Проектирование и строительство искусственного внеклеточного матрикса (aECM) Белки<em&gt; Кишечная палочка</em&gt; Для кожи тканевой инженерии

Резюме

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

Аннотация

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Введение

For several decades, both synthetic and natural materials have been explored for use as scaffolds in tissue engineering^1,2. While synthetic materials such as polymers offer excellent structural integrity and tunable mechanical properties, they often have insufficient bioactivity to promote growth and infiltration of tissues. On the other hand, natural materials such as extracellular matrix (ECM) proteins have excellent biological activity, but have limitations such as batch-to-batch variability, rapid degradation and immunogenicity issues. As such, recombinant proteins are desired, since they can be designed to mimic only the desirable properties of native proteins^3,4.

Recombinant protein engineering has garnered widespread interests as a versatile platform for the design and production of novel artificial protein biopolymers. By controlling the genetic sequence, the functionalities of the artificial proteins can be tailored for a wide variety of applications^5,6. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins can be tailored to have multiple functionalities for applications in tissue engineering, regeneration and wound repair^2,7. More importantly, advances in cloning and purification technologies have increased scalability and reduced the cost of manufacturing recombinant proteins tremendously. It is possible to produce large quantities of recombinant proteins at low production costs which are economic for use in the clinic⁵.

Artificial extracellular matrix proteins have been developed for tissue engineering applications^8-11. For instance, Tirrell et al. designed a small diameter vascular graft using artificial proteins containing fibronectin CS5 sequence and elastin-like repeats (ELP-CS5). They showed that human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were able to adhere and grow on these materials¹². Others have also incorporated short bioactive sequences taken from fibronectin, collagen, laminin, fibrinogen and vitronectin as well as structural domains that mimic elastin, spider silk and collagens to create a variety of fusion proteins¹⁰. Bulk cross-linked films made out of elastin-based aECM proteins also exhibited mechanical properties similar to that of native elastin (elastic moduli ranges between 0.3-0.6 MPa)¹³. Subsequently, aECM proteins containing longer fibronectin fragments were also reported to accelerate wound healing in vitro due to increased integrin binding affinities⁸.

Recently, integrin-specific artificial ECM proteins have been developed by Tjin and coworkers¹⁴. Each aECM protein contains a bioactive cell-binding domain taken from ECM components of native human skin^2,7,15, such as laminin-5, collagen-IV and fibronectin. For example, the integrin α₃Β₁ has been shown to bind the PPFLMLLKGSTR sequence found in the laminin-5 alpha-3 chain globular domain 3 (LG3)^16,17. In their report, they showed that primary human skin epidermal keratinocytes preferentially engage different integrins for binding to each of the aECM proteins, depending on the type of cell binding domain present.

The aECM proteins discussed in the work by Tjin et al. contain flanking elastin-like domains {(VPGIG)₂VPGKG(VPGIG)₂}₈ that confer elasticity which mimics the mechanical properties of human skin. In addition, the incorporation of lysine residues within the elastin-like repeats also increases the overall protein solubility in aqueous solvents. In addition, the lysine residues also serve as crosslinking sites to facilitate the formation of crosslinked aECM films¹². Inclusion of elastin-like repeats within the aECM protein sequence allow the proteins to be readily purified via Inverse Transition Cycling (ITC)¹⁴. Elastins undergo a sharp and reversible phase transition at a specific temperature known as the lower critical solution temperature (LCST) or the inverse transition temperature (T_t)^18-20. Elastins and elastin-like repeats adopt hydrophilic random coil conformations below their LCST and become soluble in water, whereas above their LCST, elastins aggregate rapidly into micron-size particles. Such phase transitions are reversible and hence, can be exploited to allow elastin-based aECM proteins to be readily purified via the ITC technique²¹.

In this work, we report a generalized procedure to design, construct and purify artificial ECM proteins containing bioactive cell-binding domains, fused to elastin-like repeats. The process to design and clone the plasmids that encode for the amino acid sequences for the aECM proteins is described. The steps involved to purify the aECM proteins using ITC are outlined. Finally, the methods to determine the purity of the aECM proteins obtained using SDS-PAGE electrophoresis and Western Blotting are discussed.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Клонирование рекомбинантных плазмид, кодирующих белки aECM

1. Дизайн аминокислотную последовательность функционального домена (например, клеток-связывающий домен и эластин-подобных повторов). Ограничение Дизайн сайтов фланговые концы функциональных областей, чтобы облегчить к югу от клонирования с помощью бесплатного программного обеспечения в соответствии с инструкциями программного обеспечения (например, http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/). Здесь выбирать уникальные сайты рестрикции, которых нет в функциональном домене ограничить пищеварение, предназначенных для сайтов. Выберите сайты рестрикции, которые появляются в сайт множественного клонирования (MCS) принимающей вектора (например, pET22b (+)) к югу от клонирования.
2. Обратный перевод последовательность аминокислот в последовательности нуклеотидов с использованием бесплатные сайты в соответствии с инструкциями программного обеспечения. (Например, http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html). Обеспечить кодоны оптимизированы для E. палочки хозяева.
3. Джин интерес может быть контрактаред коммерчески как одноцепочечные олигонуклеотиды (т.е., если олигонуклеотиды <100 пар оснований (п.о.)) и выполнить отжиг ДНК (см шаг 1,4), чтобы уменьшить стоимость. В противном случае, для генов больше, чем 100 б.п., они могут быть приобретены через коммерческие компании.
4. ДНК отжига олигонуклеотидов
   1. Отжиг олигомеры ДНК с получением желаемого последовательность гена. Растворите ДНК-олигонуклеотидов в буфере олигомера ДНК (10 мМ Трис-2-амино-2- (гидроксиметил) пропан-1,3-диол, рН 8,0, фильтруют) до конечной концентрации 1 мкг / мкл.
   2. Добавить 4 мкл каждого олигомера с 32 мкл буфера для отжига ДНК (10 мМ Трис, 100 мМ NaCl и 100 нм MgCl ₂₎ для достижения общей 40 мкл смеси.
   3. Отварить стакан воды, используя конфорку и погрузиться смесь в течение 5 мин, 95 ° С. Снимите стакан и постепенно охладить весь набор в пенопластовый ящик O / N. Олигомеры были отжигают и готовы для пищеварения.
5. Добавить соответствующие ферменты рестрикции, чтобы переварить Отожженном олигомеры (т.е., называют вставкой) и хост-вектор (т.е., pET22b (+)) отдельно. Используйте следующий рецепт (1-2 мкг ДНК, 2 мкл каждого фермента рестрикции, 5 мкл 10x фермента рестрикции буфера, и вода до 50 мкл общего смеси) для 3-4 ч при 37 ° С.
   Примечание: pET22b (+) плазмидный вектор является ампициллина устойчивыми к антибиотикам, и содержит 6x-His метку в С-конце. 6x-тег Его присутствует в pET22b (+) позволяет использовать его с метками антител для выявления белка-мишени с помощью вестерн-блоттинга в шаге 7.
6. Добавить 6x красителем каждой обрабатываемой смеси. Запуск переваривания смеси отдельно в том числе лестницы ДНК на 1,2% агарозном геле, содержащем ДНК УФ-флуоресцентным красителем ДНК в течение 1 ч при 100 В. визуализировать 1,2% агарозном геле ДНК с УФ осветитель.
7. Нарежьте гель для извлечения переваривается продукты ДНК, используя коммерческий гель наборы очистки. Elutе с использованием минимального объема для столбца для достижения минимальной концентрации ДНК 50-100 нг / мкл.
8. Смешайте интерес ген последовательно путем лигирования вставки расщепленной ДНК (т.е., эластин или клеточные повторы связывающие домены, полученные путем отжига ДНК) в плазмидный вектор с использованием лигазы Т4 с использованием следующей рецепт: (2 мкл вектора, 1 мкл Т4-лигазы, 1,5 мкл буфера для лигирования Т4, X мкл вставки, 10,5 х мкл воды в течение всего 15 мкл смеси). Инкубируйте лигирования смеси при комнатной температуре в течение 2 ч.
   Примечание: молярная концентрация вектора вставки должны быть изменены, чтобы оптимизировать эффективность лигирования. Объем вставки описывается как х в рецепте зависит от концентрации элюированного ДНК из стадии 1.7.
9. Оттепель Е. палочка DH5 & химически компетентные клетки (или любой клонирование деформации) на льду. Теплый агаром 2xYT (Таблица 1), содержащей ампициллин (25 мкг / мл) до 37 ° С.
10. Трансформации клеток, используятеплового шока:
    1. Аликвоты 50 мкл компетентных клеток в чистую, предварительно охлажденной микро-центрифужные пробирки. Пипетка 5 мкл (от 100 пг до 100 нг) смеси лигировани в клетки, пипетки осторожно вверх и вниз, чтобы перемешать. Оставьте смесь на льду в течение 20 мин.
    2. Опустить микро-центрифужной пробирки, содержащей смесь клеток в водяной бане при 42 ° С в течение 2 мин и возвращается на льду в течение 2 мин. Время продолжительности погружения, чтобы минимизировать ущерб тепла в клетках.
    3. Добавить 500 мкл SOC информации (таблица 1) в микро-центрифужную пробирку и инкубируют при 37 ° С при встряхивании в течение 1 ч.
    4. Распространение 50 500 мкл клеток / лигирования смеси на чашку с агаром 2xYT, который был предварительно нагревают до комнатной температуры, содержащей ампициллин (25 мкг / мл) и инкубируют пластины вверх-вниз при температуре 37 ° CO / N (12-16 ч) ,
11. На следующий день, забрать колонии ДНК из агар пластины с использованием чистых наконечников. Выращивают колонии в 5 мл 2 х УТ среды (табл1), содержащей ампициллин (25 мкг / мл) O / N при 37 ° CO / N (12-16 ч) при встряхивании (225 оборотов в минуту).
12. На следующий день использовать набор для выделения плазмидной для извлечения плазмиды ДНК каждой колонии выбрал в соответствии с протоколом производителя. Элюции ДНК с 50 мкл воды.
13. Выполнение испытаний переварить с помощью ферментов рестрикции следующий рецепт: (5 мкл ДНК, 0,2 мкл каждого фермента рестрикции, 1 мкл 10х буфера ограничение фермента и долить воды на общую 10 мкл смеси), инкубируют в течение 2 ч при 37 ° С для экрана для колоний, которые, вероятно, содержат вставку и работать на 1.2% агарозном геле ДНК, как в шаге 1.6.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При пищеварения, успешно перевязки должны Результаты в двух диапазонах, по одному для вектора и вставки, которые соответствуют их соответствующей молекулярной массой (рис 1).
14. Отправить вероятные колонии для секвенирования ДНК с использованием Т7 промотор прямого и обратного праймеров для коммерческих секвенсоров.

2. Трансформация рекомбинантной плазмиды в бактериальной экспрессии хозяина

1. Из результата секвенирования, выберите колонию, которая была успешно лигированный и использовать плазмиды ДНК для трансформации в E. палочка хозяин экспрессии.
2. Оттепель Е. Штамм выражение (BL21 (DE3) pLysS) на льду. Между тем, теплые агаром, содержащих ампициллин (25 мкг / мл) и хлорамфеникол (34 мкг / мл) до комнатной температуры.
   Примечание: pLysS плазмиду присутствуют в бактерий штамма BL21 (DE3) pLysS содержит ген устойчивости к хлорамфениколу. PLysS плазмида содержит ген репрессора Т7, которые конститутивно экспрессируется на ограничение вытекающей экспрессию белка aECM. Хлорамфеникол необходимо выбрать для клеток бактерий, который содержит pLysS во культуры.
3. Повторите шаг 1.10, чтобы получить превращается Е. палочки клетки, которые готовы высказать искусственные белки. Оберните агаром в парафильмом и хранить в перевернутом в 4 6 С в течение до одного месяца.

3. Бактериальные Выражение aECM белков

1. На рисунке 2, выбрать колонию из трансформированной агаром с кончика пипетки и инокуляции в 10 мл стерильной Terrific Broth (ТБ) сред (таблица 1), содержащий как ампициллин и хлорамфеникол антибиотики в пробирке. Выдержите эту закваски на 37 ° CO / N (12-16 ч) при встряхивании на 225 оборотов в минуту.
2. Передача 10 мл стартовой культуры в 1 л свежей и стерильных средах ТБ с добавлением тех же антибиотиков в колбу Эрленмейера 3 л. Инкубируйте культуру при 37 ° С при встряхивании при 225 оборотах в минуту в течение 2-3 ч и наблюдать оптической плотности культуры (OD ₆₀₀₎ достиг 0,6-0,8 с помощью пипетки 1 мл культуры в пустую кювету для чтения. Сохранить 1 мл культуры перед индукцией по SDS-PAGE характеристики.
   1. Для измерения OD ₆₀₀ клеточной культуры, подготовить 1 флакон СМИ туберкулезом в кюветедля пустой измерения. Отдельно передачи 1 мл культуры из культуральной колбы в новую пустую кювету. Измерение оптической плотности культуры с использованием спектрофотометра по отношению к пустой контроль при поглощении 600 нм.
   2. Сохранить образец (для последующего анализа SDS-PAGE) путем переноса 1 мл образца культуры в 1,5 мл микроцентрифужных трубки, центрифуге при 12000 х г в течение 2 мин, и декантируют супернатант.
3. Индуцируют культуру изопропиловым β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) до конечной концентрации 1 мМ и инкубируют при 37 ° С при встряхивании при 225 оборотах в минуту в течение еще 4 ч. Сохранить 1 мл культуры в конце индукции в течение 4 ч SDS-PAGE характеристики.
4. Сбора клеток путем переноса культуры до 1 л бутылок и центрифуги центрифуге при 12000 х г в течение 30 мин при 4 ° С. Жидкость над осадком сливают, вес ячейки гранул и ресуспендируют в TEN буфера (1 М Трис, 0,01 М ЭДТА, 0,1 М NaCl, рН = 8,0) при 0,5 г / мл.

4. Лизис бактериальных культур

1. Замораживание ресуспендировали культуру клеток при -80 ° CO / N. Разморозить замороженную культуру клеток в водяной бане при комнатной температуре или на льду, чтобы лизировать клетки. Добавить 10 мкг / мл Дезоксирибонуклеаза I (ДНКазы I), 10 мкг / мл рибонуклеазы А (РНКазы I), и 50 мкг / мл фенилметилсульфонилфторида (PMSF) в то время оттаивания и гомогенизации раствора при медленном перемешивании.
2. После того как все ресуспендировали Клетки оттаивают, регулировать рН раствора до 9,0, чтобы увеличить растворимость белка в воде ^12. Добавить 6 N NaOH по каплям при перемешивании на льду, чтобы достичь однородной консистенции. Lyse ультразвуковой нарушения в течение 20 мин на льду с использованием диаметром 2 мм плоский наконечник, 5 сек импульс.
3. Центрифуга клеток раствора при 12000 х г в течение 30 мин при 4 ° С. Передача супернатант на чистую, пустую бутылку и хранят при температуре 4 ° С для очистки позже.
4. Между тем, снова ресуспендируют осадок клеток с TEN буфера и повторного замораживания при -80 ° С. ВПолный лизис клеток, повторите замораживания / оттаивания и ультразвуком процесс до трех раз. Сэкономьте 20 мкл лизата клеток для SDS-PAGE характеристики.

5. Очистка aECM белков, используя обратный переход Велоспорт

1. Подборка клеточного лизата из стадии 4.3, и приступить к очистке белков aECM используя МТЦ, аналогичный тому, который используется для очистки эластина основе белков ^21. Циклы будет сделано с разных температурах, которые 4 ° С (упоминается как "холодный") и 37 ° C (именуемые "теплых") циклов соответственно.
2. Разделение клеточного лизата в 50 мл центрифужные флаконы и центрифугируют при 40000 х г в течение 2 ч при 4 ° С. Появление осадка клеток должны быть темно-коричневого цвета и выглядеть насморк.
3. Удалить супернатант с помощью пипетки, чтобы получить четкое разделение от осадка. Собирают супернатант в чистые бутылки центрифуги и добавить NaCl до конечной концентрации 1 M (максимум 3 м). Теплыйраствора до 37 ° С в течение 2 ч при встряхивании при 225 оборотах в минуту.
   Примечание: Добавление NaCl вызовет переход эластина компонента, вызывающего агрегирование aECM. Супернатант станет мутным. Если концентрация белка достаточно высоко, белый пенистый белок можно увидеть по бокам бутылки центрифуги.
4. Центрифуга супернатант из шага 5.3 при 40000 х г в течение 2 ч при 37 ° С. Декантировать супернатант. Измельчите таблетку с помощью металлического шпателя и ресуспендируют осадок биты в ледяной автоклавного дистиллированной воде (50 мг / мл) при энергичном перемешивании O / N при 4 ° С с использованием магнитной мешалкой и пластину. Осадок должен быть полностью растворен.
5. Повторите этапы 5,2 до 5,4 в течение еще трех до пяти раз, чтобы получить более высокую чистоту белка.
6. После последнего цикла очистки, обессоливания раствора белка диализом его против дистиллированной воды при 4 ° С. Диализировать белкового раствора от воды в течение 2-3 дней с изменениями в воде каждый 4ч или 8 ч в течение O / N. Сохранить 20 мкл очищенного белка на SDS-PAGE и лиофилизации остаток очищенного белка и хранить при температуре -80 ° С до дальнейшего использования.

6. Характеристика aECM белков, используя SDS-PAGE Электрофорез

1. Приготовьте 12% геля ДСН-ПААГ (если молекулярная масса велика, используют 8% ПААГ с ДСН для лучшего разделения). Добавить 2x SDS загрузки буфера для каждого образца, нагрева образцов в течение 10 мин при 100 ° С и запустить образцы на геле в течение 1 ч при 100 V или пока белок лестницы, соответствующих молекулярной массе белка aECM не достигнет середины гель.
2. Получение геля с ДСН-ПААГ, созданной и добавить кумасси бриллиантовый синий краситель (таблица 2) с объемом, чтобы погрузить гель в течение 1 часа в чашке Петри. Промыть гель в растворе Обесцвечивание (таблица 2) в течение 5 мин на качалке. Изменение Обесцвечивание раствора и продолжают destain гель с не-качалка до фоне тон гель становится ясно. Белковые полосы должны быть четко видны.
3. Сравнение позиции целевого белка против белка лестницы, чтобы определить молекулярную массу белка-мишени.
4. Чтобы дополнительно подтвердить наличие целевого белка, вестерн-блоттинга выполнения, как и в шаге 7.

7. Характеристика aECM белков, используя Вестерн-блоттинга

1. Запуск образцов на 12% SDS-PAGE геля, в разделе 6, без окрашивания.
2. Сокращение нитроцеллюлозную мембрану с размером, слегка превышающим геля ДСН-ПААГ. Вырезать 4 куска фильтровальной бумаги того же размера.
3. Влажные один кусок фильтровальной бумаги с западного переноса буфера (20% об / об метанол, 25 мМ Трис, 190 мМ глицина, рН 8,3), поместить гель SDS-PAGE на верхней части фильтровальной бумаги, а затем еще один кусок фильтровальной бумаги , то нитроцеллюлозные мембраны, а окончательный другие два куска фильтровальной бумаги. Убедитесь, вся настройка погружен с достаточной западной буфера передачи.
   Примечание: гель и мембрана не должна находиться в контакте в данный момент времени, как белки могут связываться с мембраной при контакте.
4. Передача белки на нитроцеллюлозную мембрану путем размещения двух фильтровальную бумагу в западной полусухого устройства передачи, после чего нитроцеллюлозной мембране, и тщательно поместить гель SDS-PAGE в пределах и на мембране, наконец, место два последних влажную фильтровальную бумагу на SDS-PAGE гель. Запустите западный перенос на 45 мА, 30 мин. Добавить буфер, если напряжение выше 30 В.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно размещать гель SDS-PAGE на мембране с одной попытки и избежать перехода гель излишне на мембране, как белки могут связываться с мембраной при контакте.
5. Получение и блокировать нитроцеллюлозную мембрану с блокирующем растворе (5% обезжиренное молоко в PBS, рН 7,4, фильтруют через фильтровальную бумагу) в течение 2 ч при комнатной температуре. Утилизировать блокирующий буфер и добавьте PBS полоскать.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Переход на новые перчатки, чтобы избежать загрязнения мембраны с нежелательной защдюймы
6. Выдержите основной анти-антитела с Его разведения в PBS 1: 1000 при комнатной температуре в течение 1 часа с качалки. Приготовить смесь в объеме, который может погрузить весь мембрану, например, с коэффициент разбавления 1: 1000, добавить 1 мкл антител (концентрация наличии: 1 мг / мл) в 999 мкл PBS в течение 1 мл общей смеси.
7. Промыть мембрану с 5 мл PBST (PBS с 0,1% Tween 20).
8. Инкубируйте с вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP) с разбавлением в PBS в соотношении 1: 5000 при комнатной температуре в течение 1 ч с качалки. Приготовить смесь в объеме, который может погрузить весь мембрану, например, с коэффициент разбавления 1: 5000, добавить 1 мкл антител (концентрация наличии: 1 мг / мл) в 4999 мкл PBS в течение 5 мл общей смеси.
9. Промыть мембрану 5 мл PBST и повторить два раза.
10. Применение хемилюминесцентного субстрата с мембраной с объемом, чтобы покрыть мембрану и инкубируют в соответствии с инструкциями для используемого субстрата.
    Примечание: чувствительности субстрата к обнаружению белка может изменяться, мы рекомендуем подложку с максимальной чувствительности при очень низких сигналов в случае повышения концентрации антител не приводит к увеличению сигналы.
11. Захват хемилюминесцентные сигналов с использованием тепловизора на основе ПЗС-камеры. Отрегулируйте соотношение первичного и вторичного разбавления антитела, если сигналы слабы и неспецифичны. Выдержите больше в блокировании решения, если сигнал фона высока.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

При проектировании слитые белки, содержащие эластин, как повторы, важно поддерживать общее содержание эластина, достаточно большую долю слитого белка ^18. Это делается для того, что слитый белок конструкция сохраняет свои эластина, как характеристики, чтобы использовать для очист?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Рекомбинантный белок инженерных универсальный метод для создания новых белковых материалов с использованием восходящего подхода. Материалы на основе белка могут быть разработаны, чтобы иметь несколько функций, с учетом существующих в применении интерес. В связи с увеличением продви...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
pET22b (+)	Novagen	69744	T7 expression vectors with resistance to ampicillin
BL21(DE3)pLysS	Invitrogen	C6060-03	additional antibiotics - chloramphenicol
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG)	Gold Biotechnology	I2481C	1 M stock solution with autoclaved water, make fresh prior to induction.
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106	plasmid isolation kit
T4 ligase	New England Biolabs	M0202S
Ampicillin	Affymetrix	11259
Chloramphenicol	Affymetrix	23660
Zymoclean™ gel DNA recovery kit	Zymo Research	D4001
XL10-gold strain	Agilent Technologies	200315