قياس خارج الخلية ايون تدفقاتها باستخدام ايون انتقائية مسرى مكروي تقنية الرجوع الذاتي

Summary

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Abstract

يتم تضمين الخلايا من الحيوانات والنباتات والخلايا واحدة بحاجز يسمى غشاء الخلية التي تفصل بين السيتوبلازم من الخارج. طبقات الخلية مثل ظهائر أيضا تشكيل الحاجز الذي يفصل بين الداخل من الخارج أو حجرات مختلفة من الكائنات المتعددة الخلايا. ومن السمات الرئيسية لهذه الحواجز هي توزيع الفرق الأيونات عبر أغشية الخلايا أو طبقات الخلية. خاصيتين تسمح هذا التوزيع: 1) الأغشية وظهائر عرض النفاذية الانتقائية للأيونات محددة؛ 2) يتم نقل الأيونات خلال مضخات عبر أغشية الخلايا وطبقات الخلية. هذه الخصائص تلعب دورا حاسما في الحفاظ على وظائف الأعضاء والأنسجة بمثابة إشارات العظة بعد الضرر، خلال إصلاح، أو في ظل حالة المرضية. إلى الرجوع النفس مسرى مكروي ايون الانتقائي يسمح قياسات لتدفقات معينة من أيونات مثل الكالسيوم والبوتاسيوم أو الصوديوم عند مستويات الخلايا والأنسجة واحدة. يحتوي على مسرى مكروي كوكتيل حامل الأيون الذي هوقابلة للاختراق بشكل انتقائي إلى أيون معين. الحل ملء داخلي يحتوي على تركيز مجموعة من الأيونات في المصالح. يتم تحديد الجهد الكهربائي من مسرى مكروي من التركيز الخارجي للأيون. كما يختلف تركيز أيون، وإمكانات مسرى مكروي التغييرات بوصفها وظيفة من سجل النشاط أيون. عندما انتقلت ذهابا وإيابا بالقرب من مصدر أو بالوعة للأيون (أي في التدرج تركيز بسبب تدفق أيون) إمكانية مسرى مكروي يتقلب في اتساع يتناسب مع تدفق أيون / التدرج. مكبر للصوت تضخيم الإشارة مسرى مكروي ويتم تسجيل الإخراج على جهاز الكمبيوتر. ومن ثم يمكن حساب تدفق الأيونات بالقانون فيك من نشر باستخدام تذبذب القطب المحتملين، ورحلة من مسرى مكروي، وغيرها من المعالم مثل حركة الايونات معين. في هذه الورقة، ونحن تصف بالتفصيل منهجية لقياس تدفقات أيون الخلية باستخدام-الرجوع النفس مسرى مكروي لايون انتقائيةد تقديم بعض النتائج التمثيلية.

Introduction

ويحيط كل الخلايا الحيوانية التي كتبها طبقة ثنائية الغشاء الدهني الذي يفصل السيتوبلازم من البيئة الخارجية. تحتفظ الخلية إمكانات غشاء الكهربائية، سلبية في الداخل، عن طريق النقل النشط لأيونات ^1. غشاء المحتملة هي مصدر الطاقة المخزونة التي الخلية يمكن الاستفادة لتشغيل الأجهزة الجزيئية المختلفة في غشاء ^2. الخلايا العصبية والخلايا منفعل أخرى لديها إمكانات غشاء كبيرة. افتتاح السريع للقنوات الصوديوم ينهار غشاء المحتملة (الاستقطاب) وتنتج إمكانات العمل التي يتم نقلها على طول العصبون ^2. وبصرف النظر عن هذه التغييرات الكهربائية السريعة، والعديد من الأنسجة والأعضاء تولد والحفاظ على إمكانات كبيرة الكهربائية على المدى الطويل. على سبيل المثال، والجلد وظهائر القرنية توليد والحفاظ على الإمكانات عبر الظهارية والتيارات الكهربائية خارج الخلية من خلال ضخ الاتجاه من الأيونات (أساسا الصوديوم وكلوريد) ^3.

خيمة "> بينما قياسات الذاتية التيار الكهربائي خارج الخلية باستخدام مسبار تهتز ^4-6 وقياسات غشاء أو عبر الظهارية إمكانات استخدام نظام مسرى مكروي ^10/7 يتيح قياس المعلمات الكهربائية لأغشية الخلايا وطبقات الخلايا الظهارية، فإنها لا تعطي إشارة إلى الأنواع أيون المعنية.

يمكن الميكروية مع حامل الأيون انتقائية قياس تركيز أيون معين في الحل. يمكن قياس التدرجات أيون أو التمويه مع اثنين أو أكثر من الأقطاب الكهربائية في مواقع مختلفة. ومع ذلك، فإن الانجراف الجهد لا يتجزأ من كل مسبار تكون مختلفة، مما تسبب قياسات غير دقيقة أو حتى الكشف عن الانحدار الذي لم يكن موجودا. A القطب واحد المستخدمة في وضع "الرجوع إلى الذات" حيث أنه يتحرك في التردد المنخفض بين نقطتين يحل هذه المشكلة. الآن تدفق الأيونات يمكن أن ينظر إليه على خلفية الانجراف إشارة بطيئة وثابتة نسبيا (انظر الشكل 3B).

يستخدم نظام قياس حساسة ليثيوم-الميكروية الرجوع النفس ايون الانتقائي للكشف عن تدفقات خارج الخلية صغيرة من الأيونات قريبة من الأنسجة أو الخلايا وحيدة. ويتكون النظام من مكبر للصوت الذي يعالج الإشارة من مسرى مكروي والسائر المحركات الصغيرة والسائق للسيطرة على حركة مسرى مكروي. يتم توصيل مسرى مكروي ايون انتقائية والقطب المرجعية التي تغلق الدائرة إلى مكبر للصوت عن طريق headstage قبل مكبر للصوت (الشكل 1A). برامج الكمبيوتر يحدد معالم الحركة مسرى مكروي (تردد، وبعد المسافة) ويسجل أيضا إخراج مكبر للصوت. يتحكم المحرك السائر حركة مسرى مكروي عبر micropositioner ثلاثي الأبعاد. وقد تطورت A التردد المنخفض تهتز ايون انتقائية مسرى مكروي لأول مرة في 1990 لقياس تدفق الكالسيوم محددة ^11. وكذلك الكالسيوم والكوكتيلات حامل الأيون الوصول تجاريا متاحة الآن لجعل ميكرoelectrodes حساسية للصوديوم وكلوريد البوتاسيوم والهيدروجين والمغنيسيوم، نترات الأمونيوم، الفلورايد، والليثيوم أو الزئبق.

في الأساس، وايون انتقائية تقنية مسرى مكروي-الرجوع النفس تحويل نشاط أيون معين المذاب في محلول إلى الجهد الكهربائي، والتي يمكن أن تقاس الفولتميتر. كوكتيل حامل الأيون هو السائل إمتزاج (العضوية، محبة للدهون) المرحلة مع خصائص التبادل الأيوني. على حامل الأيون مجمعات انتقائي (الربط) أيونات معينة عكسية ونقل لهم بين محلول مائي الواردة في مسرى مكروي (بالكهرباء) ومحلول مائي التي يتم مغمورة مسرى مكروي (1D الشكل). هذا نقل أيون يؤدي إلى التوازن الكهروكيميائية ويتم قياس الاختلاف من الجهد الكهربائي بين مسرى مكروي والقطب المرجعية من قبل الفولتميتر. الجهد يتناسب مع لوغاريتم النشاط أيون معين وفقا لنرنست هquation السماح للحساب تركيز أيون (الشكل 2A و B).

في الوقت الحاضر، العديد من النظم تسمح قياس تدفق الأيونات باستخدام مفهوم أو مبدأ مماثل. على سبيل المثال، القطب تقنية المسح الضوئي ايون انتقائية (SIET) ^12،13 أو مسرى مكروي ايون الجريان تقدير (MIFE) تقنية وضعتها نيومان وShabala ^14-16 متاحة تجاريا وتستخدم على نطاق واسع من قبل الأوساط البحثية من أجل تحديد أيون محدد الطلاءات التي تحدث في غشاء الخلايا والأنسجة عبر مجموعة متنوعة من الحيوانات والنباتات ونماذج خلية حية واحدة. وقد استخدمت الميكروية ايون انتقائية لقياس الهيدروجين والبوتاسيوم والكالسيوم تدفق عبر جذور النباتات ^17، تدفق الكلوريد في الفئران الشرايين الدماغية ¹⁸ و ¹⁹ في أنابيب حبوب اللقاح، تدفق الهيدروجين في خلايا الشبكية تزلج ^20، تدفق الكالسيوم في العظام بالنسبة للفئران ^21، أيون مختلف الفيض في خيوط فطرية ²² و في صفي القرنية ^23، وأخيرا تدفق الكالسيوم خلال الجرح خلية واحدة الشفاء ^12،24. انظر أيضا الاستعراض التالي للحصول على معلومات مفصلة على الرجوع النفس الميكروية ايون الانتقائي ^25.

تتناول المقالة التالية بالتفصيل كيفية إعداد وتنفيذ قياس الذاتية تدفقات أيون الخلية باستخدام-الرجوع النفس تقنية مسرى مكروي ايون انتقائية على مستوى خلية واحدة.

Protocol

1. ايون انتقائية إعداد مسرى مكروي-الرجوع الذاتي

1. إعداد ايون انتقائية مسرى مكروي
   1. الحرارة سحب رقيقة الشعرية البورسليكات الجدران من دون خيوط (1.5 ملم القطر الخارجي، 1.12 مم القطر الداخلي) باستخدام مجتذب مسرى مكروي.
      ملاحظة: هذا يعطي نصائح 3-4 ميكرون في القطر. نصائح صغيرة لديها مقاومة أعلى مما يجعل الميكروية أكثر عرضة للضوضاء الإلكترونية، ويرتبط أيضا مع استجابة أبطأ إلى تغيير في تركيز أيون. ويمكن الاطلاع على معلومات مفيدة في ورقة نشرتها سميث وآخرون. ^26.
   2. Silanize الأقطاب لجعل مسعور السطح الداخلي لمساعدة الإبقاء على كوكتيل حامل الأيون محبة للدهون. وضع الميكروية في رف معدني والحرارة O / N في الفرن على> 100 ° C لتجفيفها. رف هو لوحة معدنية مع ثقوب قطرها 2 ملم حفر جزء من طريق. وضع أقطاب كهربائية في ثقوب غيض صعودا مع 250 مل غرامدورق معشوقة عليها.
   3. في الصباح، وتحويل الفرن قبالة وبينما يرتدي قفازات عازلة، وإزالة بعناية رف معدني مع الأقطاب والكأس في المكان. إغلاق باب الفرن للاحتفاظ بالحرارة.
   4. ارتداء اللاتكس أو النتريل قفازات، معطف مختبر وحماية العين. مع البلاستيك ماصة باستير، ضع قطرة من silanization حل I عند قاعدة كل قطب كهربائي (الحفاظ على الكأس في المكان، واستخدام شفة صب للوصول ماصة). ويتبخر الحل silanization من قبل صفيحة ساخنة وsilanizes الداخل من الأقطاب الكهربائية. استخدام مستخرج الكيميائية غطاء الدخان لهذه المرحلة. وضع رف / كوب / أقطاب مرة أخرى في الفرن الساخن لبضع ساعات للسماح لأي حل silanization المتبقية لتتبخر.
      ملاحظة: لأسباب تتعلق بالسلامة، لا تتحول الفرن مرة أخرى. وضع ملصق على الفرن تشير إلى أنه لا يجب أن تكون في وضع التشغيل لأنها قد تحتوي على بخار الضار وقابلة للاشتعال.
   5. بعد التبريد، وتخزين الميكروية في تخزين مسرى مكروي جرة الإعلامييندي مجفف زجاجي مع 400 غرام من المجففة. الميكروية يمكن تخزينها وبالتالي لعدة أسابيع.
      ملاحظة: ووصف طريقة silanization بديل في سميث وآخرون ^26.
   6. العودة ملء مسرى مكروي مع 50-100 ميكرولتر (يبلغ طوله حوالي 1 سم) من محلول يحتوي على 100 ​​ملي من أيون المراد قياسها (انظر الجدول 1 والشكل 1B). استخدام المتاح باستور البلاستيك ماصة للحرارة سحبت في موقد بنسن إلى خيوط على ما يرام. شطف ماصة في DH ₂ O بعد ذلك لمنع انسداد.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، وضبط تركيز أيون من الحل الردم لتتناسب مع تركيز ايون في الحل الخارجي ^27.
   7. مراقبة مسرى مكروي تشريح تحت المجهر للتأكد من عدم وجود فقاعات الهواء.
      1. إذا فقاعات الصنبور الحالي مسرى مكروي باستخفاف مع عقلة الإصبع، في حين عقد القطب عموديا (نصيحة لأسفل) و / أو دفع فقاعةق من غيض من خلال تطبيق الضغط الخلفي باستخدام حقنة تعديل مع أنبوب السيليكون استبدال الإبرة.
   8. بلاغ ملء مسرى مكروي مع 15-20 NL (بطول 30-50 ميكرون) من أيون محددة حامل الأيون كوكتيل (انظر الجدول 1). وضع قطرة صغيرة من حامل الأيون كوكتيل على حافة قصيرة من شريحة المجهر. مراقبة طرف مسرى مكروي تحت المجهر تشريح وتحريكه نحو شريحة المجهر حتى يلمس طرف مسرى مكروي كوكتيل حامل الأيون فقط حوالي نصف ثانية. رسم كوكتيل حامل الأيون في مسرى مكروي الضغط الشعرية.
      ملاحظة: تجنب عمود طويل من حامل الأيون كوكتيل لأن ذلك يزيد من المقاومة الكهربائية لجنة التحقيق والتي يمكن أن تجعل من عرضة للتدخل الالكترونية (الضوضاء)، وكذلك يؤدي إلى إبطاء زمن الاستجابة.
   9. تركيب مسرى مكروي في حامل مسرى مكروي مستقيم مع الذهب 1 ملم موصل الذكور وأجكل (حج ⁺⁾ سلك (الشكل 1B).
   10. إرفاق حامل مسرى مكروي إلى مرحلة الرأس التي شنت على الكمبيوتر التي تسيطر عليها ثلاثي الأبعاد micropositioner الإلكترونية (الشكل 1A).
   11. ضع طرف مسرى مكروي في قياس مناسبا حل للعينة المراد قياسها (المالحة الفسيولوجية، مستنبت، الخ) للسماح للمسرى مكروي لتحقيق الاستقرار لساعة أو ساعتين، أو حتى بين عشية وضحاها.
2. إعداد القطب المرجعية
   1. أقطاب المرجعية (الشكل 1C) هي نفس الشعيرات الدموية على النحو الوارد أعلاه. قطع الشعرية مع قلم رصاص الماس إلى 5 سم أطوال ومصقول إطلاق النار في نهاية كل مدة 1-2 ثانية في لهب بنسن.
   2. ملء هذه الأقطاب مع ~ 200 ميكرولتر من 3 M حل كلوريد الصوديوم، CH ₃ CO ₂ K (أسيتات البوتاسيوم) أو بوكل مع 2٪ الاغاروز. اختيار الحل تبعا لايون إلى أن تقاس (يجب أن لا يحتوي على القطب إشارة أيون يجري قياسه؛ انظر الجدول 1). مزيجالاغاروز والحل والحرارة إلى ما يقرب من الغليان في الميكروويف. يحرك المزيج حتى يذوب الاغاروز (الحل يذهب واضح).
   3. نعلق القطب الإشارة إلى البلاستيك ماصة باستير ورسم الحل الساخن في الشعيرات الدموية.
   4. إسقاط القطب البارد إلى 3 M كلوريد الصوديوم، CH ₃ CO ₂ K أو حل بوكل وتخزينها في هذا 3 M الحل في أنابيب مغلقة قبل استخدامها. تجاهل أي أقطاب المرجعية مع فقاعات الهواء.
   5. جبل القطب المرجعية في حامل مسرى مكروي على التوالي (ما قبل مليئة 3 M الحل) مع أجكل (حج ⁺⁾ بيليه داخل والذهب 2 مم موصل الذكور (الشكل 1C) ونعلق القطب وحامل على يدوي الصغرى مناور شنت على الوقوف المغناطيسي.

2. ايون انتقائية مسرى مكروي معايرة الرجوع الذاتي

1. إعداد الحلول معايرة تحتوي على أيون ذات الاهتمام كما هو الحال في الحل المرجعية؛ انظر الجدول رقم 1 . القوس تركيز هذا هو في الحل سوف تكون العينة في (على سبيل المثال وسائل الإعلام والثقافة، والمالحة الفسيولوجية). وهذا هو، يجب أن يحتوي على محلول المعايرة واحدة أقل تركيز أيون مما كانت عليه في حل القياس، واحد أعلى.
   1. على سبيل المثال، استخدام المياه المالحة التي تحتوي على 1 ملم من K ^+. إلى قوس هذا التركيز، ويحل مسحوق بوكل في الماء منزوع الأيونات إلى تركيز من 10، 1 و 0.1 مم في التخفيفات التسلسلية. استخدام هذه الحلول المعايرة. بدلا من ذلك، استخدم اثنين على الأقل من هذه الحلول.
2. تزج مسرى مكروي ايون انتقائية والقطب المرجعية في كل حل المعايرة والسماح للقيمة الجهد استقرار ل1-3 دقائق قبل ان يسجل الجهد المقابلة باستخدام برامج مخصصة (انظر الجدول 1).
3. كما البرنامج يحفظ البيانات (خرج مكبر للصوت) كملف txt و نسخ البيانات إلى ملف جدول بيانات. مؤامرة إخراج مسرى مكروي (السيارات) ضد لوغاريتمتركيز أيون المولي (الشكل 2A).
4. تطبيق الانحدار الخطي وحساب نرنست المنحدر، واعتراض R ² قيمة. قبول مسرى مكروي إذا كان المنحدر نرنست 58 ± 11 فولت / العقد لأيونات الأحادي التكافؤ و 29 ± 11 فولت / العقد لأيونات ثنائي التكافؤ (لالكاتيونات، المنحدر نرنست هو إيجابي، لالأنيونات هو سلبي). بالإضافة إلى ذلك، يجب أن يكون الميكروية جيدة ارتباط قوي الخطية (R ^2> 0.9، الشكل 2B).
   ملاحظة: ناتج بالسيارات من مكبر للصوت تستخدم هنا يعطي بالسيارات القراءة مع زيادة عشرة أضعاف. القيم يجب أن تكون مقسمة من قبل عامل من عشر سنوات.
5. استخدام صيغة الانحدار الخطي لتحويل الانتاج بالسيارات الخام من مسرى مكروي إلى تركيز أيون الفعلي (الشكل 2B).

3. التحقق من مسرى مكروي تقنية ايون انتقائية

1. إعداد مصدر الاصطناعي
   1. الشعيرات الدموية مصدر الاصطناعية هي نفس الشعيرات الدموية كماأعلاه. الحرارة سحب الشعرية باستخدام مجتذب مسرى مكروي كما في الخطوة 1.1.1.
   2. الردم هذه الشعيرات مع 200 ميكرولتر من 1 M حل كلوريد الصوديوم، بوكل، CaCl ₂ 2 H ₂ O أو الرقم الهيدروجيني 4 العازلة. اختيار الحل مصدر الاصطناعي تبعا لايون أن يقاس (انظر الجدول 1).
      ملاحظة: بدلا من ذلك، وسحب أقطاب مع أكبر قطر الحافة (~ 20 ميكرون)، وطرف ملء مع نفس الحلول ولكن تحتوي على 0.5-1٪ الاغاروز (الاغاروز سيمنع أي تدفق الجزء الأكبر من الحل).
   3. جبل الشعرية مصدر اصطناعية على micromanipulator وتزج به في حل المستخدمة لقياس تدفق الأيونات في العينات. ترك المصدر الاصطناعي في حل لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة للسماح للاستقرار التدرج.
2. المصادقة على مسرى مكروي ايون انتقائية
   1. تزج مسرى مكروي ايون الانتقائي عن سنتيمتر واحد بعيدا عن الشعرية المصدر الاصطناعي في حل تستخدم لmeasuإعادة تدفق الأيونات على العينات وإغلاق الدائرة مع القطب المرجعية كما كان من قبل. السماح للقيمة الجهد استقرار ل1-3 دقائق قبل ان يسجل الجهد المقابلة باستخدام برامج مخصصة ل1-2 دقيقة. هذه القيمة يناظر قيمة عازلة (في الأدب يشار أيضا كمرجع، الخلفية أو قيمة فارغة).
   2. نقل مسرى مكروي ايون الانتقائي إلى حوالي 5 ميكرون من مصدر صناعي، والسماح للقيمة الجهد استقرار ل1-3 دقائق قبل ان يسجل الجهد المقابلة باستخدام برنامج ل1-2 دقيقة.
   3. كرر الإجراء أعلاه عن طريق وضع ايون مسرى مكروي انتقائية في 10، 20، 40، 80، 160، 320، 640 و 1280 ميكرون بعيدا عن الشعرية مصدر اصطناعية.
   4. استخراج البيانات على ملف txt ونسخ القيم في ملف البيانات.
3. حساب تركيز أيون المقابلة لقيم بالسيارات في بنفس الطريقة التي لقيم المعايرة. رسم القيمة.
   لاالشركة المصرية للاتصالات: إذا كان تدفق الأيونات هو الحاضر، ومسرى مكروي بالكشف عن اختلاف في تركيز أيون بين الموقفين (الشكل 3B). إذا كان مصدر صناعي يحتوي على أكثر أيونات من الأنواع يقاس من الحل، يجب أن يكون التركيز أعلى بالقرب من مصدر من بعيد، التحقق من قدرة مسرى مكروي ايون الانتقائي للكشف بشكل صحيح اتجاه وتدفق أيون (في هذه الحالة هروب رأس المال؛ لبالوعة الاصطناعي، مع تركيز أيون أقل تحديدا من قياس المتوسطة، ينبغي أن يكون تدفق).
   1. حساب تدفق أيون باستخدام القانون فيك من نشر: J = ج μ (العاصمة / DX) حيث ج هي تركيز أيون في حل (مول سم ^-3)، μ هي حركة الايونات (مول سم N ^-1 ثانية ^-1) والعاصمة هي الفرق تركيز على DX مسافة (سم) (الشكل 2C). وعادة ما أظهرت البيانات تدفق الأيونات في بمول سم ^{-2 ث-1} أو ^-2 نانومول سم ثانية ^-1.
      ملاحظة:. طريقة بديلة لحساب تدفق الأيونات التي وصفها سميث وآخرون ²⁶ يمكن استخدامها. وتشمل الاختلافات الرئيسية استخدام معامل الانتشار بدلا من حركة الايونات والطرح من تدفق الأيونات الخلفية (أيضا الجهد الانجراف أو معامل التصحيح) تحسب من قياس تدفق الأيونات في محلول ملحي بدون العينة.
   2. رسم متوسط ​​تدفقات أيون كل خطوة ضد المسافة من المصدر (الشكل 2D). الابتعاد عن المصدر، نلاحظ انخفاضا هائلا من قيمة التدفق التحقق من قدرة مسرى مكروي ايون الانتقائي لاستشعار حجم مختلفة من تدفقات أيون.
   3. هل التحقق من صحة مصدر الاصطناعي مرة واحدة لكل أيون معين المراد تسجيلها من أجل التحقق من صحة اتجاه وحجم قياساته الصحيحة مع الإشارة إلى ن كبيرنسبة إيل دو فرانس.
      ملاحظة: ايون قياس تدفق المخزن المؤقت دون عينات تشير إلى مستوى خلفية أو الضوضاء. عادة، ويظهر قياس عازلة عدم حدوث تذبذب واضح للتركيز أيون مما أدى إلى تدفق صغير جدا التي تعرض الاتجاهات المتغيرة.

4. إعداد غرفة القياس

ملاحظة: قبل التجارب، والنظر في العينة إلى أن تقاس وكيف كانت العينة التي يتم تركيبها ويجمد لقياس مسرى مكروي.

1. لالمورق القيطم القياسات بويضة قطع 1 سم مربع من 800 شبكة من النايلون ميكرون (شبكة nitex) والغراء قبل أن تتحول إلى البلاستيك طبق بتري (الشكل 1E).

5. ايون الجريان قياس

1. قياس تركيز أيون الحالي في المنطقة العازلة المستخدمة لتنفيذ القياسات على عينة بالطريقة نفسها كما من أجل حل المعايرة. X. البويضات المورق تتطلب التعديل قارع الأجراس مارك (MMR). دissolve كلوريد الصوديوم، بوكل، CaCl، MgCl وHEPES في الماء منزوع الأيونات للوصول إلى تركيز النهائي من (ملم): 100 كلوريد الصوديوم، 2 بوكل، 2 CaCl، 1 MgCl و 5 HEPES. ضبط درجة الحموضة من المخزن المؤقت إلى 7.5 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم.
2. وضع العينة في غرفة القياس وتقديم ايون انتقائية مسرى مكروي بالقرب من عينة (حوالي 10 ميكرون بعيدا) باستخدام micropositioner لتحديد موقف قريب من مسرى مكروي (الشكل 3A).
3. بدء تشغيل التردد المنخفض (0.3 هرتز) رحلة (100 ميكرون) من مسرى مكروي بين الموقف الوثيق وموقف بعيدا عن العينة (بعيدة) باستخدام برامج مخصصة. تأكد من أن حركة مسرى مكروي هو عمودي على سطح العينة.
   ملاحظة: رحلة من مسرى مكروي يمكن تعيين على البرنامج. رحلة كبيرة يزيد من التدرج قراءة السماح للكشف عن أسهل من تدفقات صغيرة خلال بينما قياس يطيل الفترة أخذ العينات ويقلل من القرار الزماني. شاهد 3A الشكل على سبيل المثال.
4. بدء التسجيل باستخدام البرنامج. مؤقتا مسرى مكروي في كل موقف ويتم تسجيل الجهد الكهربائي في بالسيارات على الكمبيوتر. الحصول على قياسات لمدة 2 دقيقة على الأقل، مما يتيح الاستقرار إشارة. لقصيرة التجارب مرور الزمن، والاختلافات المحتملة قياسية في موقف مصلحة للدورة طوال الوقت.
5. استخراج البيانات على ملف txt ونسخ القيم في ملف البيانات.
6. حساب تركيز أيون المقابلة لقيم بالسيارات في بنفس الطريقة التي لقيم المعايرة. رسم القيمة.
   ملاحظة: إذا كان تدفق الأيونات هو الحاضر، ومسرى مكروي بالكشف عن اختلاف في تركيز أيون بين الموقفين (الشكل 3B).
7. حساب تدفق أيون باستخدام القانون فيك من نشرها كما كان من قبل (الخطوة 3.3.1).
8. تكرار قياس المخزن المؤقت قبل قياس عينة جديدة وتكرار إجراء قياس التدفق وحساب لكل جديدةعينة.

6. التحليل الإحصائي وعرض البيانات

1. اختبار الآثار، بمعزل عن الموقف و / أو الوقت على تدفقات أيون تحت شرط التحكم باستخدام نموذج ANCOVA مع آثار مختلطة ^28.
   ملاحظة: تحليل التغاير ANCOVA، هو النموذج الخطي العام الذي يمزج ANOVA منتظم والانحدار من خلال السماح التدابير كلا الفئوية والمستمرة لاستخدامها كمتغيرات مستقلة. بالإضافة إلى ذلك، في ظل وجود أخطاء المترابطة الناجمة عن التدابير المتكررة في الآثار المتداخلة الفردية والنهائية، ويتم استخدام تأثير مختلطة نماذج لنموذج تقديرات دقيقة لكلا الآثار الثابتة والعشوائية.
2. حساب مقارنات البشرى باستخدام طالب تي -test بين مستويات المجموعة مع تصحيح Bonferroni لعدة اختبار ^28.
3. توليد boxplots لتلخيص قياسات تدفق الأيونات وفقا لموقف والوقت. وتشمل القيم ص من ر طالب البشرى وصفهفوق (الشكل 3D) وتشير إلى المستويات أهمية القيم ص على النحو التالي: *: p <0.05. **: p <0.01. ***: P <0.001 ²⁹

النتائج

لقد أظهرنا سابقا أن تدفق الكالسيوم يظهر بعد خلية واحدة اصابة ²⁴ اخرين. لذا سألنا عما إذا تدفقات ايون أخرى تحدث عند إصابة خلية واحدة. استخدمنا X. المورق البويضة، وهذا نموذج راسخة لخلية واحدة التئام الجروح ^30-34 وتسجيل الكهربية ^24،35-39. ومن المثير للاهت...

Discussion

الخطوات الأكثر أهمية لقياس النجاح في تدفقات أيون الخلية في الجسم الحي هي: الحد من الضوضاء، وتلفيق الصحيح للالميكروية ايون انتقائية والمرجعية القطب، وتحديد المواقع من العينة وكل من الأقطاب الكهربائية.

من أجل الحد من الضوضاء...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
IonAmp	BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA	none	amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
IonAmp32	BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA	none	software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Headstage pre-amplifier	BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA	INA116	BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
MicroStep Driver	BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA	none	three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Manual micropositioner	World Precision Instruments	Model KITE-R	Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Magnetic stand	World Precision Instruments	Model M10	Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Vibration isolation table	Newport Inc.	Model VW-3036-OPT-023040	Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90°, slotted faces	Newport Inc.	Model 360-90	Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table
Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel	Newport Inc.	460PD-X	none
Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel	Newport Inc.	460A-XY	none
Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament	World Precision Instruments	TW150-4	none
Electrode puller	Narishige	PC-10	none
Metal rack	Made in-house	none	Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel
Oven	QL	Model 10 Lab Oven	none
Silanization solution I	Sigma-Aldrich	85126	Hazardous, handle as recommended by provider
Glass Petri dish; Pyrex	Fisher Scientific	316060	none
Electrode/micropipette storage jar	World Precision Instruments	E215	none
Glass dessicator	Fisher Scientific	08-595E	Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight.
Plastic Pasteur pipette	Fisher Scientific	11597722	none
Bunsen burner	Fisher Scientific	S97329	none
Microscope slide	Sigma-Aldrich	S8902	none
Straight microelectrode holder	Warner Instruments	QSW-A15P	with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire
Straight microelectrode holder	World Precision Instruments	MEH3S	with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector
6 cm Petri dish	VWR	60872-306	none
Nitex mesh	Dynamic Aqua-Supply Ltd.	NTX750	none
Glue; Loctite epoxy	VWR	500043-451	Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing
Deionized water	Sigma-Aldrich	99053	none
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653	none
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P9333	none
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C1016	none
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266	none
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375	none
Sodium Hydroxyde	Sigma-Aldrich	S8045	none
Potassium Acetate	Sigma-Aldrich	P1190	none
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539	none