשיו.

4. תאי המיון הנאיביים CD4 ⁺ T

1. תווית התא גלולה עם PBS + נוגדני ניאון מכילים מכוונים נגד CD62L, CD44, CD25, וCD4. אם באמצעות הנוגדנים המופיעים בטבלה 1, דילולים עבור כל מסופקים. עבור מכתים, 100 μl נפח של הקוקטייל של הנוגדנים משמש לרקמות מעכבר אחד.
2. Resuspend גלולה בקוקטייל של נוגדנים ודגירה של 15-30 דקות ב 4 ^o C בחושך.
3. לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של PBS + ו צנטריפוגות 475 XG במשך 5 דקות ב 4 ^o C.
4. להעביר את התערובת מעל מכסה מסנן ניילון או מסננת תא אחר מחדשלהעביר כל שאריות פסולת. פיפטה התאים שכותרתו לתוך צינור שתואם לסדרן התא. שמור את התאים על קרח ומוגן מפני האור עד הסוג.
5. הכן צינורות אוסף ידי pipetting 1-2ml של תקשורת RPMI מלאה או FBS לתוך החלק התחתון של צינורות תואמים לאוסף על סדרן תא.
6. מיין תאי CD4 ⁺ T הנאיביים כCD4 ⁺ CD25 ^- CD62L ⁺ CD44 ^- אוכלוסייה (איור 2). שוטף את התאים שנאספו עם תקשורת RPMI מלאה ו צנטריפוגות כמתואר לעיל.
7. Resuspend גלולה בRPMI המלא, לספור את התאים הנאיביים, ולהתאים את הריכוז עד 1 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר.

5. הגדרת הבידול במבחנה

1. לשאוב את הבארות של הצלחות המצופים אנטי CD3 ואנטי CD28 ולשטוף היטב עם כל 1ml של PBS סטרילי (לא FBS). לצלחות 48-היטב, צלחת 0.5 x 10 ⁶ תאים / גם ב 0.5 מיליליטר של RPMI. לצלחות 24 גם, תרבות 1 x 10 ⁶ תאים / גם ב1.0 מיליליטר של RPMI.
2. אם בודק את ההשפעה של גורם כגון סמים להוסיף חומר לבארות המתאימות גם לפני, במהלך או אחרי תהליך ההתמיינות בהתאם לניסוי. בשלב הבא, להשלים את תרבות התקשורת עם ציטוקינים ונוגדני חסימה בהתאם. Th0: 30 U / ml Hil-2. Th1: 15 ng / ml rmIL-12, 30 U / ml Hil-2, ו5,000 ng / ml 11B11.Th2: 10 ng / ml rmIL-4, 30 U / ml Hil-2, 2,000 ng / ml המסיס 37.51, וng 5000 / XMG1.2 מיליליטר. iTreg: 15-2 Hil, 5,000 XMG1.2 מיליליטר / ng, ו5,000 ng / ml hTGFβ, 30 U / ml ng / ml 11B11. TH17: 20 / מיליליטר rmIL-6, 3 ng / ml hTGFβ, 5,000 XMG1.2 מיליליטר / ng, ו5,000 ng ng / ml 11B11.
   הערה: התנאים שהוצגו לעיל נמצאו אופטימלי למקסם את ייצור ציטוקינים כפי שנמדד בסוף ניסוי הבידול (סעיף נציגי תוצאות). עם זאת, כל מצב צריך להיות מותאם למעבדות (טבלה 2 בודדות ). יתר על כן, התוספת של אנטי CD28 המסיס בנוסף לאנטי-CD28-מחויב הצלחת כבר נמצאה לשפר את ייצור ציטוקינים Th2 במעבדה שלנו, אבל אין לו השפעה על תת תא T אחר:
3. דגירה את הצלחת על C 37 ^o עם 5% CO ₂ 4-5 ד לפני הניתוח של ביטוי גנים וייצור ציטוקינים. לחלופין, להסיר את התאים מגירויי TCR לאחר 2 ד, מותאם ל1 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר עם תקשורת טרי, וצלחת בבארות חדשות (לא מצופה) כדי לשפר את ההתפשטות ותשואה סופית. במקרה זה, ציטוקינים קיטוב טריים ונוגדנים אינם נחוצים, אבל 10 U / ml של IL-2 יש להוסיף לאמצעי תקשורת החדש לTh0, Th1, Th2, ותרבויות iTreg.

6. ניתוח של בידול

1. לניתוח ציטוקינים על ידי cytometry זרימה, restimulate היטב עם כל 10ng / ml PMA ו1,000 ng / ml ionomycin או טבלה / מיליליטר אנטי-CD3 במשך 4-6 שעות בנוכחות מעכב Golgi כגון brefeldin (1 מיקרוגרם1). לבצע מכתים ציטוקינים תאיים תלוי בניסוי (איור 3).
   הערה: כתם שאינה שושלת ספציפית ציטוקינים או גורמי שעתוק, כגון IL-4 (לא מוצגים) וIFNγ (איור 3) לתרבויות TH17, לכל מצב כפקדים שליליים וכמדד ליעילות בידול. יתר על כן, Foxp3 כתם לתרבויות TH17 כפיתוח ההדדי של Tregs עלול להתרחש בתוספת TGFβ.
2. לכימות חלבון, לאסוף supernatants מכל assay היטב ועל ידי ציטוקינים ספציפיים ELISA (איור 3). אם קיים חשש שהגורם נבדק השפיע שגשוג בהשוואה לדגימות בקרה, ניתן לכבס את התאים, נספרו, מנורמל, ולאחר מכן restimulated עם 1 מיקרוגרם / מיליליטר של אנטי-CD3 במשך 24 שעות לפני איסוף supernatants למבחני ELISA. אם מנסה לאמוד IL-4 מTh2 תנאים, כביסה וrestimulating יש צורך להסיר IL-4 שעשויות להיות leftover מתרבות הבידול הראשונית.
3. לניתוח ביטוי גנים על ידי PCR בזמן אמת, תאי קציר לאחר תקופת הדגירה, לשטוף, לנרמל, ולעורר מחדש במשך 2-6 שעות עם 1 מיקרוגרם / מיליליטר של אנטי-CD3 לפני mRNA קציר (איור 3).

תוצאות

הנקודה לניתוח הבידול יכול להשתנות בהתאם למצב Th הזמן נבדק, כמו גם את הכוח של הפעלת קולטן תא T. לאחר 2-3 ימים של בידול, ניתן דמיינו תאים על ידי מיקרוסקופ אור כדי לקבוע את מידת התפשטות תאי T. ולס מציג התפשטות ויצירת גושים נרחבות של תאים יהיה ככל הנראה מוכן לניתוח ביום 4. תנאי ב...

Discussion

בעוד הטחול מכיל תאי Th נאיביים, חלקם של אוכלוסייה זו בבלוטות לימפה הוא הרבה יותר גבוה. הכישלון לזהות כראוי ולהסיר בלוטות לימפה בפרוטוקול זה יגרום לתשואה ירודה של תאים נאיביים. זה יכול להיות קשה במיוחד בעכברים מבוגרים או עכברי זכרים שיש לי רקמת שומן יותר. כפי שניתן לראו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Complete RPMI:			Warm in a 37 oC water bath before use
RPMI 1640 Media	Life Technologies	11875119
10 % FBS	Life Technologies	26140-079
1000X 2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
100X Pen/Strep	Life Technologies	15140122
100X L-glutamine	Life Technologies	25030081
120 micron nylon mesh	Amazon	CMN-0120-10YD	Cut into 2 cm2 squares and autoclave
Alternative: 100 micron cell strainers	Fisher	08-771-19	Alternative to cutting nylon mesh
autoMACS running buffer	Miltenyi	130-091-221	Warm in a 37 oC water bath before use
autoMACS rinsing solution	Miltenyi	130-091-222	Warm in a 37 oC water bath before use
CD4 beads	Miltenyi	130-049-201
ACK lysis buffer	Life Technologies	A10492-01
Cytokines:
Human (h) IL-2	Peprotech	200-02
Recombinant mouse (rm) IL-4	Peprotech	214-14
rmIL-6	R & D Systems	406-ML-025
rmIL-12	Peprotech	210-12
hTGFb	R & D Systems	240-B-010
Antibodies:
2C11 (anti-CD3)	BioXcell	BE0001-1
37.51 (anti-CD28)	BioXcell	BE0015-1
11B11 (anti-IL-4)	BioXcell	BE0045
XMG1.2 (anti-IFNg)	BioXcell	BE0055
anti-CD62L-FITC	BioLegend	104406	Use at 1:100
anti-CD25-PE	BioLegend	102008	Use at 1:400
anti-CD4-PerCP	BioLegend	100434	Use at 1:1000
anti-CD44-APC	BioLegend	103012	Use at 1:500
Phorbol  12-myristate 13 acetate (PMA)	Sigma-Aldrich	P-8139	Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I-0634	Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC
Brefeldin A	eBioscience	00-4506-51	Use at 1:1000