تصميم وبناء الاصطناعي خارج الخلية مصفوفة (aECM) والبروتينات من<em&gt; الإشريكية القولونية</em&gt; للبشرة هندسة الأنسجة

Summary

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

Abstract

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Introduction

For several decades, both synthetic and natural materials have been explored for use as scaffolds in tissue engineering^1,2. While synthetic materials such as polymers offer excellent structural integrity and tunable mechanical properties, they often have insufficient bioactivity to promote growth and infiltration of tissues. On the other hand, natural materials such as extracellular matrix (ECM) proteins have excellent biological activity, but have limitations such as batch-to-batch variability, rapid degradation and immunogenicity issues. As such, recombinant proteins are desired, since they can be designed to mimic only the desirable properties of native proteins^3,4.

Recombinant protein engineering has garnered widespread interests as a versatile platform for the design and production of novel artificial protein biopolymers. By controlling the genetic sequence, the functionalities of the artificial proteins can be tailored for a wide variety of applications^5,6. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins can be tailored to have multiple functionalities for applications in tissue engineering, regeneration and wound repair^2,7. More importantly, advances in cloning and purification technologies have increased scalability and reduced the cost of manufacturing recombinant proteins tremendously. It is possible to produce large quantities of recombinant proteins at low production costs which are economic for use in the clinic⁵.

Artificial extracellular matrix proteins have been developed for tissue engineering applications^8-11. For instance, Tirrell et al. designed a small diameter vascular graft using artificial proteins containing fibronectin CS5 sequence and elastin-like repeats (ELP-CS5). They showed that human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were able to adhere and grow on these materials¹². Others have also incorporated short bioactive sequences taken from fibronectin, collagen, laminin, fibrinogen and vitronectin as well as structural domains that mimic elastin, spider silk and collagens to create a variety of fusion proteins¹⁰. Bulk cross-linked films made out of elastin-based aECM proteins also exhibited mechanical properties similar to that of native elastin (elastic moduli ranges between 0.3-0.6 MPa)¹³. Subsequently, aECM proteins containing longer fibronectin fragments were also reported to accelerate wound healing in vitro due to increased integrin binding affinities⁸.

Recently, integrin-specific artificial ECM proteins have been developed by Tjin and coworkers¹⁴. Each aECM protein contains a bioactive cell-binding domain taken from ECM components of native human skin^2,7,15, such as laminin-5, collagen-IV and fibronectin. For example, the integrin α₃Β₁ has been shown to bind the PPFLMLLKGSTR sequence found in the laminin-5 alpha-3 chain globular domain 3 (LG3)^16,17. In their report, they showed that primary human skin epidermal keratinocytes preferentially engage different integrins for binding to each of the aECM proteins, depending on the type of cell binding domain present.

The aECM proteins discussed in the work by Tjin et al. contain flanking elastin-like domains {(VPGIG)₂VPGKG(VPGIG)₂}₈ that confer elasticity which mimics the mechanical properties of human skin. In addition, the incorporation of lysine residues within the elastin-like repeats also increases the overall protein solubility in aqueous solvents. In addition, the lysine residues also serve as crosslinking sites to facilitate the formation of crosslinked aECM films¹². Inclusion of elastin-like repeats within the aECM protein sequence allow the proteins to be readily purified via Inverse Transition Cycling (ITC)¹⁴. Elastins undergo a sharp and reversible phase transition at a specific temperature known as the lower critical solution temperature (LCST) or the inverse transition temperature (T_t)^18-20. Elastins and elastin-like repeats adopt hydrophilic random coil conformations below their LCST and become soluble in water, whereas above their LCST, elastins aggregate rapidly into micron-size particles. Such phase transitions are reversible and hence, can be exploited to allow elastin-based aECM proteins to be readily purified via the ITC technique²¹.

In this work, we report a generalized procedure to design, construct and purify artificial ECM proteins containing bioactive cell-binding domains, fused to elastin-like repeats. The process to design and clone the plasmids that encode for the amino acid sequences for the aECM proteins is described. The steps involved to purify the aECM proteins using ITC are outlined. Finally, the methods to determine the purity of the aECM proteins obtained using SDS-PAGE electrophoresis and Western Blotting are discussed.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. الاستنساخ المؤتلف البلازميدات ترميز لaECM البروتينات

1. تصميم تسلسل الأحماض الأمينية في المجال الوظيفي (على سبيل المثال، مجال ملزم الخلية ويكرر مثل الإيلاستين). تقييد مواقع تصميم المرافقة ينتهي من المجالات الوظيفية لتسهيل استخدام البرمجيات الحرة وفقا لتعليمات برمجيات الاستنساخ الفرعية (على سبيل المثال، http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/). هنا، حدد تقييد مواقع فريدة غير موجودة في المجال الوظيفي لحصر الهضم إلى المواقع المقصودة. اختيار تقييد مواقع التي تظهر في موقع استنساخ متعددة (MCS) من ناقلات المضيف (على سبيل المثال، pET22b (+)) لاستنساخ الفرعي.
2. عكس ترجمة تسلسل الأحماض الأمينية في تسلسل النوكليوتيدات باستخدام مواقع مجانية وفقا لتعليمات البرنامج. (على سبيل المثال، http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html). هي الأمثل ضمان الكودونات لE. تستضيف القولونية.
3. الجينات في المصالح يمكن أن يكون الشرائيةأليغنوكليوتيد] الذين تقطعت بهم السبل إد تجاريا واحدة كما (أي إذا كان أليغنوكليوتيد] <100 زوج قاعدي (بي بي)) وأداء الصلب الحمض النووي (راجع الخطوة 1.4) للحد من التكاليف. على خلاف ذلك، لجينات أكبر من 100 سنة مضت، يمكن شراؤها من خلال الشركات التجارية.
4. الصلب DNA من أليغنوكليوتيد]
   1. يصلب oligomers DNA للحصول على تسلسل الجين المطلوب. حل [أليغنوكليوتيد DNA في منطقة عازلة قليل وحدات الحمض النووي (10 ملي تريس: 2-الأمينية-2- (hydroxymethyl) -propan-1،3-ديول، ودرجة الحموضة 8.0 وتصفيتها) إلى تركيز النهائي من 1 ميكروغرام / ميكرولتر.
   2. إضافة 4 ميكرولتر من كل قليل وحدات إلى 32 ميكرولتر من العازلة الصلب DNA (10 ملي تريس، 100 ملي كلوريد الصوديوم و 100 نانومتر MgCl ₂₎ لتحقيق ما مجموعه 40 ميكرولتر خليط.
   3. غلي كوب من الماء باستخدام موقد وتزج الخليط لمدة 5 دقائق، 95 ° C. إزالة كوب ويبرد تدريجيا كامل أنشئت في مربع الستايروفوم O / N. تم مطوع وoligomers ونحن على استعداد لعملية الهضم.
5. إضافة أنزيمات التقييد المقابلة لهضم oligomers صلب (أي، ويشار إلى إدراج) وناقل مضيف (أي pET22b (+)) بشكل منفصل. استخدام الوصفة التالية (1-2 ميكروغرام من الحمض النووي، 2 ميكرولتر من كل انزيم التقييد، 5 ميكرولتر من 10X تقييد عازلة الانزيم، والمياه تصل إلى ما مجموعه مزيج 50 ميكرولتر) لمدة 3-4 ساعة عند 37 ° C.
   ملاحظة: pET22b (+) ناقلات بلازميد هو الأمبيسلين المقاومة للمضادات الحيوية، ويحتوي على-6X صاحب العلامة في محطة سي. و6X-صاحب العلامة الموجودة في pET22b (+) يسمح لنا لاستخدام الموسومة صاحب الأجسام المضادة للتعرف على البروتين المستهدف عبر النشاف الغربي في الخطوة 7.
6. إضافة 6X صبغ التحميل لكل خليط الهضم. تشغيل مخاليط الهضم بما في ذلك بشكل منفصل سلم DNA على 1،2٪ الاغاروز المواد الهلامية التي تحتوي على الحمض النووي DNA وصمة عار للأشعة فوق البنفسجية الفلورسنت لمدة 1 ساعة على 100 V. تصور 1.2٪ DNA agarose هلام مع إضاءة ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
7. شريحة هلام لاستخراج منتجات DNA هضم باستخدام أدوات تنقية جل التجاري. Elutالبريد باستخدام الحد الأدنى من حجم عمود لتحقيق تركيز الحمض النووي الحد الأدنى من 50-100 نانوغرام / ميكرولتر.
8. الجمع بين هذا الجين من الاهتمام بالتسلسل ligating إدراج DNA هضمها (مثل الإيلاستين يكرر أو خلية ملزم المجالات التي حصلت عليها الصلب DNA) في ناقلات البلازميد باستخدام T4 يغاز استخدام الوصفة التالية: (2 ميكرولتر من ناقلات، 1 ميكرولتر من T4 يغاز، 1.5 ميكرولتر من T4 العازلة الربط، س ميكرولتر من إدراج، 10.5-X ميكرولتر الماء لمجموع مزيج 15 ميكرولتر). احتضان الخليط ربط في RT لمدة 2 ساعة.
   ملاحظة: التركيز المولي ناقلات لادخال ينبغي تعديلها لتحسين كفاءة الربط. حجم إدراج صفها بأنها x في صفة يعتمد على تركيز الحمض النووي مزال من الخطوة 1.7.
9. ذوبان الجليد E. القولونية DH5α الخلايا المختصة كيميائيا (أو أي سلالة الاستنساخ) على الجليد. لوحات دافئ 2xYT أجار (الجدول 1) التي تحتوي على الأمبيسلين (25 ميكروغرام / مل) إلى 37 درجة مئوية.
10. تحويل الخلايا باستخدامالحرارة صدمة:
    1. قسامة 50 ميكرولتر من الخلايا المختصة في نظيفة، قبل المبردة أنابيب متناهية الصغر الطرد المركزي. ماصة 5 ميكرولتر (ما بين 100 إلى 100 خريج نانوغرام) من خليط ربط إلى الخلايا، pipetting بلطف صعودا وهبوطا لخلط. ترك الخليط على الجليد لمدة 20 دقيقة.
    2. تزج الأنبوب الصغير الطرد المركزي التي تحتوي على خليط الخلية في 42 ° C حمام الماء لمدة 2 دقيقة، وعاد إلى على الجليد لمدة 2 دقيقة. الزمنية مدة الغمر لتقليل الضرر الحرارة إلى الخلايا.
    3. إضافة 500 ميكرولتر من وسائل الاعلام SOC (الجدول 1) في أنبوب الطرد المركزي الصغيرة واحتضان عند 37 درجة مئوية مع الهز لمدة 1 ساعة.
    4. نشر 50 500 ميكرولتر من الخليط خلية / ربط على لوحة أجار 2xYT الذي تم قبل استعد لRT، التي تحتوي على الأمبيسلين (25 ميكروغرام / مل)، واحتضان لوحات رأسا على عقب عند 37 درجة CO / N (12-16 ساعة) .
11. في اليوم التالي، واختيار المستعمرات DNA من لوحة أجار باستخدام نصائح ماصة نظيفة. تنمو المستعمرات في 5 مل من 2YT وسائل الإعلام (الجدول 1) التي تحتوي على الأمبيسلين (25 ميكروغرام / مل) O / N عند 37 درجة CO / N (12-16 ساعة) مع اهتزاز (225 دورة في الدقيقة).
12. في اليوم التالي، واستخدام عدة البلازميد العزلة لاستخراج البلازميدات DNA لكل مستعمرة التقطت وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. أزل الحمض النووي مع 50 ميكرولتر من الماء.
13. إجراء اختبار هضم مع الانزيمات تقييد استخدام الوصفة التالية: (DNA 5 ميكرولتر 0.2 ميكرولتر من كل انزيم التقييد، 1 ميكرولتر 10X تقييد العازلة انزيم وأعلى حتى الماء لمجموع مزيج 10 ميكرولتر)، واحتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية للكشف عن المستعمرات التي تحتوي على الأرجح إدراج وتعمل على 1،2٪ هلام الاغاروز DNA كما في الخطوة 1.6.
    ملاحظة: عند الهضم، وربط الناجح يجب النتائج في شريطين، واحد لكل من النواقل وإدراج والتي تتوافق مع الوزن الجزيئي لكل منهما (الشكل 1).
14. إرسال المستعمرات المحتمل لتسلسل الحمض النووي باستخدام T7 المروج إلى الأمام والاشعال على التعاقب التجارية عكس.

معشوقة = "jove_title"> 2. التحول المؤتلف البلازميد إلى الجرثومي التعبير المضيف

1. من النتيجة التسلسل، حدد مستعمرة الذي تم ligated بنجاح واستخدام البلازميد الحمض النووي للتحول إلى E. المضيف التعبير القولونية.
2. ذوبان الجليد E. القولونية سلالة التعبير (BL21 (DE3) pLysS) على الجليد. وفي الوقت نفسه، لوحات أجار الحارة التي تحتوي على الأمبيسلين (25 ميكروغرام / مل)، والكلورامفينيكول (34 ميكروغرام / مل) إلى RT.
   ملاحظة: البلازميد pLysS موجودة في البكتيريا سلالة BL21 (DE3) pLysS يحتوي على الجينات المقاومة الكلورامفينيكول. يحتوي البلازميد pLysS على كاظمة الجينات T7 وهو ما يعبر عنه بشكل جوهري للحد من التعبير المتسرب من البروتين aECM. الكلورامفينيكول ضروري لتحديد للبكتيريا الخلايا التي تحتوي على pLysS خلال الثقافة.
3. كرر الخطوة 1.10 للحصول على تحويل E. خلايا القولونية التي هي على استعداد للتعبير عن البروتينات الاصطناعية. التفاف لوحات أجار في Parafilm وتخزين رأسا على عقب في 4 6؛ C لمدة تصل إلى واحد.

3. التعبير البكتيرية من البروتينات aECM

1. انظر الشكل 2، واختيار مستعمرة من لوحة أجار تحولت مع طرف ماصة وتطعيم إلى 10 مل من معقم رائع مرق (TB) وسائل الاعلام (الجدول 1) تحتوي على كل الأمبيسلين والمضادات الحيوية الكلورامفينيكول في أنبوب الاختبار. احتضان هذه الثقافة المبتدئين في 37 ° CO / N (12-16 ساعة) مع اهتزاز عند 225 دورة في الدقيقة.
2. نقل 10 مل من ثقافة المبتدئين إلى 1 L سائل الإعلام TB جديدة ومعقمة تستكمل مع نفس المضادات الحيوية في قارورة 3 L مخروطي. احتضان الثقافة في 37 ° C مع اهتزاز عند 225 دورة في الدقيقة لمدة 2-3 ساعة ومراعاة الكثافة البصرية للثقافة (OD ₆₀₀₎ وصلت 0،6-0،8 قبل pipetting 1 مل من ثقافة إلى كوفيت فارغة للقراءة. حفظ 1 مل من ثقافة قبل الاستقراء لتوصيف SDS-PAGE.
   1. لقياس OD ₆₀₀ من ثقافة الخلية، وإعداد 1 قنينة من وسائل الإعلام السل في كفيتلقياس فارغ. بشكل منفصل، ونقل 1 مل من ثقافة من قارورة الثقافة في كفيت جديدة فارغة. قياس الكثافة البصرية للثقافة استخدام الطيف ضد السيطرة فارغة في أحد الامتصاصية من 600 نانومتر.
   2. حفظ العينة (لاحقا تحليل SDS-PAGE) عن طريق نقل 1 مل من عينة الثقافة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل، الطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 2 دقيقة، وصب طاف.
3. حمل الثقافة مع الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) إلى تركيز النهائي من 1 ملم واحتضان عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 225 دورة في الدقيقة لساعة أخرى 4. حفظ 1 مل من ثقافة في نهاية الحث على 4 ساعات لتوصيف SDS-PAGE.
4. حصاد الخلايا عن طريق تحويل الثقافة إلى 1 L زجاجات الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. تجاهل طاف، تزن الكريات الخلايا و resuspend في TEN العازلة (1 M تريس، 0.01 M EDTA، 0.1 M كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة = 8.0) في 0.5 غرام / مل.

4. تحلل من الثقافات البكتيرية

1. تجميد زراعة الخلايا إعادة علقت في -80 درجة CO / N. ذوبان الجليد في زراعة الخلايا المجمدة في حمام مائي عند RT أو على الجليد لليز الخلايا. إضافة 10 ميكروغرام / مل ديوكسي ريبونيوكلياز I (الدناز I)، 10 ميكروغرام / مل ريبونوكلياز A (ريبونوكلياز I)، و 50 ميكروغرام / مل phenylmethylsulfonyl الفلورايد (PMSF)، في حين الذوبان والتجانس الحل مع التحريك البطيء.
2. بعد أن يتم إذابة جميع الخلايا معلق، وضبط حل لدرجة الحموضة 9.0 لزيادة ذوبانية البروتين في الماء ^12. إضافة 6 قطرة N هيدروكسيد الصوديوم الحكمة مع التحريك على الجليد لتحقيق الاتساق متجانسة. ليز بسبب عرقلة بالموجات فوق الصوتية لمدة 20 دقيقة على الجليد باستخدام 2 مم طرف شقة، 5 ثانية النبض.
3. أجهزة الطرد المركزي في حل الخلية في 12000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. طاف لنقل نظيفة، وزجاجة فارغة وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تنقية في وقت لاحق.
4. وفي الوقت نفسه، resuspend الكرية الخلية مرة أخرى مع TEN العازلة وإعادة التجميد في -80 ° C. إلىتحلل الخلية كاملة، تكرار تجميد / الذوبان وصوتنة العملية تصل إلى ثلاثة أضعاف. وفر 20 المحللة خلية ميكرولتر لتوصيف SDS-PAGE.

5. تنقية aECM البروتينات عن طريق معكوس الانتقال الدراجات

1. جمع المحللة الخلية من الخطوة 4.3، والشروع في تنقية البروتينات aECM باستخدام ITC، مماثلة لتلك المستخدمة لتنقية البروتينات القائم على الإيلاستين ^21. وسوف يتم دورات مع درجات حرارة مختلفة والتي هي 4 ° C (المشار إليها باسم "الباردة") و 37 ° C (المشار إليها باسم "الحارة") دورات على التوالي.
2. تقسيم المحللة الخلية إلى 50 مل زجاجات الطرد المركزي، وأجهزة الطرد المركزي في 40000 x ج لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية. وينبغي أن يكون ظهور بيليه الخلية البني الداكن وتبدو سيلان.
3. إزالة طاف بواسطة pipetting للحصول على فصل نظيف من بيليه. جمع طاف في زجاجات الطرد المركزي نظيفة وإضافة كلوريد الصوديوم إلى تركيز النهائي من 1 M (بحد أقصى 3 M). دافئالحل إلى 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة مع اهتزاز عند 225 دورة في الدقيقة.
   ملاحظة: سيتم إضافة كلوريد الصوديوم تؤدي إلى الانتقال من عنصر الإيلاستين من دون التسبب تجميع aECM. وطاف تتحول العكرة. إذا كان تركيز بروتين عالية بما فيه الكفاية، يمكن أن ينظر البروتين رغوي الأبيض على الجانبين من القمقم أجهزة الطرد المركزي.
4. أجهزة الطرد المركزي لطاف من الخطوة 5.3 في 40000 x ج لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية. صب طاف. سحق بيليه باستخدام ملعقة معدنية و resuspend بت بيليه في الماء المقطر تعقيمها المثلج (50 ملغ / مل) مع التحريك القوي O / N عند 4 درجة مئوية باستخدام شريط مغناطيسي واللوحة. بيليه يجب أن تتفكك.
5. كرر الخطوات من 5،2-5،4 لمدة ثلاث إلى خمس مرات أخرى للحصول على نقاء أعلى من البروتين.
6. بعد دورة النهائية للتنقية، تحلية الحل البروتين dialyzing ضد الماء المقطر عند 4 درجات مئوية. Dialyze حل البروتين ضد الماء لمدة 2-3 أيام مع التغييرات في الماء كل 4ساعة أو 8 ساعات لO / N. وفر 20 ميكرولتر من البروتين النقي لSDS-PAGE ويجفد بقية البروتين النقي وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.

6. توصيف aECM البروتينات عن طريق SDS-PAGE الكهربائي

1. إعداد 12٪ هلام SDS-PAGE (إذا كان الوزن الجزيئي كبير، استخدم 8٪ الهلام SDS-PAGE للانفصال أفضل). إضافة 2X العازلة تحميل SDS على كل عينة، تسخين العينات لمدة 10 دقيقة في 100 درجة مئوية وتشغيل عينات على هلام لمدة 1 ساعة على 100 V أو حتى سلم البروتين الموافق الوزن الجزيئي للبروتين aECM تصل إلى منتصف هلام.
2. استرداد جل من SDS-PAGE إعداد وإضافة Coomassie الأزرق اللامع وصمة عار (الجدول 2) مع وحدة لغمر هلام لمدة 1 ساعة في طبق بيتري. هلام شطف في حل destaining (الجدول 2) لمدة 5 دقائق على الكرسي الهزاز. تغيير الحل destaining، والاستمرار في يزيل اللون هلام مع هزاز حتى خلفية ركان جل يصبح واضحا. يجب أن تكون العصابات البروتين واضحة للعيان.
3. مقارنة بين موقف البروتين المستهدف ضد السلم البروتين لتحديد الوزن الجزيئي للبروتين الهدف.
4. لمزيد من تأكيد وجود البروتين المستهدف، نفذ النشاف الغربي كما في الخطوة 7.

7. توصيف aECM البروتينات عن طريق الغربية التنشيف

1. تشغيل العينات على 12٪ هلام SDS-PAGE كما في القسم 6 مع أي تلطيخ.
2. قطع غشاء النيتروسليلوز إلى حجم أكبر قليلا من هلام SDS-PAGE. قطع 4 قطع من ورق الترشيح لنفس الحجم.
3. الرطب قطعة واحدة من ورق الترشيح مع نقل الغربي العازلة (20٪ ت / ت الميثانول، 25 ملي تريس، 190 ملي جليكاين، ودرجة الحموضة 8.3)، ووضع جل SDS-PAGE على رأس ورقة الترشيح، يليه آخر قطعة من ورق الترشيح ، ثم غشاء النيتروسليلوز والنهائية الأخرى قطعتين من ورق الترشيح. هي غارقة ضمان كامل مجموعة المتابعة مع كافية عازلة نقل الغربي.
   ملاحظة: يجب أن لا يكون جل وغشاء على اتصال في هذه المرحلة من الوقت والبروتينات يمكن ربط الغشاء عند الاتصال.
4. نقل البروتينات على غشاء النيتروسليلوز من خلال وضع ورقتين مرشح في وحدة نقل شبه الجافة الغربية، تليها غشاء النيتروسليلوز، ووضع بعناية جل SDS-PAGE داخل وعلى الغشاء، ضع أخيرا اثنين من ورقة الترشيح الرطب الأخيرة على هلام SDS-PAGE. تشغيل نقل الغربية في 45 مللي أمبير، 30 دقيقة. إضافة العازلة إذا الجهد هو أعلى من 30 V.
   ملاحظة: يفضل وضع جل SDS-PAGE على الغشاء مع محاولة واحدة وتجنب تحويل هلام لا داعي له على الغشاء كما بروتينات يمكن ربط الغشاء عند الاتصال.
5. استرداد ومنع غشاء النيتروسليلوز مع عرقلة الحل (5٪ الحليب الخالي من الدسم في برنامج تلفزيوني 7.4 درجة الحموضة وتصفيتها مع ورقة فلتر) لمدة 2 ساعة على RT. التخلص من عازلة تمنع وإضافة PBS لشطف.
   ملاحظة: التغيير إلى قفازات جديدة لتجنب تلوث الغشاء مع المتواجد غير المرغوب فيهالإضافية.
6. احتضان الأساسي لمكافحة صاحب الأجسام المضادة مع التخفيف في برنامج تلفزيوني في 1: 1000 في RT لمدة 1 ساعة مع هزاز. إعداد الخليط في حجم الذي يمكن أن يغرق الغشاء كله، على سبيل المثال، مع نسبة التخفيف 1: 1000، إضافة 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة (تركيز المخزون: 1 ملغ / مل) إلى 999 ميكرولتر PBS ل1 مل مجموع الخليط.
7. شطف الغشاء مع 5 مل من PBST (PBS مع 0.1٪ Tween20).
8. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية مترافق إلى البيروكسيديز الحصان الفجل (HRP) مع التخفيف في برنامج تلفزيوني في 1: 5000 في RT لمدة 1 ساعة مع هزاز. إعداد الخليط في حجم الذي يمكن أن يغرق الغشاء كله، على سبيل المثال، مع نسبة التخفيف 1: 5000، إضافة 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة (تركيز المخزون: 1 ملغ / مل) إلى 4999 ميكرولتر PBS ل5 مل مجموع الخليط.
9. يغسل الغشاء مع 5 مل من PBST وكرر مرتين.
10. تطبيق الركيزة chemiluminescent إلى الغشاء مع حجم لتغطية الغشاء واحتضان باتباع الإرشادات لالركيزة المستخدمة.
    ملاحظة: حساسية الركيزة لكشف البروتين قد تختلف، ونحن نوصي ركيزة بأقصى قدر من الحساسية لإشارات منخفضة جدا في حالة زيادة تركيز الأجسام المضادة لا يزيد الإشارات.
11. التقاط إشارات chemiluminescent باستخدام جهاز تصوير كاميرا CCD القائمة. ضبط نسبة الأجسام المضادة تخفيف الابتدائية والثانوية إذا إشارات ضعيفة وغير محددة. احتضان يعد في عرقلة الحل إذا إشارة الخلفية عالية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

في تصميم البروتينات الانصهار التي تحتوي على تكرار مثل الإيلاستين، فمن المهم للحفاظ على المحتوى الإيلاستين العام، جزء كبير بما فيه الكفاية من البروتين الانصهار ^18. هذا هو التأكد من أن بناء البروتين الانصهار يحتفظ خصائص شبيهة الإيلاستين لها، من أجل استخدام ITC لت?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

المؤتلف هندسة البروتينات هي تقنية متعددة لخلق مواد جديدة البروتين باستخدام نهج من أسفل إلى أعلى. ويمكن تصميم المواد القائمة على البروتين لديهم وظائف متعددة، مصممة خصيصا وفقا لطلب من الفائدة. نتيجة لزيادة التقدم في تقنيات الاستنساخ والبروتين التعبير، فقد أصبح من ال?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pET22b (+)	Novagen	69744	T7 expression vectors with resistance to ampicillin
BL21(DE3)pLysS	Invitrogen	C6060-03	additional antibiotics - chloramphenicol
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG)	Gold Biotechnology	I2481C	1 M stock solution with autoclaved water, make fresh prior to induction.
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106	plasmid isolation kit
T4 ligase	New England Biolabs	M0202S
Ampicillin	Affymetrix	11259
Chloramphenicol	Affymetrix	23660
Zymoclean™ gel DNA recovery kit	Zymo Research	D4001
XL10-gold strain	Agilent Technologies	200315