Измерение внеклеточного ионных потоков, используя ион-селективный автореферентных Микроэлектродные Техника

Резюме

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Аннотация

Клетки животных, растений и отдельных клеток заключены в барьере называемой клеточной мембраны, которая отделяет цитоплазму извне. Слои клеток, таких как эпителий и формируют барьер, который отделяет внутреннюю снаружи или различных отсеках многоклеточных организмов. Ключевой особенностью этих барьеров дифференциальное распределение ионов через клеточные мембраны или слоев клеток. Два свойства позволяют этого распределения: 1) мембраны и эпителия отображения избирательную проницаемость для ионов конкретных; 2) ионы транспортируются через насосы через клеточные мембраны и клеточных слоев. Эти свойства играют решающую роль в поддержании тканей физиологии и выступать в качестве реплики сигнализации после повреждения, во время ремонта или при патологическом состоянии. Ионоселективный автореферентное микроэлектрода позволяет измерять конкретных потоков ионов, таких как кальций, калий или натрий в отдельных уровнях клеток и тканей. Микроэлектрод содержит ионофор коктейль, который являетсяселективно проницаемой для конкретного иона. Внутреннее решение наполнения содержит набор концентрацию иона интереса. Электрический потенциал микроэлектрода определяется внешним концентрации иона. Как концентрация ионов изменяется, потенциал микроэлектрода изменяется в зависимости от логарифма активности ионов. При перемещении вперед и назад, рядом с источником или стоком иона (т.е. в градиента концентрации из-за потока ионов) микроэлектрод потенциал колеблется с амплитудой, пропорциональной потока ионов / градиента. Усилитель усиливает сигнал микроэлектрода, а выход записывается на компьютере. Поток ионов может быть рассчитана по закону диффузии Фика с использованием электродного потенциала колебание, экскурсии из микроэлектрода, а также других параметров, таких как конкретное подвижности ионов. В этой статье мы подробно описать методологию для измерения потоков ионов внеклеточного помощью ионно-селективный автореферентных микроэлектродного апD Приведем некоторые репрезентативные результаты.

Введение

Все животные клетки окружены липидный бислой мембраны, которая отделяет цитоплазму от внешней среды. Клетка сохраняет электрический мембранный потенциал, негативно внутри, активным транспортом ионов ^1. Мембранный потенциал источник скрытой энергии, которое клетка может использовать для работы различные молекулярные устройства в мембране ^2. Нейроны и другие возбудимые клетки имеют большие мембранных потенциалов. Быстрое открытие натриевых каналов падает мембранный потенциал (деполяризации) и производит потенциал действия, который транспортируется по всей длине нейрона ^2. Помимо этих быстрых электрических изменений, многие ткани и органы генерировать и поддерживать значительные долгосрочные электрических потенциалов. Например, кожа и эпителии роговицы генерировать и поддерживать транс-эпителиальные потенциалы и внеклеточные электрические токи, направленным накачки ионов (в основном натрия и хлорида) ^3.

палатка "> В то время как измерения эндогенного внеклеточного электрического тока с помощью вибрирующего зонда ^4-6 и измерения мембранных или транс-эпителиальных потенциалов с помощью системы микроэлектродного ^7-10 позволяют измерение электрических параметров клеточных мембран и эпителиальных клеточных слоев, они дают нет указание вида ионов, участвующих.

Микроэлектроды с селективным ионофора можно измерить конкретный концентрации ионов в растворе. Ионные градиенты или поток может быть измерена с двумя или более электродами в различных положениях. Тем не менее, внутренняя напряжение дрейфа каждого зонда будет отличаться, в результате чего точность измерений или даже обнаружение градиентом, который не присутствовал. Один электрод используется в режиме "автореферентных", когда он движется на низкой частоте между двумя точками решает эту проблему. Теперь поток ионов можно увидеть на фоне относительно медленного и стабильного сигнала дрейфа (рис 3B).

Измерительная система ионно-чувствительный использует ион-селективные автореферентных микроэлектродов для обнаружения малых внеклеточные потоки ионов, близких к ткани или отдельные клетки. Система состоит из усилителя, который обрабатывает сигнал от микроэлектрода и микро шаговый двигатель и водителю контролировать движение микроэлектрода. Ионоселективный микроэлектрода и электрод сравнения, что замкнуть цепь подключены к усилителю через headstage предварительного усилителя (фиг.1А). Компьютерное программное обеспечение определяет параметры движения микроэлектродов (частота, расстояние), а также записывает выход усилителя. Шаговый двигатель управляет движением микроэлектрода через трехмерного микроподвижки. Низкая частота вибрационный ион-селективный микроэлектрод была впервые разработана в 1990 году для измерения потока конкретной кальция ^11. А также кальций, коммерчески доступные ионофорные коктейли теперь доступны, чтобы сделать MICRoelectrodes чувствительны к натрия, хлорид, калия, магния, водорода, нитрат, аммоний, фтористый литий, или ртуть.

В принципе, автореферентное ионно-селективной микроэлектрода преобразует активность конкретного иона растворенного в растворе в электрический потенциал, который может быть измерен с помощью вольтметра. Ионофор коктейль не смешивается жидкость (органические, липофильный) фаза с ионообменных свойств. Ионофор избирательно связывается комплексов () конкретных ионов обратимо и передает их между водного раствора, содержащегося в микроэлектродов (электролит) и водного раствора, в котором микроэлектрода погружен (фиг 1D). Это перенос ионов приводит к электрохимической равновесия и изменение электрического потенциала между микроэлектрода и электродом измеряется с помощью вольтметра. Напряжение пропорционально логарифму активности ионов конкретного согласно Нернста еquation позволяет рассчитывать концентрацию ионов (рис 2А и В).

В настоящее время, несколько систем позволяют измерять потока ионов с помощью подобную концепцию или принцип. Например, сканирование Ион-селективный электрод Техника (Siet) ^12,13 или (MIFE) метод Микроэлектродные потока ионов Оценка развивается Ньюманом и Shabala ^14-16 коммерчески доступны и широко используется в научном сообществе с целью определения конкретного ион флюсы происходящих на клеточной мембране и ткани в различных животных, растений и моделей отдельных живой клетки. Ионоселективные микроэлектродов были использованы для измерения водорода, калия и кальция поток через корни растений ^17, поток хлорида в церебральных артерий крысы ¹⁸ и в пыльцевых трубок ^19, поток водорода в коньках клеток сетчатки ^20, поток кальция в кости мыши ^21, различные ионов потоки в гиф гриба ²² и в Rна роговице ²³ и, наконец, потока кальция во время одной раны клеток исцеления ^12,24. Смотрите также следующую обзор для детальной информации о ионоселективных автореферентными микроэлектродов ^25.

Следующая статья подробно описывает, как подготовить и выполнить измерения эндогенных внеклеточных потоков ионов с использованием ионно-селективный автореферентных технику микроэлектродного на одном уровне клетки.

протокол

1. Ион-селективный автореферентных Микроэлектродные Подготовка

1. Приготовление ион-селективного микроэлектрода
   1. Тепло тянуть тонкостенных боросиликатного капилляров без нити (1,5 мм наружный диаметр, мм 1.12 Внутренний диаметр) с использованием микроэлектрода съемник.
      Примечание: Это дает подсказки 3-4 мкм в диаметре. Меньшие иглы имеют более высокое сопротивление, что делает микроэлектродов более восприимчивы к электронным шумом и также связан с более медленной реакции на изменение концентрации ионов. Полезную информацию можно найти в статье, опубликованной Smith и соавт. ^26.
   2. Silanize электроды оказывать внутренней поверхности гидрофобной, чтобы помочь сохранению липофильного коктейль ионофором. Поместите микроэлектродов в металлической стойки и тепловой O / N в печи при> 100 ° C, чтобы высушить их. Стойка металлическая пластина с отверстиями диаметром 2 мм пробурено часть пути через. Поместите электроды в отверстия кончика вверх с 250 мл гдевушка стакан над ними.
   3. Утром, выключите духовку и при ношении изолирующие перчатки, аккуратно удалите металлическую стойку с электродами и стакан на место. Закройте дверцу, чтобы сохранить тепло.
   4. Носите латексные или нитриловые перчатки, халат и защитные очки. С пластиковой пипетки Пастера, поместить каплю раствора силанизация I в основании каждого электрода (держать стакан в месте, использование разливочного губу для доступа пипетки). Решение силанизация испаряется в горячей плите и silanizes внутри электродов. Используйте химический вытяжной вытяжку для этого этапа. Поместите стойки / стакан / электроды назад в горячей духовке в течение нескольких часов, чтобы позволить любые оставшиеся силанизация раствор испаряется.
      Примечание: По соображениям безопасности, не включайте духовку обратно. Поставьте метку на печи, указывающий он не должен быть включен, поскольку это может содержать вредные и легковоспламеняющиеся пары.
   5. После охлаждения, хранения микроэлектродов в памяти микроэлектрод банку Insiде стеклянную эксикатор с 400 г осушителя. Микроэлектроды можно хранить таким образом, в течение многих недель.
      Примечание: Альтернативный метод силанизация описано в Smith и соавт ^26.
   6. Назад заполнения микроэлектрода с 50 до 100 мкл (длиной около 1 см) в растворе, содержащем 100 мМ иона должны быть измерены (таблица 1 и рис 1b). Используйте одноразовые пластиковые пипетки Пастера тепло вытащил в горелку к тонкой нити. Промойте пипетку в дН ₂ O позже, чтобы предотвратить засорение.
      Примечание: В качестве альтернативы, регулировать концентрацию ионов в растворе засыпки, чтобы соответствовать концентрации иона во внешнем растворе ^27.
   7. Соблюдайте микроэлектрод под микроскопом рассекает, чтобы обеспечить отсутствие пузырьков воздуха.
      1. Если имеются пузырьки кран микроэлектрод слегка ногтем, удерживая электрод вертикально (чаевые вниз) и / или нажать пузырьS из кончика путем применения обратного давления с помощью шприца, модифицированного силиконовой трубки Замена иглы.
   8. Подсказка заполнения микроэлектрода с 15 до 20 нл (длиной 30-50 мкм) ион-специфических ионофора коктейль (таблица 1). Поставьте маленькую капельку ионофора коктейль на короткой стороне предметное стекло. Соблюдайте кончик микроэлектрода при вскрытии микроскопом и переместить его к предметное стекло, пока наконечник микроэлектрод не коснется ионофор коктейль только около половины сек. Нарисуйте ионофор коктейль в микроэлектродом счет капиллярного давления.
      Примечание: Избегайте длинная колонна ионофора коктейль, поскольку это увеличивает электрическое сопротивление зонда, который может сделать его восприимчивым электронных помех (шумов), а также замедляет время отклика.
   9. Установите микроэлектрод в прямой держатель микроэлектродов с золотой 1 мм разъемом мужского и AgCl (Ag ⁺⁾ провод (рис 1B).
   10. Установите держатель микроэлектрода в стадии головки, установленной на трехмерной компьютерным управлением электронного микроподвижки (фиг.1А).
   11. Поместите кончик микроэлектрода в измеряемого раствора подходящим для измеряемого образца (физиологический солевой раствор, культуральную среду и т.д.), чтобы позволить микроэлектрода для стабилизации в течение часа или два, или даже в течение ночи.
2. Подготовка контрольного электрода
   1. Электроды (рис 1c) такие же, как указано выше капилляров. Разрежьте капиллярную с алмазной карандашом на 5 см длины и огневой полировкой на каждом конце для 1-2 сек в пламени Бунзена.
   2. Заполните эти электроды с ~ 200 мкл 3 М раствора NaCl, СН ₃ СО ₂ К (ацетат калия) или KCl 2% агарозы. Выбрать решение в зависимости от иона должна быть измерена (электрод не должен содержать ион измеряемого; таблица 1). Смешиватьагарозы и решение и тепло почти кипения в микроволновой печи. Движение, чтобы растворить агарозы (решение выходит ясно).
   3. Прикрепите электрод в пластиковом пипетки Пастера и сделать горячий раствор в капилляре.
   4. Оставьте электрод в холодную 3 М NaCl, CH ₃ CO ₂ K или раствора хлорида калия и в магазине в этом 3 М раствора в закрытых трубах до использования. Откажитесь от любых электродов сравнения с воздушными пузырьками.
   5. Установить электрод в держатель прямой микроэлектродов (предварительно заполнены 3 М раствора) с AgCl (Ag ⁺⁾ гранул внутри и золото 2 мм штырьковый разъем (рис 1c) и прикрепить электрод и держатель на ручной микро-позиционером установленный на магнитной подставке.

2. Ион-селективный автореферентных Микроэлектродные калибровки

1. Подготовка калибровочные растворы, содержащие ион интерес как в эталонного раствора; Таблица 1 . Кронштейн концентрацию, которая в растворе образца будет в (например, культуры средств массовой информации, физиологический раствор). То есть, один калибровочный раствор должен содержать более низкую концентрацию иона, чем в измерительном растворе, и один выше.
   1. Например, можно использовать физиологический раствор, содержащий 1 мМ K ^+. К кронштейну эту концентрацию, растворить порошок KCl в деионизованной воде до концентрации 10, 1 и 0,1 мМ в серийных разведений. Используйте эти калибровочные растворы. В качестве альтернативы, использовать как минимум два из этих решений.
2. Опустить ион-селективный микроэлектрода и электрод сравнения в каждого калибровочного раствора и пусть значение напряжения стабилизации в течение от 1 до 3 мин перед записью соответствующего напряжения с помощью специального программного обеспечения (таблица 1).
3. Как программа сохраняет данные (выход усилителя), как текстовый файл, скопировать данные в файл электронной таблицы. Участок вывода микроэлектродного (мВ) от логарифмамолярная концентрация иона (фиг.2А).
4. Применить линейную регрессию и вычислить Нернста наклона, перехват и R ² значения. Примите микроэлектрод если наклон Нернста 58 ± 11 мВ / декада для одновалентных ионов и 29 ± 11 мВ / декада для ионов двухвалентных (для катионов, наклон Нернста положительный, для анионов отрицательно). Кроме того, хорошие микроэлектродов должны иметь сильную линейную корреляцию (R ^2> 0,9; рис 2B).
   Примечание: мВ выход усилителя, используемого здесь дает мВ чтение с десятикратного увеличения. Значения должны быть разделены в десять раз.
5. Используйте линейный регрессионный формулу для преобразования сырья мВ выход микроэлектродом в фактической концентрации ионов (рис 2B).

3. Проверка ионоселективной Микроэлектродные техники

1. Подготовка искусственный источник
   1. Искусственные капилляры источник те же капилляры каквыше. Тепло тянуть капилляр, используя съемник микроэлектрода, как в шаге 1.1.1.
   2. Засыпьте эти капилляры 200 мкл 1 М раствора NaCl, KCl, CaCl ₂ 2Н ₂ O или рН буферных 4. Выбор искусственного исходный раствор в зависимости от иона должна быть измерена (таблица 1).
      Примечание: В качестве альтернативы, тянуть электроды с большим диаметром наконечника (~ 20 мкм) и наконечником заполнить с теми же решений, но содержащий 0,5-1% агарозы (агарозы предотвратит объемного потока раствора).
   3. Установите искусственного источника капилляр на микроманипулятора и погрузить его в растворе, используемом для измерения потока ионов в пробах. Оставьте искусственный источник в раствор в течение 30 мин до 1 часа, чтобы дать стабилизацию градиента.
2. Подтверждение ион-селективного микроэлектрода
   1. Опустить ион-селективный микроэлектрода около одного сантиметра от искусственного источника капилляра в растворе, используемом для measuRe потока ионов на образцах и закрыть контур с электродом, как и раньше. Пусть величина напряжения стабилизации в течение от 1 до 3 мин перед записью соответствующего напряжения с помощью специального программного обеспечения в течение 1 2 мин. Это значение соответствует значению буфера (в литературе также называют в качестве эталонного, фон или пустое значение).
   2. Перемещение ион-селективный микроэлектрода до примерно 5 мкм от искусственного источника, и пусть значение напряжения стабилизации в течение от 1 до 3 мин перед записью соответствующего напряжения с помощью программного обеспечения для 1 до 2 мин.
   3. Повторите вышеописанную процедуру, помещая ионоселективных микроэлектрода в 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 и 1280 мкм от искусственного источника капилляра.
   4. Извлечение данных как текстовый файл и скопируйте значения в файле электронной таблицы.
3. Вычислить концентрацию ионов, соответствующих значениям мВ таким же образом, как и для калибровочных значений. Участок значение.
   НетTe: Если поток ионов присутствует, микроэлектрода обнаруживает разницу в концентрации ионов между двумя положениями (Фиг.3В). Если искусственный источник содержит больше ионов вида измеренных, чем решение, концентрация должна быть выше близко к источнику, чем далеко, проверки способности ионоселективной микроэлектродом правильно определить направление потока ионов в (в данном случае Отток; для искусственного раковиной, с низкой удельной концентрации ионов, чем измеряемой среды, он должен быть приток).
   1. Рассчитать поток ионов, используя закон Фика диффузии: J = с μ (DC / дх), где с-концентрация ионов в растворе (моль см ^-3), μ является подвижность ионов (моль см ^-1 N сек ^-1) и постоянного тока разница концентрация на расстоянии дх (см) (рис 2С). Данные потока ионов, как правило, представлены в пмоль см ^-2 с^-1 Или ^-2 нмоль см сек ^-1.
      Примечание:.. Альтернативный метод расчета потока ионов, описанной Смитом и др ²⁶ может быть использован. Основные различия включают в себя использование коэффициента диффузии вместо подвижность ионов и вычитание фона потока ионов (также напряжения на дрейф или поправочный коэффициент), рассчитанной из измерений потока ионов в солевом растворе без образца.
   2. Участок среднее ионных потоков каждого шага против расстоянии от источника (рис 2D). Отойдя от источника, наблюдать экспоненциальное падение стоимости потока данных, подтверждающих способность ион-селективного микроэлектродом чувствовать разной величины ионных потоков.
   3. Сделайте проверку искусственного источника один раз для каждого конкретного иона, предназначенной для записи, чтобы проверить ее правильные измерения направления и величины с большой сигнал-пУаз отношение.
      Примечание: Измерение потока ионов буфера без образцов показывает уровень фона или шума. Как правило, измерения буфера не показывает четкую колебания концентрации ионов, ведущей к очень малым потоком, который отображает переменных направлений.

4. Подготовка измерительной камере

Примечание: Перед экспериментами, рассмотрим образец для измерения и как образец должен быть установлен и иммобилизованных для измерения микроэлектродов.

1. Для Xenopus Laevis измерения ооцитов вырезать 1 см площади 800 мкм нейлон сетки (сетки NITEX) и приклейте ее в пластиковый Петри (рис 1E).

5. Поток Измерение Ион

1. Измерение концентрации ионов, присутствующих в буфер, используемый для выполнения измерения на образце таким же образом, как для калибровочного раствора. Х. Laevis ооциты требуют Марка Modified Рингер (MMR). Dissolve NaCl, KCl, CaCl, MgCl и HEPES в деионизированной воде до конечной концентрации (мм): 100 NaCl, KCl 2, 2 CaCl, MgCl и 1 5 HEPES. Доводят рН буфера до 7,5 с использованием NaOH.
2. Поместите образец в измерительную камеру и довести ион-селективный микроэлектрода близко к образцу (примерно 10 мкм) с применением в микроподвижки чтобы определить закрытое положение микроэлектрода (фиг.3А).
3. Начало низкой частоты (0,3 Гц) экскурсии (100 мкм) микроэлектрода между закрытом положении и в положении от образца (отдаленного) с использованием специального программного обеспечения. Убедитесь, что движение микроэлектрода перпендикулярно поверхности образца.
   Примечание: экскурсия по микроэлектродом может быть установлен на программное обеспечение. Большая экскурсия увеличивает градиент прочитать позволяет легче обнаружить мелких потоков во время измерения время удлиняет интервал дискретизации и уменьшает временное разрешение. Увидеть Рисунок 3A в качестве примера.
4. Начните запись с помощью программного обеспечения. Микроэлектрода паузу в каждом положении и электрический потенциал в мВ записывается на компьютере. Получение измерения, по меньшей мере 2 мин, позволяя стабилизации сигнала. Для коротких покадровой экспериментов, запись потенциальных изменений в положении интерес в течение всего времени, конечно.
5. Извлечение данных как текстовый файл и скопируйте значения в файле электронной таблицы.
6. Вычислить концентрацию ионов, соответствующих значениям мВ таким же образом, как и для калибровочных значений. Участок значение.
   Примечание: Если поток ионов присутствует, микроэлектрода обнаруживает разницу в концентрации ионов между двумя положениями (Фиг.3В).
7. Рассчитать поток ионов, используя закон Фика диффузии, как и раньше (шаг 3.3.1).
8. Повторите измерение буфера перед измерением новый образец и повторить процедуру измерения потока и расчета для каждого новогообразец.

6. Статистический анализ и представления данных

1. Проверьте независимые эффекты положения и / или времени на ионных потоков при условии управления использованием ANCOVA модели со смешанными эффектами ^28.
   Примечание: Анализ ковариации (ANCOVA) является общей линейной модели, которая смешивает регулярное ANOVA и регрессии, позволяя одновременно категорные и непрерывные меры, которые будут использованы в качестве независимых переменных. Кроме того, в присутствии коррелированных ошибок, вызванных повторными измерениями в отдельных и возможных вложенных эффектов, смешанные эффекты модели используются, чтобы моделировать точные оценки фиксированных и случайных эффектов.
2. Рассчитать парных сравнений с использованием Стьюдента Испытайте между уровнями группы с коррекцией Бонферрони для многократного тестирования ^28.
3. Создание присущи рефлективный, вербальный, чтобы обобщить измерения потока ионов в соответствии с положением и времени. Включить р значения из попарно Стьюдента, описанноговыше (рис 3D) и указать уровни значимости р значений следующим образом: *: р <0,05; **: Р <0,01; ***: Р <0,001 ²⁹

Результаты

Ранее мы уже показали, что приток кальция появляется после одной клетки ранив ^24. Поэтому мы попросили, происходят ли другие потоки ионов на одной ранения клеток. Мы использовали X. Laevis яйцеклетки, устоявшуюся модель одной клетки заживления ран ^30-34 и электрофизиологическ...

Обсуждение

Наиболее важные шаги для успешного измерения внеклеточного потоков ионов в естественных условиях являются: снижение шума, правильно выдумка ион-селективные микроэлектродов и электродом сравнения, и позиционирование образца и обоих электродов.

Для того чтобы мин?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
IonAmp	BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA	none	amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
IonAmp32	BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA	none	software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Headstage pre-amplifier	BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA	INA116	BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
MicroStep Driver	BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA	none	three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Manual micropositioner	World Precision Instruments	Model KITE-R	Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Magnetic stand	World Precision Instruments	Model M10	Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Vibration isolation table	Newport Inc.	Model VW-3036-OPT-023040	Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90°, slotted faces	Newport Inc.	Model 360-90	Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table
Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel	Newport Inc.	460PD-X	none
Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel	Newport Inc.	460A-XY	none
Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament	World Precision Instruments	TW150-4	none
Electrode puller	Narishige	PC-10	none
Metal rack	Made in-house	none	Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel
Oven	QL	Model 10 Lab Oven	none
Silanization solution I	Sigma-Aldrich	85126	Hazardous, handle as recommended by provider
Glass Petri dish; Pyrex	Fisher Scientific	316060	none
Electrode/micropipette storage jar	World Precision Instruments	E215	none
Glass dessicator	Fisher Scientific	08-595E	Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight.
Plastic Pasteur pipette	Fisher Scientific	11597722	none
Bunsen burner	Fisher Scientific	S97329	none
Microscope slide	Sigma-Aldrich	S8902	none
Straight microelectrode holder	Warner Instruments	QSW-A15P	with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire
Straight microelectrode holder	World Precision Instruments	MEH3S	with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector
6 cm Petri dish	VWR	60872-306	none
Nitex mesh	Dynamic Aqua-Supply Ltd.	NTX750	none
Glue; Loctite epoxy	VWR	500043-451	Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing
Deionized water	Sigma-Aldrich	99053	none
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653	none
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P9333	none
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C1016	none
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266	none
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375	none
Sodium Hydroxyde	Sigma-Aldrich	S8045	none
Potassium Acetate	Sigma-Aldrich	P1190	none
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539	none