JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Abstract

תאים מבעלי חיים, צמחים ותאים בודדים מוקפים גדר נקראת קרום התא המפריד בין הציטופלסמה מבחוץ. שכבות תאים כגון epithelia גם יוצרות מחסום שמפריד בתוך מבחוץ או תאים שונים של יצורים רב-תאיים. תכונה מרכזית של חסמים אלה היא חלוקת ההפרש של יונים על פני קרום תא או שכבות תאים. שני נכסים לאפשר חלוקה זו: 1) קרומים וepithelia להציג חדירות סלקטיבית ליונים מסוימים; 2) יונים מועברים באמצעות משאבות פני קרום תא ותא שכבות. מאפיינים אלה ממלאים תפקידים חיוניים בשמירה על הפיסיולוגיה רקמה ולפעול כאיתות רמזים לאחר נזק, במהלך תיקון, או תחת מצב פתולוגי. Microelectrode התייחסות עצמי יון סלקטיבי מאפשר מדידות של נתיבים ספציפיים של יונים כמו סידן, אשלגן או נתרן ברמות תא ורקמה אחת. Microelectrode מכיל קוקטייל ionophore שהואסלקטיבי חדיר ליונים מסוימים. פתרון המילוי הפנימי מכיל ריכוז קבוצה של היון של עניין. הפוטנציאל החשמלי של microelectrode נקבע על ידי הריכוז מחוץ ליון. כיון הריכוז משתנה, הפוטנציאל של microelectrode משתנה כפונקציה של היומן של פעילות היון. כשעברתי הלוך ושוב ליד מקור או כיור של היון (כלומר במפל ריכוזים בשל שטף יון) את פוטנציאל microelectrode נע במשרעת פרופורציונלית לשטף יון / השיפוע. המגבר מגביר את אות microelectrode והתפוקה נרשמה במחשב. שטף היון אז יכול להיות מחושב על ידי החוק של Fick של דיפוזיה באמצעות תנודות אלקטרודה פוטנציאליות, הטיול של microelectrode, ופרמטרים נוספים כגון ניידות היון הספציפית. במאמר זה, אנו מתארים בפירוט את המתודולוגיה למדידה והנתיבים יון תאיים באמצעות microelectrode התייחסות עצמי יון סלקטיביd להציג כמה תוצאות נציג.

Introduction

כל התאים של בעלי החיים מוקפים בקרום bilayer שומנים שמפריד בין הציטופלסמה מהסביבה החיצונית. התא שומר על פוטנציאל הממברנה חשמל, שלילי בפנים, בתחבורה פעילה של יוני 1. פוטנציאל הממברנה הוא מקור אנרגיה אצור בו התא יכול לנצל להפעלת מכשירים מולקולריים שונים בקרום 2. יש נוירונים ותאים רגישים אחרים פוטנציאלי קרום גדולים. פתיחה מהירה של תעלות נתרן מתמוטטת הקרום פוטנציאלי (שלילת קוטביות) ומייצרת פוטנציאל הפעולה שמועבר לאורכו של נוירון 2. מלבד שינויים חשמליים מהירים אלה, רקמות ואיברים רבים ליצור ולשמור על פוטנציאל חשמלי לטווח ארוך משמעותי. לדוגמא, העור וepithelia קרני ליצור ולשמור על פוטנציאל טרנס-אפיתל וזרמים חשמליים תאיים על ידי שאיבה כיוונית של יונים (בעיקר נתרן כלורי ו) 3.

אוהל "> בעוד מדידות של זרם חשמלי תאי אנדוגני באמצעות הבדיקה הרוטטת 4-6 ומדידות של פוטנציאלי קרום או טרנס-אפיתל באמצעות מערכת microelectrode 7-10 לאפשר מדידה של הפרמטרים חשמליים של קרום תא ושכבות תאי אפיתל, שהם נותנים לא אינדיקציה למיני היון המעורב.

Microelectrodes עם ionophore סלקטיבית יכולה למדוד ריכוז יון ספציפי בפתרון. מילויים יון או שטף ניתן היו למדוד עם שתיים או יותר אלקטרודות בעמדות שונות. עם זאת, להיסחף המתח הפנימי של כל בדיקה יהיה שונה, גורם למדידות מדויקות או אפילו גילוי של שיפוע שלא היה נוכח. אלקטרודה אחת השתמשה במצב "התייחסות עצמית" לפיו הוא נע בתדירות נמוכה בין שתי נקודות פותרת בעיה זו. עכשיו שטף היון שניתן לראות על הרקע להיסחף אות איטית יחסית ויציב (ראה איור 3).

מערכת מדידת היון רגיש משתמשת microelectrodes התייחסות עצמית יון סלקטיבי כדי לזהות נתיבים תאיים קטנים של יונים קרובים לרקמות או תאים בודדים. המערכת מורכבת ממגבר שמעבד את האות מmicroelectrode ומנוע צעד מיקרו והנהג לשלוט בתנועה של microelectrode. Microelectrode יון סלקטיבי ואת האלקטרודה ההתייחסות שיסגור את המעגל מחוברים למגבר דרך headstage מראש מגבר (איור 1 א). תוכנת מחשב קובעת את הפרמטרים של תנועת microelectrode (תדירות, מרחק) וגם רושמת את התפוקה של המגבר. מנוע צעד שולט על תנועת microelectrode באמצעות micropositioner תלת-ממדי. תדירות נמוכה הרוטטת microelectrode יון סלקטיבי פותחה לראשונה בשנת 1990 למדידת שטף סידן ספציפי 11. כמו גם סידן, קוקטיילים ionophore מסחרי נגישים זמינים כעת לעשות MICRoelectrodes רגיש לנתרן, כלוריד, אשלגן, מימן, מגנזיום, ניטראט, אמוניום, פלואוריד, ליתיום או כספית.

בעיקרון, טכניקת microelectrode יון סלקטיבי התייחסות העצמית ממירה את הפעילות של יון ספציפי המומס בתמיסה לפוטנציאל חשמלי, הניתן למדידה על ידי מד מתח. קוקטייל ionophore הוא נוזל immiscible שלב (אורגני, lipophilic) עם תכונות החלפת יונים. Ionophore סלקטיבי קומפלקסים (נקשר) יונים ספציפיים הפיך ומעביר אותם בין התמיסה המימית הכלולות בmicroelectrode (אלקטרוליט) והתמיסה המימית שבי microelectrode הוא שקוע (1D איור). העברת יון זה מובילה לשיווי משקל אלקטרוכימיים ווריאציה של הפוטנציאל החשמלי בין microelectrode ואת האלקטרודה ההתייחסות נמדדת על ידי מד המתח. המתח הוא פרופורציונאלי ללוגריתם של פעילות היון הספציפית לפי דואר נרנסטquation מאפשר החישוב של ריכוז היון (איור 2 א 'וב').

נכון לעכשיו, כמה מערכות מאפשרות מדידה של שטף יון באמצעות מושג או עיקרון דומה. לדוגמא, טכניקת אלקטרודה סריקת יון סלקטיבי (סת) 12,13 או טכניקת microelectrode יון שטף הערכה (MIFE) שפותחה על ידי ניומן וShabala 14-16 הם זמינים מסחריים ושימוש נרחב על ידי קהילת המחקר כדי לקבוע יון ספציפי נתיבים המתרחשים בקרום תא ורקמה במגוון רחב של בעלי חיים, צמחים ודגמי תא חי בודדים. microelectrodes יון סלקטיבי כבר משמשת למדידת מימן, אשלגן וסידן על פני שטף שורשי צמח 17, שטף כלוריד בעורקי מוח חולדה 18 ובצינורות אבקה 19, שטף מימן בתאי רשתית להחליק 20, שטף סידן בעצמות עכבר 21, יון שונים נתיבים בפטריית העובש 22 ובrבקרנית 23, ובסופו שטף סידן במהלך פצע תא בודד ריפוי 12,24. ראה גם הסקירה לקבלת מידע מפורטת על microelectrodes התייחסות העצמית יון סלקטיבי 25 הבאה.

המאמר שלהלן מתאר בפירוט כיצד להכין ולבצע מדידה של נתיבי יון תאיים אנדוגני באמצעות טכניקת microelectrode יון סלקטיבי התייחסות העצמית ברמת התא הבודד.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. יון סלקטיבי עצמי התייחסות microelectrode הכנה

  1. הכנת microelectrode יון סלקטיבי
    1. חום למשוך ורוסיליקט נימי קירות דקים בלי נימה (קוטר חיצוני 1.5 מ"מ, 1.12 מ"מ קוטר פנימי) באמצעות חולץ microelectrode.
      הערה: זה נותן טיפים 3-4 מיקרומטר בקוטר. יש טיפים קטנים יותר התנגדות גבוהה יותר מה שהופך את microelectrodes רגישה יותר לרעש אלקטרוני וגם קשורה לתגובה איטית יותר לשינוי בריכוז יון. ניתן למצוא מידע שימושי במאמר שפורסם על ידי et al סמית. 26.
    2. Silanize אלקטרודות כדי להבהיר הידרופובי משטח הפנימי כדי לסייע שמירה של קוקטייל ionophore lipophilic. מניחים את microelectrodes בO מדף מתכת והחום / N בתנור ב> 100 ° C כדי לייבש אותם. המדף הוא לוחית מתכת עם חורים בקוטר 2 מ"מ קדח חלק מהדרך. הנח את האלקטרודות בחורים להטות כלפי מעלה עם 250 מיליליטר גרםכוס ילדה עליהם.
    3. בבוקר, מכבה את התנור ובעוד לובש כפפות מבודדים, להסיר את מדף המתכת עם אלקטרודות וכוס במקום בזהירות. סגור את דלת התנור כדי לשמור על החום.
    4. ללבוש כפפות לטקס או nitrile, חלוק מעבדה והגנה על העין. עם טפטפת פסטר מפלסטיק, במקום ירידה של פתרון אני silanization בבסיס כל אלקטרודה (לשמור את הכוס במקום; להשתמש בשפה לשפוך לגישת פיפטה). פתרון silanization מתאייד בצלחת החמה וsilanizes הפנימי של האלקטרודות. השתמש מנדף חולץ כימי לשלב הזה. הנח את המדף / הכוס / אלקטרודות בחזרה בתנור החם לכמה שעות כדי לאפשר לכל פתרון silanization נותר ללהתאדות.
      הערה: מטעמי בטיחות, לא מדליק את התנור על גב. מניחים על תווית המציינת את התנור זה לא חייב להיות מופעל כזה עשוי להכיל אדים מזיקים ודליקים.
    5. לאחר קירור, אחסון microelectrodes בInsi קנקן microelectrodeדה ייבוש זכוכית עם 400 גרם של יבוש. ניתן לאחסן microelectrodes כך במשך שבועות רבים.
      הערה: שיטת silanization חלופית מתוארת בet al סמית 26.
    6. חזרה למלא את microelectrode עם 50 עד 100 μl (באורך של כ 1 סנטימטר) של תמיסה המכילה 100 מ"מ של היון להימדד (ראה טבלה 1 ואיור 1). השתמש חום פיפטה חד פעמי פסטר מפלסטיק משך במבער בונזן לנימה דקה. יש לשטוף את פיפטה בDH 2 O לאחר מכן כדי למנוע חסימה.
      הערה: לחלופין, להתאים את ריכוז היון של הפתרון למלא את המשבצות כדי להתאים את הריכוז של יון בפתרון החיצוני 27.
    7. שים לב microelectrode תחת מיקרוסקופ לנתח כדי להבטיח היעדר בועות אוויר.
      1. אם בועות נמצאים ברז microelectrode קל עם ציפורן אצבע תוך החזקת האלקטרודה אנכית (טיפ למטה) ו / או לדחוף את הבועהזה את הקצה על ידי יישום בחזרה לחץ באמצעות מזרק שונה עם צינור סיליקון להחליף את המחט.
    8. טיפ-למלא את microelectrode עם 15 עד 20 NL (באורך של 30-50 מיקרומטר) של קוקטייל ionophore יון-ספציפי (ראה טבלה 1). מקום טיפה קטנה של קוקטייל ionophore על הקצה הקצר של שקופיות מיקרוסקופ. שים לב לקצה microelectrode תחת מיקרוסקופ לנתח ולהעביר אותו לכיוון שקופיות מיקרוסקופ עד קצה microelectrode נוגע קוקטייל ionophore רק כמחצית שניות. צייר את קוקטייל ionophore לmicroelectrode על ידי לחץ נימים.
      הערה: הימנע מטור של קוקטייל ionophore עוד זה מגדיל את ההתנגדות החשמלית של החללית שיכול לעשות את זה רגיש להפרעות אלקטרוניות (רעש) וגם מאט את זמן התגובה.
    9. הר microelectrode בבעל microelectrode ישר עם מחבר זהב 1 מ"מ זכר וחוט AgCl (Ag +) (איור 1).
    10. צרף את בעל microelectrode לבמה הראש רכובה על micropositioner מבוקר מחשב תלת-ממדי אלקטרוני (איור 1 א).
    11. הנח את קצה microelectrode במדידה מתאים פתרון לדוגמא נמדדת (מלח פיסיולוגי, מדיום התרבות, וכו ') כדי לאפשר microelectrode לייצב לשעה או שתיים, או אפילו לילה.
  2. הכנה של האלקטרודה ההתייחסות
    1. אלקטרודות התייחסות (איור 1 ג) הן אותם הנימים כאמור לעיל. חותך את הנימים עם עיפרון יהלומים לתוך 5 אורכי סנטימטר ואש מלוטשת-בכל קצה במשך 1-2 שניות בלהבה בונזן.
    2. מלא אלקטרודות אלה עם ~ 200 μl של פתרון 3 M של NaCl, CH 3 CO 2 K (אשלגן אצטט) או KCl עם agarose 2%. בחר את הפתרון בהתאם ליונים יש למדוד (האלקטרודה ההתייחסות לא צריכה להכיל היון הנמדד; ראה טבלה 1). מערבביםagarose והפתרון וחום לכמעט רותח במיקרוגל. מערבבים לפזר את agarose (הפתרון הולך ברור).
    3. צרף את האלקטרודה ההתייחסות לפיפטה פסטר מפלסטיק ולצייר את הפתרון החם לנימים.
    4. זרוק את האלקטרודה לתוך קר 3 M NaCl, CH 3 CO 2 K או פתרון KCl וחנות בפתרון זה 3 M בצינורות אטומים לפני השימוש. לבטל את כל האלקטרודות התייחסות עם בועות אוויר.
    5. הר האלקטרודה ההתייחסות בבעל microelectrode ישר גלולה עם AgCl (Ag +) (עם 3 M פתרון מלא מראש) בתוך וזהב 2 מ"מ מחבר זכר (איור 1 ג) ולצרף את האלקטרודה ובעל על מיקרו-positioner מדריך ל רכוב על דוכן מגנטי.

2. יון סלקטיבי עצמי התייחסות microelectrode כיול

  1. הכנת פתרונות כיול המכילים היון של עניין כמו בפתרון ההתייחסות; ראה טבלת 1 . תושבת הריכוז שהוא בפתרון המדגם יהיה ב( תקשורת למשל תרבות, מלח פיסיולוגי). כלומר, פתרון כיול אחד חייב לכלול ריכוז נמוך יותר של יון מאשר בפתרון המדידה, ואחד גבוה יותר.
    1. לדוגמא, השתמש מלוח המכיל 1 מ"מ של K +. סוגר ריכוז זה, לפזר אבקת KCl במים ללא יונים לריכוז של 10, 1 ו -0.1 מ"מ בדילולי סדרתי. השתמש בפתרוני כיול אלה. לחלופין, להשתמש בלפחות שני הפתרונות הללו.
  2. לטבול את microelectrode יון סלקטיבי ואלקטרודה ההתייחסות בכל פתרון כיול ולתת ערך המתח לייצב עבור 1 עד 3 דקות לפני הקלטת המתח המקביל באמצעות התוכנה ייעודית (ראה טבלה 1).
  3. כמו התוכנה שומרת את הנתונים (פלט מגבר) כקובץ txt, להעתיק את הנתונים לקובץ גיליון אלקטרוני. עלילה פלט microelectrode (mV) נגד הלוגריתם שלהריכוז טוחנת היון (איור 2 א).
  4. החל רגרסיה ליניארית ולחשב את השיפוע, ליירט נרנסט וערך R 2. קבל microelectrode אם מדרון נרנסט הוא 58 ± 11 mV / עשור ליונים חד ערכי ו± 29 11 mV / עשור ליונים דו ערכיים (לקטיונים, מדרון נרנסט הוא חיובי, לאניוני זה הוא שלילי). בנוסף, צריכה microelectrodes טובה מתאם חזק ליניארי (R 2> 0.9; איור 2).
    הערה: פלט mV של המגבר משמש כאן נותן mV קריאה עם רווח של פי עשרה. ערכים צריכים להיות מחולקים בפקטור של עשר.
  5. השתמש בנוסחת רגרסיה ליניארית כדי להמיר את פלט mV הגלם של microelectrode לריכוז יון בפועל (איור 2).

3. אישור של טכניקת microelectrode יון סלקטיבי

  1. הכנת מקור מלאכותי
    1. נימי מקור מלאכותיות זהות הנימים כלעיל. חום למשוך את הנימים באמצעות חולץ microelectrode כמו בשלב 1.1.1.
    2. למילוי נימים אלה עם 200 μl של פתרון 1 M של NaCl, KCl, CaCl 2 2 H 2 O או חיץ 4 pH. בחר פתרון המקור המלאכותי בהתאם ליונים יש למדוד (ראה טבלה 1).
      הערה: לחלופין, למשוך אלקטרודות בקוטר גדול יותר קצה (~ 20 מיקרומטר) וקצה-למלא עם אותו הפתרונות, אבל מכיל 0.5-1% agarose (agarose ימנע כל זרימת כמויות גדולות של פתרון).
    3. הר נימי המקור המלאכותית על micromanipulator ולטבול אותו בפתרון המשמש למדידת השטף של היון בדגימות. השאר את המקור המלאכותי בפתרון למשך 30 דקות לשעה 1 כדי לאפשר ייצוב של השיפוע.
  2. אימות של microelectrode יון סלקטיבי
    1. לטבול את microelectrode יון סלקטיבי על סנטימטר אחד מנימי המקור מלאכותיות בפתרון המשמשות לmeasuמחדש את השטף של יון על הדגימות ולסגור את המעגל עם האלקטרודה ההתייחסות כמו קודם. בואו ערך המתח לייצב עבור 1 עד 3 דקות לפני הקלטת המתח המקביל באמצעות התוכנה ייעודית עבור 1 עד 2 דקות. ערך זה מתאים לערך החיץ (בספרות המכונה גם כהתייחסות, רקע או ערך ריק).
    2. הזז את microelectrode יון סלקטיבי לכ -5 מיקרומטר מהמקור המלאכותי ולתת ערך המתח לייצב עבור 1 עד 3 דקות לפני הקלטת המתח המקביל באמצעות התוכנה ל1 עד 2 דקות.
    3. חזור על התהליך לעיל על ידי הצבת microelectrode סלקטיבית היון ב 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 ו1,280 מיקרומטר מנימי המקור המלאכותיים.
    4. לחלץ את הנתונים כקובץ txt ולהעתיק את הערכים לקובץ גיליון אלקטרוני.
  3. חשב את ריכוז היון המתאים לערכי mV באותו אופן כמו לערכי הכיול. העלילה הערך.
    לאטה: אם שטף יון הוא הווה, microelectrode מזהה הבדל בריכוז יון בין שתי העמדות (איור 3). אם המקור המלאכותי מכיל יותר יונים של המינים נמדדו מהפתרון, הריכוז צריך להיות קרוב יותר למקור מאשר רחוק, אימות היכולת של microelectrode יון סלקטיבי כדי לזהות בצורה נכונה את הכיוון של שטף יון (במקרה זה זרימה; לכיור מלאכותי, עם ריכוז יון ספציפי נמוך יותר מאשר מדידה בינונית, זה צריך להיות זרם).
    1. חשב את שטף היונים באמצעות חוק Fick של דיפוזיה: J = ג μ (DC / DX) כאשר c הוא ריכוז היון בפתרון (mol סנטימטר -3), μ הוא ניידות היון (N -1 שניות סנטימטר mol -1) , וdc ההבדל הריכוז מעל DX מרחק (סנטימטר) (איור 2 ג). נתונים שטף יון בדרך כלל מוצגים בpmol סנטימטר -2 s-1 סנטימטר או -2 שניות nmol -1.
      הערה:.. שיטה חלופית של חישוב שטף יון שתואר על ידי et al סמית 26 ניתן להשתמש. הבדלים עיקריים כוללים שימוש במקדם הדיפוזיה במקום ניידות היון וחיסור של שטף יון רקע (גם מתח להיסחף או גורם תיקון) מחושב ממדידה של שטף יון בתמיסת מלח ללא מדגם.
    2. עלילה הממוצעת של נתיבי היון של כל צעד נגד את המרחק מהמקור (איור 2 ד). מתרחק מהמקור, להתבונן ירידה המעריכית של ערך שטף אימות היכולת של microelectrode יון סלקטיבי לחוש גודל של נתיבי יון שונה.
    3. האם אימות המקור המלאכותית פעם אחת עבור כל יון ספציפי נועד להיות מוקלט על מנת לאמת את מדידות הכיוון ועצמה הנכונות שלה עם n אות לגדוליחס oise.
      הערה: מדידת שטף יון של החיץ ללא דגימות מציינת את רמת רקע או רעש. בדרך כלל, מדידת חיץ לא מראה תנודות ברורות של ריכוז היון שהוביל לשטף קטן מאוד המציג כיוונים משתנים.

4. הכנת מדידה קאמרית

הערה: לפני ניסויים, לשקול את המדגם כדי למדוד וכיצד המדגם הוא להיות מותקנת ומשותק למדידות microelectrode.

  1. לXenopus laevis מדידות ביצית לחתוך ריבוע 1 סנטימטר של 800 רשת ניילון מיקרומטר (רשת nitex) ולהדביק אותו לתוך צלחת פטרי פלסטיק (איור 1E).

5. יון שטף מדידה

  1. למדוד את ריכוז היון שבמאגר משמש לביצוע המדידות על המדגם באותו אופן כמו לפתרון הכיול. X. ביציות laevis דורשות רינגר של מארק השתנה (MMR). Dissolve NaCl, KCl, CaCl, MgCl וHEPES למים ללא יונים להגיע לריכוז סופי של (מ"מ): 100 NaCl, KCl 2, 2 CaCl, MgCl 1 ו -5 HEPES. התאם את ה- pH של המאגר כדי 7.5 באמצעות NaOH.
  2. מניחים את המדגם לתוך תא המדידה ולהביא את microelectrode יון סלקטיבי הקרוב למדגם (כ -10 מיקרומטר משם) באמצעות micropositioner להגדיר את המיקום הקרוב של microelectrode (איור 3 א).
  3. התחל את הטיול בתדר נמוך (0.3 הרץ) (100 מיקרומטר) של microelectrode בין העמדה הקרובה ועמדה מהמדגם (הרחוק) באמצעות התוכנה ייעודית. ודא שהתנועה של microelectrode היא בניצב למשטח של המדגם.
    הערה: הטיול של microelectrode ניתן להגדיר בתוכנה. טיול גדול מגדיל את השיפוע לקרוא מאפשר זיהוי קל יותר של נתיבים קטנים במהלך הזמן שהמדידה מאריך את מרווח הדגימה ומקטין את הרזולוציה של הזמן. ראה איור 3 א לדוגמא.
  4. התחל ההקלטה באמצעות התוכנה. Microelectrode עוצר בכל עמדה והפוטנציאל החשמלי בmV נרשם במחשב. להשיג מדידות לפחות 2 דקות, המאפשר ייצוב אות. לניסויי זמן לשגות קצרים, וריאציות פוטנציאל שיא בעמדה של עניין לכל מהלך הזמן.
  5. לחלץ את הנתונים כקובץ txt ולהעתיק את הערכים לקובץ גיליון אלקטרוני.
  6. חשב את ריכוז היון המתאים לערכי mV באותו אופן כמו לערכי הכיול. העלילה הערך.
    הערה: אם שטף יון הוא הווה, microelectrode מזהה הבדל בריכוז יון בין שתי העמדות (איור 3).
  7. חשב את שטף היונים באמצעות חוק Fick של דיפוזיה כמו קודם (שלב 3.3.1).
  8. חזור על מדידת החיץ לפני מדידת מדגם חדש ולחזור על התהליך של מדידה וחישוב שטף לכל חדשמדגם.

6. ניתוח סטטיסטי ונתונים מצגת

  1. בדוק את ההשפעות עצמאיות של העמדה ו / או של הזמן ובנתיבי יון בתנאי השליטה באמצעות מודל ANCOVA מעורבים השפעות 28.
    הערה: ניתוח של שונות משותפת (ANCOVA) הוא מודל ליניארי כללי שמתערבב ANOVA ורגרסיה קבועים כך שהוא מאפשר אמצעי שני קטגורי ומתמשכים לשמש כמשתנים בלתי תלויים. בנוסף, בנוכחות שגיאות מתואמות הנגרמות על ידי מדידות חוזרות להשפעות מקוננות פרט וסופו של דבר, מודלים מעורבות השפעות משמשים מודל הערכות מדויקות של שני אפקטים קבועים ואקראיים.
  2. לחשב השוואות pairwise באמצעות -test t סטודנטים בין רמות קבוצה עם תיקון Bonferroni לבדיקת מספר 28.
  3. צור boxplots לסכם מדידות שטף יון על פי מיקום וזמן. כוללים ערכי p מלא סטודנט pairwise תיארולעיל (איור 3D) ומצביעים על רמות משמעות של ערכי p כדלקמן: *: p <0.05; **: P <0.01; ***: P <0.001 29

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הראינו בעבר כי זרימת סידן מופיעה לאחר תא בודד נפצע 24. לפיכך, אנו נשאלים אם נתיבי יון אחרים להתרחש על פציעת תא בודדת. אנחנו השתמשנו בX. laevis ביצית, מודל מבוסס היטב לריפוי תא ותא בסופו 30-34 והקלטת אלקטרו 24,35-39. מעניין, יוני אשלגן הם יותר מרוכז בתוך X. lae...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

השלבים הקריטיים ביותר למדידת הצלחה של נתיבי יון תאיים in vivo הם: ההפחתה של הרעש, הייצור הנכון של האלקטרודה microelectrodes יון סלקטיבי וההתייחסות, והמיצוב של המדגם ושני אלקטרודות.

על מנת למזער את הרעש, מערכת ההקלטה צריכה להיות בכלוב פ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

This work was supported by National Science Foundation grant MCB-0951199, and in part by the NIH grant EY01910, California Institute of Regenerative Medicine grants RB1-01417 and by the Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) grant SFRH/BD/87256/2012.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
IonAmp  BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USAnoneamplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
IonAmp32  BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USAnonesoftware created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Headstage pre-amplifier BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USAINA116BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
MicroStep Driver BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USAnonethree MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Manual micropositioner  World Precision Instruments Model KITE-RSimilar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Magnetic stand   World Precision InstrumentsModel M10Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Vibration isolation table  Newport Inc.     Model VW-3036-OPT-023040Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90°, slotted facesNewport Inc.     Model 360-90Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table
Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X TravelNewport Inc.     460PD-Xnone
Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY TravelNewport Inc.460A-XYnone
Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament World Precision Instruments TW150-4none
Electrode puller Narishige PC-10none
Metal rackMade in-housenoneMetal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel
OvenQLModel 10 Lab Ovennone
Silanization solution I Sigma-Aldrich85126Hazardous, handle as recommended by provider 
Glass Petri dish; PyrexFisher Scientific316060none
Electrode/micropipette storage jarWorld Precision Instruments E215none
Glass dessicatorFisher Scientific08-595EContains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight.
Plastic Pasteur pipette Fisher Scientific11597722none
Bunsen burnerFisher ScientificS97329none
Microscope slideSigma-AldrichS8902none
Straight microelectrode holderWarner InstrumentsQSW-A15Pwith a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire
Straight microelectrode holder World Precision InstrumentsMEH3Swith a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector 
6 cm Petri dishVWR60872-306none
Nitex meshDynamic Aqua-Supply Ltd.NTX750none
Glue; Loctite epoxyVWR500043-451Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing
Deionized water Sigma-Aldrich99053none
Sodium ChlorideSigma-AldrichS7653none
Potassium ChlorideSigma-AldrichP9333none
Calcium ChlorideSigma-AldrichC1016none
Magnesium ChlorideSigma-AldrichM8266none
HepesSigma-AldrichH3375none
Sodium HydroxydeSigma-AldrichS8045none
Potassium AcetateSigma-AldrichP1190none
AgaroseSigma-AldrichA9539none

References

  1. Weber, W. M., Liebold, K. M., Clauss, W. Amiloride-sensitive Na+ conductance in native Xenopus oocytes. Biochimica et biophysica acta. 1239, 201-206 (1995).
  2. McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. Journal of cell science. 122, 4267-4276 (2009).
  3. Zhao, M. Electrical fields in wound healing-An overriding signal that directs cell migration. Seminars in cell & developmental biology. 20, 674-682 (2009).
  4. Jaffe, L. F., Nuccitelli, R. An ultrasensitive vibrating probe for measuring steady extracellular currents. The Journal of cell biology. 63, 614-628 (1974).
  5. Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe. Nature protocols. 2, 661-669 (2007).
  6. Reid, B., Zhao, M. Measurement of bioelectric current with a vibrating probe. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  7. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
  8. Moore, J. W. The patch clamp: single-channel recording. Science. 224, 50-51 (1984).
  9. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of visualized experiments. , (2008).
  10. McCaig, C. D., Robinson, K. R. The ontogeny of the transepidermal potential difference in frog embryos. Developmental biology. 90, 335-339 (1982).
  11. Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F. Detection of extracellular calcium gradients with a calcium-specific vibrating electrode. The Journal of cell biology. 110, 1565-1573 (1990).
  12. The use of the vibrating probe technique to study steady extracellular currents during pollen germination and tube growth. Fertilisation in Higher Plants: molecular and cytological aspects. Cai, G., Cresti, M., Moscatelli, A. , Springer-Verlag. 235-252 (1999).
  13. Kunkel, J. G., Xu, Y., Shipley, A. M., Feijó, J. A. The use of non-invasive ion-selective microelectrode techniques for the study of plant development. Plant Electrophysiology – Theory and Methods. (ed Volkov AG. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 109-137 (2006).
  14. Ordonez, N. M., Shabala, L., Gehring, C., Shabala, S. Noninvasive microelectrode ion flux estimation technique (MIFE) for the study of the regulation of root membrane transport by cyclic nucleotides. Methods in molecular biology. 1016, 95-106 (2013).
  15. Tegg, R. S., Melian, L., Wilson, C. R., Shabala, S. Plant cell growth and ion flux responses to the streptomycete phytotoxin thaxtomin A: calcium and hydrogen flux patterns revealed by the non-invasive MIFE technique. Plant & cell physiology. 46, 638-648 (2005).
  16. Newman, I. A. Ion transport in roots: measurement of fluxes using ion-selective microelectrodes to characterize transporter function. Plant, cell & environment. 24, 1-14 (2001).
  17. Kochian, L. V., Shaff, J. E., Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F., Lucas, W. J. Use of an extracellular, ion-selective, vibrating microelectrode system for the quantification of K(+), H (+), and Ca (2+) fluxes in maize roots and maize suspension cells. Planta. 188, 601-610 (1992).
  18. Doughty, J. M., Langton, P. D. Measurement of chloride flux associated with the myogenic response in rat cerebral arteries. The Journal of physiology. 534, 753-761 (2001).
  19. Messerli, M. A., Smith, P. J., Lewis, R. C., Robinson, K. R. Chloride fluxes in lily pollen tubes: a critical reevaluation. The Plant journal : for cell and molecular biology. 40, 799-812 (2004).
  20. Molina, A. J., et al. Neurotransmitter modulation of extracellular H+ fluxes from isolated retinal horizontal cells of the skate. The Journal of physiology. 560, 639-657 (2004).
  21. Marenzana, M., Shipley, A. M., Squitiero, P., Kunkel, J. G., Rubinacci, A. Bone as an ion exchange organ: evidence for instantaneous cell-dependent calcium efflux from bone not due to resorption. Bone. 37, 545-554 (2005).
  22. Lew, R. R. Ionic currents and ion fluxes in Neurospora crassa hyphae. Journal of experimental botany. 58, 3475-3481 (2007).
  23. Vieira, A. C., et al. Ionic components of electric current at rat corneal wounds. PloS one. 6, e17411(2011).
  24. Luxardi, G., Reid, B., Maillard, P., Zhao, M. Single cell wound generates electric current circuit and cell membrane potential variations that requires calcium influx. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 6, 662-672 (2014).
  25. Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. H. , (2007).
  26. Smith, P. J., Hammar, K., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Trimarchi, J. R. Self-referencing, non-invasive, ion selective electrode for single cell detection of trans-plasma membrane calcium flux. Microscopy research and technique. 46, 398-417 (1999).
  27. Messerli, M. A., Smith, P. J. Construction theory, and practical considerations for using self-referencing of Ca(2+)-selective microelectrodes for monitoring extracellular Ca(2+) gradients. Methods in cell biology. 99, 91-111 (2010).
  28. Chambers, J., Hastie, T., Pregibon, D. Ch. 48. Compstat. Momirović, K., Mildner, V. , Physica-Verlag HD. 317-321 (1990).
  29. Chambers, J. M., Cleveland, W. S., Kleiner, B., Tukey, P. A. Graphical methods for data analysis. , Wadsworth & Brooks/Cole. (1983).
  30. Burkel, B. M., Benink, H. A., Vaughan, E. M., von Dassow, G., Bement, W. M. A Rho GTPase signal treadmill backs a contractile array. Developmental cell. 23, 384-396 (2012).
  31. Bement, W. M., Mandato, C. A., Kirsch, M. N. Wound-induced assembly and closure of an actomyosin purse string in Xenopus oocytes. Current biology : CB. 9, 579-587 (1999).
  32. Mandato, C. A., Bement, W. M. Contraction and polymerization cooperate to assemble and close actomyosin rings around Xenopus oocyte wounds. The Journal of cell biology. 154, 785-797 (2001).
  33. Benink, H. A., Bement, W. M. Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds. The Journal of cell biology. 168, 429-439 (2005).
  34. Simon, C. M., Vaughan, E. M., Bement, W. M., Edelstein-Keshet, L. Pattern formation of Rho GTPases in single cell wound healing. Molecular biology of the cell. 24, 421-432 (2013).
  35. Petersen, C. C., Dupont, G. The initiation of a calcium signal in Xenopus oocytes. Cell calcium. 16, 391-403 (1994).
  36. Horisberger, J. D., Lemas, V., Kraehenbuhl, J. P., Rossier, B. C. Structure-function relationship of Na,K-ATPase. Annual review of physiology. 53, 565-584 (1991).
  37. Miledi, R. A calcium-dependent transient outward current in Xenopus laevis oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. London, England, , 491-497 (1982).
  38. Miledi, R., Parker, I. Chloride current induced by injection of calcium into Xenopus oocytes. The Journal of physiology. 357, 173-183 (1984).
  39. Parker, I., Miledi, R. A calcium-independent chloride current activated by hyperpolarization in Xenopus oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. 233, 191-199 (1988).
  40. Costa, P. F., Emilio, M. G., Fernandes, P. L., Ferreira, H. G., Ferreira, K. G. Determination of ionic permeability coefficients of the plasma membrane of Xenopus laevis oocytes under voltage clamp. The Journal of physiology. 413, 199-211 (1989).
  41. Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor protocols. 2012, 385-397 (2012).
  42. Porterfield, D. M. Measuring metabolism and biophysical flux in the tissue, cellular and sub-cellular domains: recent developments in self-referencing amperometry for physiological sensing. Biosensors. 22, 1186-1196 (2007).
  43. McLamore, E. S., et al. A self-referencing glutamate biosensor for measuring real time neuronal glutamate flux. Journal of neuroscience methods. 189, 14-22 (2010).
  44. Yin, M., et al. Highly sensitive and fast responsive fiber-optic modal interferometric pH sensor based on polyelectrolyte complex and polyelectrolyte self-assembled nanocoating. Analytical and bioanalytical chemistry. 399, 3623-3631 (2011).
  45. Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrode technology for non-invasive real-time measurement of biophysical flux and physiological sensing. The Analyst. 134, 2224-2232 (2009).
  46. McLamore, E. S., Jaroch, D., Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrodes for measuring spatially resolved, real-time metabolic oxygen flux in plant systems. Planta. 232, 1087-1099 (2010).
  47. McLamore, E. S., et al. A self referencing platinum nanoparticle decorated enzyme-based microbiosensor for real time measurement of physiological glucose transport. Biosensors & bioelectronics. 26, 2237-2245 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

99microelectrodeIn vivo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved