Rato Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento de células T e<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciação em subpopulações de células T

Resumo

Naïve CD4⁺ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of naïve CD4⁺ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Resumo

Antigen inexperienced (naïve) CD4⁺ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a naïve CD4⁺ T cell. Although the cytokine environment during naïve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4⁺ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4⁺ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of naïve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing naïve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Introdução

O conceito de linhagens distintas ou subconjuntos de CD4 ⁺ T helper (Th) tem sido em torno desde a última parte do ^século 20 ^1. O reconhecimento de antigénio correspondente na presença de sinais co-estimuladores resultados em diversas fases da proliferação celular e da eventual diferenciação em células Th efectoras. O tipo de célula Th gerada durante este processo é dependente do ambiente citoquina presente durante a activação ^2. Inicialmente, as células Th simples foram pensados ​​para polarizar em duas linhagens distintas seguintes receptor de células T (TCR) de activação, ligação co-estimulador CD28, e sinalização de citocina. Tipo 1 células auxiliares (Th1) são caracterizadas pela sua produção efectora da citoquina IFN-y, bem como a sua exigência de sinalização de IL-12 durante o processo de diferenciação ^3,4. Finalmente, foi descoberto que as células Th1 diferenciadas têm um perfil genético que é distintamente mais caracterizada by a expressão do factor de transcrição da família T box, Tbx21 (T-bet), o qual é considerado o principal regulador do programa genético Th1 ^5. Além disso, a IL-12, bem como de IFN-y pode promover a expressão de T-bet ^6,7. Na resposta imune, as células Th1 são importantes para a defesa do hospedeiro contra agentes patogénicos intracelulares, bem como promotores fortes de inflamação auto-imune. Em contraste, as células auxiliares do tipo 2 (Th2) IL-4 requerem para o seu desenvolvimento e suas citocinas efectoras, incluindo IL-4, IL-5 e IL-13, são importantes para dirigir as respostas das células B e são patogénicas em alergia ^{8, 9.} Semelhante a células Th1, Th2 foram encontrados para expressar seu próprio regulador mestre da transcrição, denominada GATA-3 ^10,11. Interessantemente, a presença de citocinas polarizadoras e a geração de uma linhagem Th são antagonistas específicos para o desenvolvimento de outros ^2,12, sugerindo que apenas um subconjunto Th particular pode tornar-se dominante durante uma re imunerespos-.

Desde a identificação das linhagens Th1 e Th2, a continuação dos trabalhos demonstrou ainda mais exclusivos subconjuntos de células T auxiliares, incluindo folicular auxiliar (TFH), IL-9, produzindo-(Th9), e IL-22 produtoras (Th22) (recentemente revisto em ^13). Para efeitos de experiências in vitro de diferenciação, este protocolo vai se concentrar apenas em dois subconjuntos Th adicionais, chamadas de células T reguladoras (Tregs) e IL-17 produzindo células-T CD4 ⁺ (Th17). CD25 ⁺ células T reguladoras pode ocorrer naturalmente (nTreg) no timo; células Th simples pode também ser induzida (iTreg) para se tornar reguladora na periferia (revisto em ^14,15). Ambos os tipos de Tregs expressar um factor de transcrição característica, denominado forkhead caixa P3 (Foxp3), o qual é crítico para as suas mecanismos efectores que incluem supressão de produção solúvel anti-inflamatória mediador, IL-2 consumo, e os mecanismos de células dependentes de contacto ^14,15. A falta de Foxp3 resultados de expressão em um multi-órgãos distúrbio grave, auto-imune denominado alteração no sistema imunológico, poliendocrinopatia, enteropatia, síndrome do X-linked (IPEX), demonstrando o papel fundamental deste subconjunto Th na resolução de inflamação e regulação tolerância periférica à auto antígenos ^16. In vitro, as células T helper CD4 ⁺ naive-regulam Foxp3 e tornar-se comprometida com o programa Treg após estimulação com IL-2 e TGF-β ^14,15. Não pode ser moderada a plasticidade considerável em linhagens de células CD4 ⁺ T, especialmente quando se considera apenas a produção de citocinas (revisto em ^17,18). No entanto, para efeitos de protocolos de diferenciação in vitro, vamos discutir cada subconjunto como uma linhagem única.

Recentemente, um subconjunto de células Th17, que produz a citocina IL-17 foi identificada como uma linhagem original com funções pró-inflamatórias que são particularmente patogénico durante a inflamação autoimune ^19-21. Células Th17 expressar um fator de transcrição original, denominado dependente do retinóide gamma receptor órfão t (RORγt), que coordena o programa genético Th17 ^22. TGFp é importante para a geração de Th17 linhagem através da indução de RORγt. No entanto, se acredita que o efeito de sinalização de TGF-p para induzir apenas Th17 compromisso sobre sinergia com IL-6 (revisto em ^12). Outros estudos têm mostrado que uma variedade de outros sinais que podem regular positivamente Th17 compromisso, incluindo IL-1β, o aumento de sódio, e de sinalização de TLR ^23-26. Outros relatos sugeriram que as células Th17 patogénicos in vivo são os que realmente desviam a sinalização TGF-p e em vez disso dependem de uma combinação de IL-1, IL-6, e IL-23 para a diferenciação ^27. Assim, as células Th17 pode ser derivado de uma variedade de vias de sinalização; para efeitos do presente protocolo, o comumente usado (TGF e IL-6) via para Th17 compromisso linhagemirá ser apresentada.

Os protocolos de diferenciação descritos abaixo para todas as linhagens efectoras depende de anticorpo fixa como estímulos para o TCR e CD28 ao longo de todo o decurso da experiência. No entanto, outros autores demonstraram que a activação de TCR com células apresentadoras de antigénio ou ²⁸ anti-CD3 e anti-CD28 com anticorpo de hamster de ligação cruzada durante 2 dias ²⁹ também são meios altamente eficazes de induzir a produção de vários subconjuntos Th. O protocolo aqui apresentado baseia-se em métodos reportados anteriormente para isolar as células CD4 ⁺ T murino de órgãos linfóides secundários ³⁰ e geração de células Th17 ^31. Uma diferença importante é que este protocolo baseia-se na utilização de um separador de células para isolar as células T CD4 ⁺ naive a partir de tecidos linfóides. No entanto, muitas empresas já oferecem kits de separação rápidas que podem enriquecer as células T CD4 ⁺ naïve, que pode ser capaz de contornar a exigência de fou classificação, dependendo da experiência. Os métodos e reagentes apresentados neste protocolo são o que nós rotineiramente usar e encontrar para ser o mais eficaz. No entanto, tenha em mente que existem reagentes alternativos e metodologias para muitos dos passos apresentados a seguir e cabe ao laboratório indivíduo para determinar o que funcionará melhor para seus propósitos.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais são realizados usando protocolos aprovados pelo escritório de Saúde e Segurança Ambiental da Rosalind Franklin Universidade de Medicina e Ciência. Murganhos C57BL / 6 (adquirido a partir de NCI) utilizado para este protocolo foram alojados sob condições isentas de patogénios específicos, e todas as experiências com animais foram realizadas usando protocolos aprovados pelo Comité de Cuidados e Uso de Animais Institucional (IACUC) no Rosalind Franklin Universidade de Medicina e Science.

1. Preparação de Instrumentos, suprimentos e Reagentes

1. O revestimento de 48 poços ou de 24 poços, placas com anti-CD3 e anti-CD28 (Tabela 1) em PBS estéril, a tampa eo envoltório em parafilme para evitar a evaporação e contaminação, e então incubar O / N a ^{4 °} C no dia anterior t o isolamento das células. Alternativamente, poços casaco 1 h a 37 ^o C. Realizar condições Th0, Th1, Th2, e iTreg por revestimento, tanto com anti-CD3 e anti-CD28 em 1 ug / ml em 0,5-1 ml devolume de tal (de 48 poços). Para Th17, que tipicamente revestimento anti-CD3 a 2 ug / ml e anti-CD28 a 1 ug / ml.
   NOTA: Verificou-se que uma baixa concentração de anti-CD3 é óptima para a produção de Th1, Th2, e iTreg enquanto uma concentração mais elevada de anti-CD3 é óptima para a produção de Th17. Assim, anti-CD3 e anti-CD28 concentrações devem ser tituladas e optimizado para laboratórios individuais (Tabela 2).
2. Esterilizar um conjunto de ferramentas de dissecação (tesouras e fórceps) por solução de autoclave ou desinfetante. Um tubo ou pequeno copo contendo 70% de etanol serão necessários para a esterilização rápida de ferramentas entre dissecções. Finalmente, uma garrafa de pulverização contendo 70% de etanol será necessário para esterilizar a superfície do rato antes da dissecação.
3. Prepare uma superfície de dissecção envolvendo uma peça plana de isopor ou cortiça em papel alumínio. Alfinetes ou agulhas de dissecação são usados ​​para fixar o animal no lugar.
4. Prepare pratos ou placas para a recolha de tissues. Se tecidos de pooling, 60 milímetros pratos separados contendo 3 ml de PBS estéril + 1% FBS (PBS +) para os tecidos do baço e nódulos linfáticos é suficiente. Se mantendo tecidos de ratinhos individuais separados, preparar uma 1ml placa de 24 poços contendo de PBS + no número desejado de poços.
5. Prepare meio RPMI completo para cultura de células e pré-quente antes do uso (Tabela 1).
   NOTA: Nós usam rotineiramente RPMI mas outras mídias, como IMDM e DMEM podem ser igualmente eficazes ou superiores, dependendo do laboratório e da experiência.
6. Cut 2x2 cm quadrados de malha de nylon com um tamanho de poro e autoclave para esterilizar 120 mm (Tabela 1).
7. Opcional: se estiver usando a célula magnética de alta velocidade sistema de triagem, como autoMACS para o enriquecimento de células CD4 ^+, a corrida pré-quente e lavagem buffers em um 37 ^o banho de água C ​​para evitar danos à máquina.
8. NOTA: O enriquecimento é recomendado para aumentar o rendimento de triagem e diminuir o tempo de classificação.
9. Tudoetapas de preparação, excepto para dissecção, deve ser realizada num capuz de cultura de tecido estéril.

2. Isolamento de linfonodos e baço de ratinhos

1. Eutanásia o número necessário de animais utilizando uma técnica institucional-aprovado. Use camundongos C57BL / 6 do sexo feminino, com idade de 5-10 semanas, devido à sua alta porcentagem de células T naive e gordura corporal mais baixo em comparação com os homens ou para ratos mais velhos.
   NOTA: As células derivadas de ratinhos macho irá executar de forma semelhante in vitro, e as etapas do protocolo permanecer o mesmo. Camundongos fêmeas, 5-10 semanas de idade, normalmente vai render 3-6 x 10 ⁶ células T CD4 ⁺ naive por mouse. No entanto, usando diferentes cepas de camundongos pode afetar o rendimento e performance. Por exemplo, as células de ratinhos C57BL / 6 são melhores para a geração de células Th1, enquanto as células de ratinhos Balb.c são melhores para a geração de células Th2.
2. Espalhar dos membros do animal e fixá-los no lugar, como mostrado na Figura 1. Cortar a pele longoitudinally do ânus para o queixo, tendo o cuidado para não perfurar tecidos mais profundos.
3. Espalhe abrir a pele com pinças e prender a pele, em lugar de permitir um acesso fácil para os gânglios linfáticos, como mostrado na Figura 1.
4. Colher os gânglios linfáticos acessíveis a partir dos locais mostrados na Figura 1. Agarrando o nó de linfa com um par de pinças, enquanto que separa o tecido com um outro par de pinças irá permitir a remoção fácil. Colocar o tecido no prato de recolha.
5. Colheita do baço a partir do local mostrado na Figura 1. Neste caso, o corte cuidadoso no peritoneu é necessário para ter acesso ao baço. Colocar o tecido em um prato de recolha.
6. Repita o procedimento se mais tecidos serão colhidos. Caso contrário, prossiga para as próximas etapas. Neste ponto, realizar todas as etapas restantes no gelo até o revestimento das células T, após separação.

3. Tissue Processamento e CD4 ⁺ Enriquecimento

1. Processar os nódulos linfáticos e no baço em pratos diferentes para aumentar o rendimento como preparações de células de linfonodos não necessitam de lise de eritrócitos, o que pode resultar em morte de leucócitos menor. Portanto, as etapas a seguir descrevem um método para processar as populações de baço e nódulos linfáticos seguidos separadamente pela combinação prévia com a rotulagem de classificação.
2. Remover o tecido (baço ou nódulos linfáticos reunidas) do prato de recolha e em lugar de um novo prato de 60 milímetros, contendo 3 ml de PBS +. Colocar um quadrado de nylon estéril malha sobre o tecido usando uma pinça esterilizada.
3. Pegue o lado do polegar de um êmbolo da seringa (3-10 ml) e gentilmente esmagar o tecido contra a malha. Quase todo o tecido deve entrar em suspensão. Alternativamente, coloque o tecido entre duas lâminas de geadas autoclavada e moído em suspensão.
4. Pipeta a suspensão para cima e para baixo algumas vezes para quebrar os aglomerados solúveis restantes. Coloque um novo pedaço quadrado de malha de nylon sobre a abertura de umTubo de 15 ml e filtrar a suspensão através de remover os escombros restantes.
5. Repita os passos 2-4 para linfonodo adicional e do tecido do baço.
6. Assim que a suspensão foi filtrada para um tubo de 15 ml encher o restante do tubo com PBS + e inverter algumas vezes. Centrifuga-se as células a 475 xg durante 5 minutos a 4 ^o C.
7. Para as células de baço, aspirar o sobrenadante após centrifugação e ressuspender o sedimento de células em 1 ml de solução gelada 1X ACK por baço durante 1 min para lisar os eritrócitos. Em seguida, adicionar 10 ml de PBS + no topo do ACK, inverter o tubo, e centrifuga-se 475 xg durante 5 minutos a 4 ^o C.
8. Para as células de nódulos linfáticos, aspirar o sobrenadante e ressuspender em 2 ml de PBS +. Se desejado estes podem ser combinados com as células de baço após a sua lise ACK e o passo de lavagem.
9. Aspirar o sobrenadante após centrifugação dos esplenócitos e ressuspender em mais 10 ml de PBS +. Neste ponto a suspensão nodo linfático pode ser umdded no topo da suspensão de tecido do baço que o agrupamento é necessária para a classificação. Centrifuga-se o tubo de novo a 475 xg durante 5 minutos a 4 ^o C.
10. O sedimento celular pode agora ser preparado para o enriquecimento de células CD4. Se essa etapa não será executada, prossiga para as etapas de preparação de classificação.
11. Para o enriquecimento de CD4 utilizando o sistema de separação de células magnético de alta-velocidade, ressuspender o sedimento celular com pérolas de CD4. Normalmente 15 ul de contas diluídos em 85 mL de PBS + é usado para rotular os tecidos a partir de 1 mouse. Rampa até o volume de mistura de pérolas, conforme necessário, colocar o agregado, e incubar por 15-30 min a 4 ^o C.
12. Lavam-se as células com 10 ml de PBS +, passar a suspensão através de nylon para um novo tubo de 15 ml para remover os detritos, e centrifuga-se novamente a 475 xg durante 5 minutos a 4 ^o C.
13. Ressuspender o sedimento em 100 ul de PBS + por ratinho e prossiga para a selecção positiva sobre o sistema de triagem celular magnético de alta-velocidade. Se estiver usando um sistema de separação manual, fRealize as instruções do fabricante para o enriquecimento. Alternativamente, ressuspender as amostras em tampão de SCAF: PBS com EDTA 1 mM (pH = 8) e BSA a 1%, esterilizado por filtração.
14. Remover a fracção positiva e lavar novamente com 10 ml de PBS +. A fração enriquecida CD4 ⁺ está agora pronto para ser rotulados para a classificação.

4. células Seleção Naïve T CD4 ⁺

1. Rotular o aglomerado de células com PBS + anticorpos fluorescentes que contenham contra CD62L, CD44, CD25, e CD4. Se utilizar os anticorpos listados na Tabela 1, para cada diluições são fornecidos. Para a coloração, num volume de 100 ul do cocktail de anticorpo é utilizado por tecidos de um rato.
2. Ressuspender o sedimento em cocktail de anticorpos e incubar durante 15-30 minutos a ^{4 °} C no escuro.
3. Lavam-se as células com 10 ml de PBS + 475 xg e centrifugar durante 5 minutos a 4 ^o C.
4. Passe a mistura sobre uma outra tampa do filtro de nylon ou filtro de células para redeslocar quaisquer detritos sobra. Pipetar as células marcadas dentro de um tubo que é compatível para o classificador de células. Mantenha as células no gelo e ao abrigo da luz até que o tipo.
5. Prepare tubos de coleta por pipetagem 1-2 mL de meio completo RPMI ou FBS para o fundo de tubos compatíveis para a coleta em um classificador de células.
6. Ordenar as células CD4 ⁺ T naive como CD4 ⁺ CD25 ^- CD62L ⁺ CD44 ^- população (Figura 2). Lavam-se as células recolhidas com meio RPMI completo e centrifugação como descrito acima.
7. Ressuspender o sedimento em RPMI completo, contagem das células ingênuo, e ajustar a concentração de 1 x 10 ⁶ células / ml.

5. Configuração da Diferenciação in vitro

1. Aspirar os poços das placas revestidas com anti-CD3 e anti-CD28 e lavar cada cavidade com 1 mL de PBS estéril (sem FBS). Para placas de 48 poços, 0,5 x placa 10 ⁶ células / poço em 0,5 ml de RPMI. Para placas de 24 poços, de cultura de 1 x 10 ⁶ células / poço em 1,0 ml de RPMI.
2. Se a testar a influência de um factor, tal como uma droga adicionar a substância aos poços apropriados, quer antes, durante ou após o processo de diferenciação de acordo com a experiência. Em seguida, completar o meio de cultura com citocinas e anticorpos bloqueadores de acordo. Th0: 30 U / ml de hIL-2. Th1: 15 ng / ml de rmIL-12, de 30 U / ml de hIL-2, e 5,000 ng / ml 11B11.Th2: 10 ng / ml de rmIL-4, 30 U / ml de hIL-2, 2000 ng / mL 37,51 solúvel, e 5.000 ng / ml XMG1.2. iTreg: 15 ng / ml hTGFβ, 30 U / ml de hIL-2, 5,000 ng XMG1.2 / ml, e 5,000 ng / ml 11B11. Th17: 20 ng / ml de rmIL-6, 3 ng / ml hTGFβ, 5,000 ng XMG1.2 / ml, e 5,000 ng / ml 11B11.
   NOTA: As condições apresentadas acima foram encontrados para ser óptima para maximizar a produção de citoquinas tal como medido no final da experiência diferenciação (secção de resultados representativos). No entanto, cada estado deve ser otimizado para laboratórios específicos (Tabela 2 ). Além disso, a adição de anti-CD28 solúvel, para além do anti-CD28 ligado à placa foi encontrada para melhorar a produção de citoquinas do tipo Th2 em nosso laboratório, mas não tem nenhum efeito sobre outras subpopulações de células T:
3. Incubar a placa a 37 ^{° C} com 5% de CO ₂ durante 4-5 dias antes da análise da expressão do gene e a produção de citoquinas. Alternativamente, as células de remover os estímulos de TCR após 2 d, ajustada a 1 x 10 ⁶ células / ml com meio fresco, e em novos poços de placa (não revestido) para aumentar a proliferação e rendimento final. Neste caso, citocinas polarizadoras frescos e anticorpos não são necessários, mas a 10 U / ml de IL-2 deve ser adicionado a novos meios para Th0, Th1, Th2, e culturas iTreg.

6. Análise de Diferenciação

1. Para a análise por citometria de fluxo de citoquina, reestimular cada poço com 10 ng / ml de PMA e 1000 ng / ml de ionomicina ou 1 ug Tabela / ml de anti-CD3 durante 4-6 horas na presença de um inibidor de Golgi, tais como brefeldina A (1). Realização da coloração de citocinas intracelulares dependendo da experiência (Figura 3).
   NOTA: Mancha citocinas ou factores de transcrição, tais como IL-4 (não mostrado) e de IFN-y não específicos da linhagem (figura 3) para culturas Th17, para cada condição como controlos negativos e como um indicador da eficiência da diferenciação. Além disso, Foxp3 mancha para culturas Th17 como o desenvolvimento recíproco de Tregs pode ocorrer com a adição de TGF-p.
2. Para a quantificação de proteínas, recolher os sobrenadantes de cada poço de ensaio e por citocina específica-ELISA (Figura 3). Se houver preocupação de que o factor a ser testado tem influenciado proliferação em comparação com amostras de controlo, as células podem ser lavadas, contadas, normalizados, e em seguida, novamente estimuladas com 1 ug / ml de anti-CD3 durante 24 horas antes de se recolher os sobrenadantes para os ensaios de ELISA. Se o ensaio de IL-4 de Th2 é necessário condições, lavagem e restimulating para remover a IL-4 que pode ser leftover diferenciação a partir da cultura inicial.
3. Para a análise da expressão de genes por PCR em tempo real, as células de colheita após o período de incubação, lavagem, normalizar, e re-estimular durante 2-6 h com 1 ug / ml de anti-CD3 de ARNm antes da colheita (Figura 3).

Resultados

O ponto de tempo para a análise de diferenciação pode variar dependendo da condição a ser testado Th, bem como a força de activação do receptor de células T. Depois de 2-3 dias de diferenciação, as células podem ser visualizados por microscopia óptica para determinar a extensão da proliferação de células T. Wells expositoras extensa proliferação e aglomeração de células provavelmente estará pronto para análise no dia 4. condições de diferenciação contando com a adição de IL-2, tais como Th1...

Discussão

Enquanto o baço contém células Th simples, a proporção da população nos nódulos linfáticos é muito maior. Falha em identificar corretamente e remover os linfonodos neste protocolo irá resultar em um fraco rendimento de células naïve. Isto pode ser especialmente difícil nos ratos mais velhos ou ratinhos macho que têm mais tecido gordo. Como mostrado na Figura 1, a fixação adequada e de membros de pinagem animais e pele irá permitir a fácil visualização dos nódulos linfáticos exteri...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Complete RPMI:			Warm in a 37 oC water bath before use
RPMI 1640 Media	Life Technologies	11875119
10 % FBS	Life Technologies	26140-079
1000X 2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
100X Pen/Strep	Life Technologies	15140122
100X L-glutamine	Life Technologies	25030081
120 micron nylon mesh	Amazon	CMN-0120-10YD	Cut into 2 cm2 squares and autoclave
Alternative: 100 micron cell strainers	Fisher	08-771-19	Alternative to cutting nylon mesh
autoMACS running buffer	Miltenyi	130-091-221	Warm in a 37 oC water bath before use
autoMACS rinsing solution	Miltenyi	130-091-222	Warm in a 37 oC water bath before use
CD4 beads	Miltenyi	130-049-201
ACK lysis buffer	Life Technologies	A10492-01
Cytokines:
Human (h) IL-2	Peprotech	200-02
Recombinant mouse (rm) IL-4	Peprotech	214-14
rmIL-6	R & D Systems	406-ML-025
rmIL-12	Peprotech	210-12
hTGFb	R & D Systems	240-B-010
Antibodies:
2C11 (anti-CD3)	BioXcell	BE0001-1
37.51 (anti-CD28)	BioXcell	BE0015-1
11B11 (anti-IL-4)	BioXcell	BE0045
XMG1.2 (anti-IFNg)	BioXcell	BE0055
anti-CD62L-FITC	BioLegend	104406	Use at 1:100
anti-CD25-PE	BioLegend	102008	Use at 1:400
anti-CD4-PerCP	BioLegend	100434	Use at 1:1000
anti-CD44-APC	BioLegend	103012	Use at 1:500
Phorbol  12-myristate 13 acetate (PMA)	Sigma-Aldrich	P-8139	Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I-0634	Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC
Brefeldin A	eBioscience	00-4506-51	Use at 1:1000