İyon seçici Kendinden referans Mikroelektrod Tekniği Ekstraselüler Ion eriticiler Ölçümü

Özet

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Özet

Hayvan, bitki ve tek hücre hücreler dışarıdan sitoplazma ayıran hücre zarı olarak adlandırılan bir bariyer ile kapatılmıştır. Örneğin epitelde gibi hücre tabakaları da dış ya da çok hücreli organizmaların farklı kompartmanların iç ayıran bir bariyer oluşturur. Bu engellerin önemli bir özelliği, hücre membranları veya hücre tabakaları iyonların ayırıcı dağılımıdır. İki özellikleri bu dağılımı sağlar: 1) membranlar ve epitel belirli iyonların seçici geçirgenliğini gösterir; 2) iyonları hücre zarları ve hücre katmanları arasında pompa aracılığıyla taşınmaktadır. Bu özellikler, doku fizyolojisini korunmasında önemli rol oynarlar ve tamir sırasında, hasar sonrası ipuçlarını sinyal olarak hareket ya da patolojik koşullarda. iyon seçici kendi kendine referans mikroelektrot bu tip bir tekli hücre ve doku seviyelerinde kalsiyum, potasyum veya sodyum gibi iyonların özel tozlar ölçümleri sağlar. mikroelektrot bir iyonofor kokteyl içerirBelirli bir iyon seçici olarak geçiren. İç dolgu çözüm ilgi iyon bir dizi konsantrasyonunu içerir. mikroelektrot elektrik potansiyeli iyonunun dışında konsantrasyonu ile belirlenir. Iyon konsantrasyonu değişir, mikroelektrot potansiyeli iyon aktivitesinin günlüğünün bir fonksiyonu olarak değişir. (Nedeniyle iyon akı bir konsantrasyon gradyanı yani) ileri ve geri iyonu kaynağı veya lavabonun yanında taşındığında mikroelektrod potansiyeli iyon akışı / degrade orantılı bir genlikte dalgalanır. amplifikatör mikroelektrot sinyalini güçlendirir ve çıkış bilgisayarda kaydedilir. iyon akışı daha sonra spesifik iyon hareketliliği olarak elektrot potansiyel dalgalanma, mikroelektrot gezi ve diğer parametreleri kullanarak difüzyon Fick'in yasayla hesaplanabilir. Bu yazıda iyon seçici self-referencing mikroelektrod An kullanarak dışı iyon akıları ölçmek için metodoloji detaylı tarifbazı temsilcisi sonuçlarını sunmak d.

Giriş

Tüm hayvan hücreleri dış çevreden sitoplazma ayıran bir lipid iki katmanlı zar ile çevrelenmiştir. Hücre iyonlarının ¹ aktif taşıma ile, içinde bir elektrik membran potansiyelini negatif tutar. membran potansiyeli hücre zarında ² çeşitli moleküler cihazları çalıştırmak için kullanabileceği bir depolanmış enerji kaynağıdır. Nöronlar ve diğer heyecanlı hücrelerin büyük zar potansiyelleri var. Sodyum kanallarının hızlı açılış membran potansiyeli (depolarizasyon) çöker ve nöron ² uzunluğu boyunca taşınır aksiyon potansiyeli oluşturur. Bunların yanı sıra hızlı elektrikli değişikliklerden birçok doku ve organları oluşturmak ve uzun vadede önemli elektrik potansiyellerini korumak. Örneğin, deri ve kornea epitel oluşturmak ve iyonların yönlü pompalama (özellikle, sodyum ve klorid) ³ trans-epitel potansiyelleri ve hücre dışı elektrik akımı muhafaza.

endojen hücre dışı elektrik akımı ölçümleri titreşimli prob ^4-6 ve hücre zarlarının ve epitel hücre katmanlarının elektrik parametrelerinin ölçümünü sağlayan mikroelektrod sistemini ^7-10 kullanarak membran veya trans-epitel potansiyellerin ölçümleri kullanırken çadır ">, onlar vermek katılan iyon türlerinin göstergesi.

Seçici iyonofor ile Mikroelektronlar çözelti içinde spesifik iyon konsantrasyonunu ölçebilirsiniz. İyon gradyanları ya da akışkan farklı konumlarda iki veya daha fazla elektrot ile ölçülebilir. Ancak, her sonda içsel gerilim sürüklenme, farklı olabilir yanlış ölçüm ya da mevcut olmayan bir degrade bile tespit sebep olacaktır. İki nokta arasındaki düşük frekansta hareket sayede "self-referans" modunda kullanılan tek bir elektrot bu sorunu çözer. Şimdi iyon akışı nispeten yavaş ve istikrarlı sinyal sürüklenme arka planı görülebilir (Şekil 3B).

iyona duyarlı bir ölçüm sistemi doku veya tek hücre yakın iyonlarının küçük bir hücre-dışı akıları tespit etmek için iyon seçici kendinden referans Mikroelektronlar kullanır. Sistem mikroelektrot hareketini kontrol etmek mikroelektrot ve mikro step motor ve sürücü sinyali işleyen bir amplifikatör oluşur. devresini kapatmak iyon seçici mikroelektrot ve ayrıca referans elektrotu bir headstage pre-amplifikatör (Şekil 1A) ile amplifikatöre bağlanır. Bilgisayar yazılımı Mikroelektrot hareketi (frekans, mesafe) parametrelerini belirler ve ayrıca amplifikatör çıkışını kaydeder. adım motoru, üç boyutlu bir micropositioner ile mikroelektrot hareketini kontrol eder. Iyon seçici mikroelektrot titreşimli düşük frekanslı ilk belirli kalsiyum akı ¹¹ ölçmek için 1990 yılında geliştirilmiştir. Yanı sıra kalsiyum gibi, ticari erişilebilir iyonofor kokteyller şimdi MICR yapmak için kullanılabiliroelectrodes sodyum, klorür, potasyum, hidrojen, magnezyum, nitrat, amonyum, florür, lityum ya da cıva duyarlı.

Temel olarak, kendi kendine referans iyon seçici mikroelektrot tekniği, bir voltmetre ile ölçülebilir bir elektrik potansiyel bir çözelti içinde çözündürüldü, belirli bir iyon aktivitesini dönüştürür. iyonofor kokteyli karışmayan sıvı iyon-değişim özelliklerine sahip (organik, lipofilik) aşamasıdır. iyonofor seçici (bağlar) belirli bir iyonlar, tersine çevrilebilir şekilde ve mikroelektrot (elektrolit) içerdiği, sulu çözeltisi ve mikroelektrot daldırılmış olduğu bir sulu çözelti (Şekil 1D) arasındaki aktarma çalışmalarının kompleksleri. Bu, iyon aktarımı, bir elektro-kimyasal denge yol açar ve mikroelektrot ve referans elektrot arasında elektrik potansiyeli değişimi voltmetre ile ölçülür. Gerilim Nernst e göre özel iyonu aktivitesinin logaritması ile orantılı olduğuiyon konsantrasyonu (Şekil 2A ve B) hesaplanmasını sağlayan quation.

Şu anda, birkaç sistemler benzer bir kavram ya da ilke kullanarak iyon akışının ölçümü sağlar. Örneğin, Newman ve Shabala ^14-16 tarafından geliştirilen tarama İyon seçici elektrot Tekniği (SIET) ^12,13 veya Mikroelektrod Ion Akı Tahmini (MIFE) tekniği piyasada mevcut ve yaygın belirli iyonu belirlemek amacıyla araştırma topluluğu tarafından kullanılmaktadır hayvan, bitki ve tek canlı hücre modelleri çeşitli genelinde hücre zarı ve doku meydana gelen akıları. İyon seçici Mikroelektronlar serebral arter farede ¹⁸ ve polen tüpleri ^19, paten retina hücreleri ²⁰ hidrojen akı, fare kemik ^21, çeşitli iyon kalsiyum akışının hidrojen, potasyum ve kalsiyum akısını bitki köklerine ¹⁷ arasında, klorür akının ölçülmesi için kullanılmıştır mantar hif ²² ve r akılarıTek hücreli yara sırasında kornea ²³ ve son olarak kalsiyum akı ile ^12,24 şifa. Ayrıca iyon seçici kendinden referanslı Mikroelektronlar ²⁵ hakkında detaylı bilgi için aşağıdaki gözden bakın.

aşağıdaki makale hazırlamak ve tek hücre düzeyinde iyon seçici self-referencing mikroelektrod tekniği kullanılarak endojen hücre dışı iyon akıları ölçümünü nasıl gerçekleştirileceği detaylı olarak anlatılmaktadır.

Protokol

1. İyon seçici Kendinden referans Mikroelektrod Hazırlık

1. Iyon seçici mikroelektrot hazırlanması
   1. Isı, bir mikroelektrot çektirmenin kullanarak filamanın (1.5 mm dış çaplı, 1.12 mm iç çap) olmadan, ince duvarlı borosilikat kılcal çekin.
      Not: Bu, ipuçları çapı 3-4 mikron verir. Daha küçük ipuçları elektronik gürültüye Mikroelektronlar daha duyarlı hale getirir ve aynı zamanda iyon konsantrasyonunda bir değişikliğe daha yavaş bir tepki ile ilişkili yüksek dirence sahiptir. Faydalı bilgiler Smith ve ark., ²⁶ tarafından yayınlanan yazıda bulunabilir.
   2. Lipofilik iyonofor kokteyl tutulmasını yardımcı olmak için iç yüzeyini hidrofobik hale getirmek için elektrotlar Silanize. Bunları kurutmak için> 100 ° C 'de, bir fırın içinde bir metal raf ve ısı O / N mikroelektrot yerleştirin. raf 2 mm çapında delikleri olan bir metal plaka ile yol parçası delinir. Ml gr delik elektrotlar 250 ile yukarı ucu yerleştirinbunların üzerine kız beher.
   3. Sabah, fırın kapatın ve yalıtımlı eldiven giyerek, dikkatle yerine elektrotlar ve beher metal raf çıkarın. Isıyı korumak için fırın kapağını kapatın.
   4. Lateks veya nitril eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük takın. Plastik Pasteur pipeti ile, her elektrodun dibinde silanizasyon çözeltisinin ben bir damla koyun (yerinde beher tutmak, pipet erişimi için dökme dudak kullanın). silanizasyon çözüm sıcak plaka ile buharlaşmış ve elektrotların içini silanizes edilir. Bu aşamada bir kimyasal çıkarıcı davlumbaz kullanın. Birkaç saat kalan silanizasyon çözümü buharlaşmasına izin sıcak fırında raf / beher / elektrotların geri yerleştirin.
      Not: Güvenlik nedeniyle, tekrar fırını açmayın. Zararlı ve yanıcı buhar içerebilir gibi açık olmamalıdır gösteren fırın bir etiket yerleştirin.
   5. Soğutulduktan sonra, bir mikroelektrot kavanozlar insi mikroelektrot depolamakkurutucu 400 g cam bir desikatörde de. Mikroelektronlar haftalarca bu şekilde saklanabilir.
      Not: alternatif bir silanizasyon yöntemi Smith ve diğerleri tarafından tarif ^{edilmektedir: 26.}
   6. Ölçülecek olan iyon, 100 mM ihtiva eden bir çözelti 50-100 ul (yaklaşık 1 cm uzunluğu) (bakınız Tablo 1 ve Şekil 1B) mikroelektrot geri-dolgu. Ince bir filamanın bir Bunsen beki çekti atılabilir plastik Pasteur pipeti ısı kullanın. Tıkanmayı önlemek için daha sonra DH ₂ O pipet durulayın.
      Not: Alternatif olarak, dış solüsyon ²⁷ iyon konsantrasyonunu maç dolgu çözeltisinin iyon konsantrasyonunu ayarlayın.
   7. Hava kabarcıkları olmaması sağlamak için bir tahlil mikroskobu altında mikroelektrot dikkate alınmalıdır.
      1. Dikey elektrot tutarken kabarcıklar tırnağınızla hafifçe mikroelektrot mevcut musluk varsa (aşağı ucu) ve / veya kabarcık itinİğneyi yerine bir silikon tüp ile modifiye bir şırınga kullanarak geri basınç uygulayarak ucu dışarı s.
   8. Iyon spesifik iyonofor kokteyl 15 ila 20 nl (30-50 mikron uzunluğunda) ile mikroelektrot ucu doldurmak (bakınız Tablo 1). Bir mikroskop lamı kısa kenarında iyonofor kokteyl küçük bir damlacık yerleştirin. Diseksiyon mikroskobu altında mikroelektrot ucu gözlemleyin ve mikroelektrod ucu sadece yaklaşık yarım saniye iyonofor kokteyl temas edene kadar mikroskop lamı doğru hareket ettirin. Kılcal basınç ile mikroelektrot içine iyonofor kokteyl çizin.
      Not: Bu elektronik parazit (gürültü) ile bu duyarlı yapabilirsiniz sondanın elektrik direncini artırır ve aynı zamanda yanıt süresini yavaşlatır olarak iyonofor kokteyl uzun bir sütun kaçının.
   9. Altın, 1 mm erkek konektör ve AgCİ (Ag ^+), tel (Şekil 1B) düz bir mikroelektrot tutucu mikroelektrot monte edin.
   10. Üç boyutlu bilgisayar kontrollü elektronik micropositioner (Şekil 1A) üzerine monte kafa aşamasına mikroelektrot yuvasını takın.
   11. Örnek ölçülebilir için çözelti, uygun ölçme bölgesi mikroelektrot ucu yerleştirin (fizyolojik tuzlu su, kültür ortamı, vs.) mikroelektrot bir saat ya da iki ya da gece boyunca stabilize etmek için izin vermek.
2. Referans elektrotunun hazırlanması
   1. Referans elektrot (Şekil 1C), yukarıdaki ile aynı kılcal bulunmaktadır. 5 cm uzunluklarda bir elmas kalemle kılcal kesin ve Bunsen alev 1-2 saniye boyunca her iki ucunda yangın cilalı.
   2. NaCI, 3 M çözelti, ~ 200 ul, bu elektrotlar dolgu,% 2 agaroz ile _{CH3 CO2} K (potasyum asetat) ya da KCI. Iyon bağlı olarak çözelti, ölçülecek seç (referans elektrotu ölçülecek iyon içermemelidir; bakınız Tablo 1). Karıştırmakagaroz ve neredeyse bir mikrodalga kaynar çözümü ve ısı. Agaroz çözmek için karıştırın (çözelti berrak gider).
   3. Bir plastik Pasteur pipeti referans elektrodu takın ve kılcal içine sıcak çözüm çizin.
   4. Kullanmadan önce mühürlü tüplerde bu 3 M çözelti soğuk 3 M NaCI, CH ₃ CO ₂ K veya KCl çözeltisi ve mağaza içine elektrod bırakın. Hava kabarcıkları ile herhangi bir referans elektrotlar atın.
   5. Düz bir mikroelektrot tutucu bir referans elektrot içindeki (önceden doldurulmuş 3 M çözelti) ile bir AgCI (Ag ⁺⁾ ile pelet ve altın 2 mm erkek konektör (Şekil 1C) monte edin ve bir manuel mikro konumlayıcı üzerine elektrotu ve tutucuyu manyetik bir stand üzerine monte edilmiş.

2. İyon seçici Kendinden referans Mikroelektrod Kalibrasyon

1. Referans çözelti olarak ilgi iyonu içeren kalibre çözümleri hazırlanması; Tablo 1 bakınız ong. Çözelti örnek olacak (örneğin kültür ortamı, serum fizyolojik) olan konsantrasyonu ayraç. Yani, bir kalibrasyon çözeltisi ölçüm çözeltisi içinde daha iyonunun daha düşük bir konsantrasyonda içerir ve daha yüksek bir zorunluluktur.
   1. Örneğin, K ⁺ 1 mM içeren tuzlu su kullanın. Bu konsantrasyon braketine, seri seyreltiler halinde 10, 1 ve 0.1 mM bir konsantrasyona kadar iyonu giderilmiş su içinde KCI toz çözülür. Bu kalibrasyon çözümlerini kullanın. Seçenek olarak ise, bu çözümlerin en az iki kullanın.
2. Iyon seçici mikroelektrot ve her kalibrasyon çözeltisi içinde referans elektrot daldırın ve voltaj değeri özel bir yazılım kullanılarak ilgili gerilim kaydetmeden önce 1 dk 3 için stabilize izin (Tablo 1).
3. Yazılım bir txt dosyası olarak veri (amplifikatör çıkışı) olarak kaydeder, bir elektronik tablo dosyasına veri kopyalama. Logaritması karşı Mikroelektrot çıkışı (mV) Plotmol iyon konsantrasyonu (Şekil 2A).
4. Doğrusal regresyon uygulayın ve Nernst eğim, kesişme ve ^R2 değerini hesaplamak. Nernst eğim tek değerli iyonlar için 58 ± 11 mV / on ve iki değerlikli iyonlar için 29 ± 11 mV / on ise mikroelektrot Kabul (katyonlar için, Nernst eğim anyonlar için negatiftir, pozitiftir). Ayrıca, iyi Mikroelektronlar güçlü bir doğrusal ilişki (Şekil 2B R ^2> 0.9) olması gerekir.
   Not: Burada kullanılan amplifikatörün mV çıkış mV on kat kazanç okuma verir. Değerler on kat bölünmesi gerekir.
5. Gerçek iyon konsantrasyonu (Şekil 2B) içine mikroelektrot ham mV çıkış dönüştürmek için lineer regresyon formülü kullanın.

İyon seçici Mikroelektrod Tekniği 3. Doğrulama

1. Yapay kaynak hazırlanması
   1. Yapay kaynak kılcal aynı kılcal damarlar gibidirYukarıda. Isı adım 1.1.1 deki gibi bir mikroelektrot çektirmenin kullanarak kılcal çekin.
   2. NaCI, KCI, 1 M çözelti, 200 ul, _CaCI2 2H _2, O ya da pH 4 tamponu, bu kılcal Dolgu. Seçin iyon bağlı yapay kaynak çözüm (Tablo 1) ölçülecek.
      Not: Alternatif olarak, büyük uç çapı (~ 20 mm) ile elektrotlar çekin aynı çözümleri ile ucu doldurun ama% 0.5-1 agaroz içeren (agaroz çözüm herhangi bir toplu akışını önleyecektir).
   3. Bir mikromanipülatör yapay kaynaklı kapiler monte edin ve örneklerde iyon akışını ölçmek için kullanılan çözelti içinde bırakın. Gradyan stabilizasyonunu sağlamak için 1 saat kadar 30 dakika boyunca çözelti içinde yapay kaynak bırakın.
2. Iyon seçici mikroelektrot Doğrulama
   1. İki ölçme işlemi için kullanılan çözeltide yapay kaynaklı kılcal ila yaklaşık bir santimetre uzaklıkta iyon seçici mikroelektrot daldırınörnekler üzerinde iyon akı yeniden ve daha önce olduğu gibi referans elektrodu ile devreyi kapatın. Gerilim değeri 1 ila 2 dakika süreyle özel bir yazılım kullanılarak ilgili gerilim kaydetmeden önce 1 dk 3 için stabilize edelim. Bu değer, (aynı zamanda bir referans, arka plan veya boş değer olarak ifade literatürde) tamponu değerine karşılık gelir.
   2. Yapay kaynaktan yaklaşık 5 um iyon seçici mikroelektrot getirin ve 1-2 dakika için bir yazılım kullanılarak ilgili gerilim kayıt işleminden önce voltaj değeri 1 dakika ila 3 için stabilize sağlar.
   3. Yapay kaynak kılcal uzak 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 ve 1280 mikron de iyon seçici mikroelektrot koyarak yukarıdaki işlemi tekrarlayın.
   4. Bir txt dosyası olarak verileri ayıklayın ve bir elektronik tablo dosyasına değerleri kopyalayın.
3. Kalibrasyon değerleri için olduğu gibi aynı şekilde mV değerlerine karşılık gelen iyon konsantrasyonu hesaplanır. Değeri çizilir.
   Hayırte: bir iyon akışı varsa, mikroelektrot iki konum (Şekil 3B) arasındaki iyon konsantrasyonu bir fark tespit eder. Yapay kaynaklı çözeltisi daha ölçülen türlerin daha fazla iyon içeriyorsa, konsantrasyon doğru (bu durumda, bir iyon akışının yönünü tespit etmek için iyon seçici mikroelektrot yeteneğini doğrulamak uzakta, daha kaynağına daha yakın olmalıdır akış; yapay lavabo için, orta ölçme daha düşük spesifik iyon konsantrasyonu ile bu) akını olması gerekir.
   1. Difüzyon Fick yasasını kullanarak iyon akışını hesaplayın: J = c μ c çözeltide iyon konsantrasyonunu (mol cm ^-3) ise, μ iyon hareketlilik olduğunu (DC / dx) (mol cm N ^-1 sn ^-1) ve DC mesafesi dx (cm) (Şekil 2C) üzerine konsantrasyonu farktır. İyon akı veriler genellikle pmol cm ^-2 s sunulmuştur^-1 Veya nmol cm ^-2 sn ^-1.
      Not:.. Smith ve arkadaşları ²⁶ tarafından tarif edilen iyon akışı hesaplama için alternatif bir yöntem de kullanılabilir. Ana farklılıklar difüzyon katsayısı kullanımı yerine iyon hareketlilik ve numune olmadan tuzlu su çözeltisi içinde iyon akışının ölçümü hesaplanan arka plan iyon akı (ayrıca sürüklenme veya düzeltme faktörü voltaj) çıkarma sayılabilir.
   2. Kaynak (Şekil 2D) uzaklaştıkça karşı her bir aşama, iyon tozlar ortalamasını çizilir. Kaynağından uzaklaşan, iyon akı farklı büyüklüğünü algılamak için iyon seçici mikroelektrot yeteneğini doğrulama akı değeri üstel azalma gözlemlemek.
   3. Büyük bir sinyal-n onun doğru yönü ve büyüklüğü ölçümleri doğrulamak için kaydedilen amaçlanan her bir spesifik iyon kez yapay kaynak doğrulama yapınOise oranı.
      Not: numune olmadan tampon iyon akışı ölçümü arka plan düzeyi veya gürültü gösterir. Tipik olarak, tampon ölçümü değişken yön gösterir çok küçük akı giden iyon konsantrasyonunun net dalgalanma gösterir.

Odası'nı Ölçme 4. hazırlanması

Not: deneyler öncesinde, örnek ölçülecek düşünün ve örnek nasıl monte edilir ve mikroelektrot ölçümleri için hareketsiz hale getirilecek.

1. Xenopus oosit ölçümleri 800 um naylon örgü (Nitex örgü) içindeki bir 1 cm'lik bir karenin kesilmiş ve plastik Petri kabı (Şekil 1E) içine tutkal laevis için.

5. iyon akışı ölçüm

1. Kalibrasyon çözeltisi ile aynı şekilde örnek ölçümler yapmak için kullanılan tampon içinde mevcut iyon konsantrasyonu ölçümü. X. laevis oositleri Mark'ın Modifiye Zil (MMR) gerektirir. D100 NaCl, 2 KCI, 2 CaCl, 1 MgCl ve 5 HEPES: issolve NaCI, KCI, CaC, MgCİ ve deiyonize su içine HEPES (mM) bir son konsantrasyon elde etmek. NaOH kullanılarak 7.5'e tampon pH ayarlayın.
2. Ölçüm odasına örnek yerleştirin ve mikroelektrot (Şekil 3A) yakın konumunu tanımlamak için micropositioner kullanarak (yaklaşık 10 mikron uzaklıkta) numune yakın iyon seçici mikroelektrot getir.
3. Özel yazılımı kullanarak yakın pozisyonda ve uzak (uzak) örnek bir pozisyon arasında mikroelektrot düşük frekanslı (0.3 Hz) gezi (100 mikron) başlatın. Mikroelektrot hareketi örneğinin yüzeyine dik olduğundan emin olun.
   Not: mikroelektrot gezi yazılımına ayarlanabilir. Büyük gezi ölçüm süre boyunca küçük tozlar daha kolay bir algılama sağlayan okuma degrade örnekleme aralığı uzatır ve zamansal çözünürlüğe azalır artar. Görmek bir örnek için Şekil 3A.
4. Yazılımını kullanarak kayıt başlatın. mikroelektrot her pozisyonda duraklar ve mV elektrik potansiyeli bilgisayarda kaydedilir. Sinyal stabilizasyon sağlayan, en az 2 dakika süreyle ölçümleri elde edilir. Kısa zaman atlamalı deneyler, bütün zaman elbette ilgi pozisyonunda rekor potansiyel varyasyonlar için.
5. Bir txt dosyası olarak verileri ayıklayın ve bir elektronik tablo dosyasına değerleri kopyalayın.
6. Kalibrasyon değerleri için olduğu gibi aynı şekilde mV değerlerine karşılık gelen iyon konsantrasyonu hesaplanır. Değeri çizilir.
   Not: Bir iyon akışı varsa, mikroelektrot iki konum (Şekil 3B) arasındaki iyon konsantrasyonu bir fark tespit eder.
7. (Adım 3.3.1) daha önce olduğu gibi difüzyon Fick'in yasasını kullanarak iyon akı hesaplayın.
8. Yeni bir örnek ölçümünden önce tampon ölçümü tekrarlayın ve her yeni için akı ölçüm ve hesaplama prosedürü tekrarlayınörneği.

6. İstatistiksel Analiz ve Veri Sunumu

1. Ve / veya karışık etkileri ²⁸ ile ANCOVA modelini kullanarak kontrol koşulu altında iyon akıları zaman konumunun bağımsız etkilerini test edin.
   Not: kovaryans analizi (ANCOVA) kategorik ve sürekli hem tedbirlerin bağımsız değişkenler olarak kullanılmasına izin düzenli ANOVA ve regresyon karıştırır genel lineer model. Buna ek olarak, bireysel ve nihai iç içe etkilerine göre tekrarlanan tedbirlerle uyarılan ilişkili hataların varlığında, karma etki modelleri hem sabit hem de rastgele etkilerin doğru tahminler modellemek için kullanılır.
2. Çoklu test ²⁸ için Bonferroni düzeltmesi ile grup düzeyleri arasında Student t-testi kullanılarak ikili karşılaştırmalar hesaplayın.
3. Kutudiyagramlar pozisyonu ve zamana göre iyon akı ölçümlerini özetlemek oluşturun. Açıklanan ikili Öğrenci t p değerleri içerir(Şekil 3D), yukarıda ve aşağıda p değerleri anlamlılık düzeyini göstermektedir: *: p <0.05; **: P <0.01; ***: P <0.001 ²⁹

Sonuçlar

Biz daha önce kalsiyum akını tek hücre ²⁴ yaralama sonra görünür olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, diğer iyon akıları tek hücre yaralama üzerine ortaya olup olmadığını sordu. Biz X'i kullanılan oosit, tek bir hücre yara iyileşmesi ^30-34 ve elektrofizyolojik kayıt ^24,35-39 için köklü bir model laevis. İlginçtir, potasyum iyonları X içinde daha konsantre olan laevis oosit (yaklaşık 110 mM) (MMR 1x: 1 mM) kullanılan h...

Tartışmalar

in vivo olarak, hücre dışı, iyon akıları başarılı ölçümü için en kritik adımlar şunlardır: gürültüsünün azaltılması, iyon seçici Mikroelektronlar ve referans elektrotunun doğru imalatı, ve örnek ve her iki elektrot arasında konumlandırılması.

Gürültüyü en aza indirmek için, kayıt sistemi, tercihen de topraklı bir metal tepesinde (titreşim izolasyon) tablosu ile topraklı (topraklı) Faraday kafesi olmalıdır. Buna ek olarak, mikroskop şasi d...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
IonAmp	BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA	none	amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
IonAmp32	BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA	none	software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Headstage pre-amplifier	BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA	INA116	BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
MicroStep Driver	BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA	none	three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Manual micropositioner	World Precision Instruments	Model KITE-R	Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Magnetic stand	World Precision Instruments	Model M10	Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Vibration isolation table	Newport Inc.	Model VW-3036-OPT-023040	Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90°, slotted faces	Newport Inc.	Model 360-90	Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table
Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel	Newport Inc.	460PD-X	none
Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel	Newport Inc.	460A-XY	none
Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament	World Precision Instruments	TW150-4	none
Electrode puller	Narishige	PC-10	none
Metal rack	Made in-house	none	Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel
Oven	QL	Model 10 Lab Oven	none
Silanization solution I	Sigma-Aldrich	85126	Hazardous, handle as recommended by provider
Glass Petri dish; Pyrex	Fisher Scientific	316060	none
Electrode/micropipette storage jar	World Precision Instruments	E215	none
Glass dessicator	Fisher Scientific	08-595E	Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight.
Plastic Pasteur pipette	Fisher Scientific	11597722	none
Bunsen burner	Fisher Scientific	S97329	none
Microscope slide	Sigma-Aldrich	S8902	none
Straight microelectrode holder	Warner Instruments	QSW-A15P	with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire
Straight microelectrode holder	World Precision Instruments	MEH3S	with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector
6 cm Petri dish	VWR	60872-306	none
Nitex mesh	Dynamic Aqua-Supply Ltd.	NTX750	none
Glue; Loctite epoxy	VWR	500043-451	Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing
Deionized water	Sigma-Aldrich	99053	none
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653	none
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P9333	none
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C1016	none
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266	none
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375	none
Sodium Hydroxyde	Sigma-Aldrich	S8045	none
Potassium Acetate	Sigma-Aldrich	P1190	none
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539	none