Diseño y Construcción de Artificial matriz extracelular (AECM) Las proteínas de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Para la piel Ingeniería de Tejidos

Resumen

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

Resumen

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Introducción

For several decades, both synthetic and natural materials have been explored for use as scaffolds in tissue engineering^1,2. While synthetic materials such as polymers offer excellent structural integrity and tunable mechanical properties, they often have insufficient bioactivity to promote growth and infiltration of tissues. On the other hand, natural materials such as extracellular matrix (ECM) proteins have excellent biological activity, but have limitations such as batch-to-batch variability, rapid degradation and immunogenicity issues. As such, recombinant proteins are desired, since they can be designed to mimic only the desirable properties of native proteins^3,4.

Recombinant protein engineering has garnered widespread interests as a versatile platform for the design and production of novel artificial protein biopolymers. By controlling the genetic sequence, the functionalities of the artificial proteins can be tailored for a wide variety of applications^5,6. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins can be tailored to have multiple functionalities for applications in tissue engineering, regeneration and wound repair^2,7. More importantly, advances in cloning and purification technologies have increased scalability and reduced the cost of manufacturing recombinant proteins tremendously. It is possible to produce large quantities of recombinant proteins at low production costs which are economic for use in the clinic⁵.

Artificial extracellular matrix proteins have been developed for tissue engineering applications^8-11. For instance, Tirrell et al. designed a small diameter vascular graft using artificial proteins containing fibronectin CS5 sequence and elastin-like repeats (ELP-CS5). They showed that human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were able to adhere and grow on these materials¹². Others have also incorporated short bioactive sequences taken from fibronectin, collagen, laminin, fibrinogen and vitronectin as well as structural domains that mimic elastin, spider silk and collagens to create a variety of fusion proteins¹⁰. Bulk cross-linked films made out of elastin-based aECM proteins also exhibited mechanical properties similar to that of native elastin (elastic moduli ranges between 0.3-0.6 MPa)¹³. Subsequently, aECM proteins containing longer fibronectin fragments were also reported to accelerate wound healing in vitro due to increased integrin binding affinities⁸.

Recently, integrin-specific artificial ECM proteins have been developed by Tjin and coworkers¹⁴. Each aECM protein contains a bioactive cell-binding domain taken from ECM components of native human skin^2,7,15, such as laminin-5, collagen-IV and fibronectin. For example, the integrin α₃Β₁ has been shown to bind the PPFLMLLKGSTR sequence found in the laminin-5 alpha-3 chain globular domain 3 (LG3)^16,17. In their report, they showed that primary human skin epidermal keratinocytes preferentially engage different integrins for binding to each of the aECM proteins, depending on the type of cell binding domain present.

The aECM proteins discussed in the work by Tjin et al. contain flanking elastin-like domains {(VPGIG)₂VPGKG(VPGIG)₂}₈ that confer elasticity which mimics the mechanical properties of human skin. In addition, the incorporation of lysine residues within the elastin-like repeats also increases the overall protein solubility in aqueous solvents. In addition, the lysine residues also serve as crosslinking sites to facilitate the formation of crosslinked aECM films¹². Inclusion of elastin-like repeats within the aECM protein sequence allow the proteins to be readily purified via Inverse Transition Cycling (ITC)¹⁴. Elastins undergo a sharp and reversible phase transition at a specific temperature known as the lower critical solution temperature (LCST) or the inverse transition temperature (T_t)^18-20. Elastins and elastin-like repeats adopt hydrophilic random coil conformations below their LCST and become soluble in water, whereas above their LCST, elastins aggregate rapidly into micron-size particles. Such phase transitions are reversible and hence, can be exploited to allow elastin-based aECM proteins to be readily purified via the ITC technique²¹.

In this work, we report a generalized procedure to design, construct and purify artificial ECM proteins containing bioactive cell-binding domains, fused to elastin-like repeats. The process to design and clone the plasmids that encode for the amino acid sequences for the aECM proteins is described. The steps involved to purify the aECM proteins using ITC are outlined. Finally, the methods to determine the purity of the aECM proteins obtained using SDS-PAGE electrophoresis and Western Blotting are discussed.

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Protocolo

1. Clonación de plásmidos que codifican recombinante para AECM Proteínas

1. Diseño de la secuencia de aminoácidos del dominio funcional (por ejemplo, el dominio de unión celular y elastina repeticiones similares). Sitios de restricción Diseño flanquean los extremos de los dominios funcionales para facilitar la sub-clonación usando software libre de acuerdo con las instrucciones del software (por ejemplo, http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/). Aquí, seleccionar sitios de restricción únicos que no están presentes en el dominio funcional para confinar la digestión a los sitios previstos. Elige sitios de restricción que aparecen en el sitio de clonación múltiple (MCS) del vector de host (por ejemplo, pET22b (+)) para sub-clonación.
2. Invertir traducir la secuencia de aminoácidos en la secuencia de nucleótidos utilizando sitios web gratuitos acuerdo con las instrucciones de software. (Por ejemplo, http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html). Asegurarse de codones están optimizados para E. anfitriones coli.
3. Gen de interés puede ser purchasoligonucleótidos ed comercialmente como una sola cadena (es decir, si los oligonucleótidos <100 pares de bases (pb)) y realizar el recocido de ADN (véase el paso 1.4) para reducir el costo. De lo contrario, los genes de más de 100 pb, que podían ser adquiridos a través de empresas comerciales.
4. Recocido de ADN de los oligonucleótidos
   1. Recocer la oligómeros de ADN para obtener la secuencia del gen deseado. Disolver oligonucleótidos de ADN en un tampón de oligómero de ADN (mM Tris 10: 2-amino-2- (hidroximetil) propan-1,3-diol, pH 8,0, filtrada) a una concentración final de 1 g / l.
   2. Añadir 4 l de cada oligómero a 32 l de tampón de hibridación de ADN (Tris 10 mM, NaCl 100 mM y 100 nM de MgCl ₂₎ para conseguir un total de mezcla de 40 l.
   3. Hervir un vaso de precipitados de agua utilizando una placa caliente y sumergir la mezcla durante 5 min, 95 ° C. Retire el vaso de precipitados y enfriar gradualmente la totalidad de configurar en una caja de espuma de poliestireno O / N. Los oligómeros han sido recocidas y están listos para la digestión.
5. Añadir las enzimas de restricción correspondientes a digerir los oligómeros hibridados (es decir, referido como inserto) y vector huésped (es decir, pET22b (+)) por separado. Utilice la siguiente receta (1-2 g de ADN, 2 l de cada enzima de restricción, 5 l de tampón 10x enzima de restricción, y agua hasta un total mezcla de 50 l) durante 3-4 horas a 37 ° C.
   NOTA: El pET22b (+) plásmido vector es resistente a los antibióticos ampicilina y contiene un 6x-His tag en el extremo C-terminal. El 6x-His presente en pET22b (+) nos permite utilizar sus-etiquetados anticuerpos para identificar la proteína diana a través de Western Blot en el paso 7.
6. Agregar colorante de carga 6x a cada mezcla de digestión. Ejecutar las mezclas de digestión por separado incluyendo una escalera de ADN en 1.2% geles de agarosa de ADN que contiene una mancha de ADN fluorescente UV durante 1 hora a 100 V. visualizar el DNA en gel de agarosa 1,2% con un iluminador de luz UV.
7. Cortar el gel para extraer productos de ADN digeridos utilizando kits de purificación de gel comercial. Elute utilizando el volumen mínimo de la columna para lograr una concentración mínima de ADN de 50-100 ng / l.
8. Combinar el gen de interés secuencialmente ligando el inserto de ADN digerido (es decir, repeticiones de elastina o dominios de unión de células obtenidos por recocido de ADN) en el vector de plásmido usando la ligasa de T4 utilizando la siguiente receta: (2 l de vector, 1 l de T4 ligasa, 1,5 l de tampón de ligación T4, x l de inserto, 10,5 x-l de agua para un total mezcla de 15 l). Incubar la mezcla de ligación a RT durante 2 hr.
   NOTA: la concentración molar del vector para insertar debe variar para optimizar la eficiencia de la ligadura. Volumen de inserto descrito como x en la receta depende de la concentración de ADN eluido de la etapa 1.7.
9. Descongele E. células químicamente competentes coli DH5a (o cualquier cepa de clonación) en hielo. Placas de agar 2xYT caliente (Tabla 1) que contiene ampicilina (25 mg / ml) a 37 ° C.
10. Transformar las células utilizandoGolpe de calor:
    1. Alícuota de 50 l de células competentes en tubos de microcentrífuga limpio, pre-refrigerados. Pipetear 5 l (entre 100 pg a 100 ng) de la mezcla de unión en las células, pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Deje la mezcla en hielo durante 20 min.
    2. Sumergir el tubo de micro-centrífuga que contiene la mezcla de células en un baño de agua 42 ° C durante 2 min y vuelto a en hielo durante 2 min. Tiempo de la duración de inmersión para minimizar el daño por calor a las células.
    3. Añadir 500 l de medio SOC (Tabla 1) en el tubo de microcentrífuga y se incuba a 37 ° C con agitación durante 1 hr.
    4. Spread 50 500 l de la mezcla de células / ligadura sobre una placa de agar 2xYT que ha sido pre-calentado a RT, que contiene ampicilina (25 mg / ml) e incubar las placas al revés a 37 ° CO / N (12-16 hr) .
11. Al día siguiente, escoja colonias de ADN de la placa de agar utilizando puntas de pipeta limpias. Cultivar las colonias en 5 ml de medio 2YT (Tabla1) que contiene ampicilina (25 mg / ml) O / N a 37 ° CO / N (12-16 hr) con agitación (225 rpm).
12. Al día siguiente, utilice un kit de aislamiento de plásmido para extraer los plásmidos de ADN para cada colonia elegido de acuerdo con el protocolo del fabricante. Eluir el ADN con 50 l de agua.
13. Realice una prueba de digerir con enzimas de restricción utilizando la siguiente receta: (ADN 5 l, 0,2 l de cada enzima de restricción, de amortiguamiento de la enzima 1 l 10x restricción y recarga de agua para un total mezcla de 10 l), se incuba durante 2 horas a 37 ° C para la detección de colonias que probablemente contienen el inserto y se ejecutan en un 1,2% en gel de agarosa de ADN como en el paso 1.6.
    NOTA: Después de la digestión, una ligadura de éxito debe resultados en dos grupos, uno para cada vector y el inserto que se corresponden con su respectivo peso molecular (Figura 1).
14. Enviar las posibles colonias para la secuenciación de ADN utilizando promotor T7 cebadores directo e inverso a secuenciadores comerciales.

2. Transformación de plásmido recombinante en bacteriana huésped de expresión

1. Desde el resultado de la secuenciación, seleccionar una colonia que ha sido ligado con éxito y utilizar el plásmido de ADN para la transformación en una E. huésped de expresión coli.
2. Descongele E. cepa de expresión coli (BL21 (DE3) pLysS) en hielo. Mientras tanto, las placas de agar caliente que contiene ampicilina (25 mg / ml) y cloranfenicol (34 mg / ml) a RT.
   NOTA: El plásmido presente en bacterias pLysS cepa BL21 (DE3) pLysS contiene un gen de resistencia a cloranfenicol. El plásmido pLysS contiene un gen represor T7 que se expresa constitutivamente a limitar la expresión de la proteína con fugas AECM. El cloranfenicol es necesario seleccionar para las células de bacterias que contiene pLysS durante el cultivo.
3. Repita el paso 1,10 para obtener transformó E. células de E. coli que están listos para expresar las proteínas artificiales. Envolver las placas de agar en Parafilm y almacenar al revés en 4 6; C durante un máximo de un mes.

3. Expresión bacteriana de AECM Proteínas

1. Consulte la Figura 2, elegir una colonia de la placa de agar transformada con una punta de pipeta e inocular en 10 ml de caldo Terrific (TB) medios estériles (Tabla 1) que contiene tanto los antibióticos ampicilina y cloranfenicol en un tubo de ensayo. Incubar este cultivo iniciador a 37 ° CO / N (12.16 h) con agitación a 225 rpm.
2. Transferir 10 ml del cultivo iniciador en 1 L de medios de TB frescos y estériles suplementado con los mismos antibióticos en un matraz Erlenmeyer de 3 l. Incubar el cultivo a 37 ° C con agitación a 225 rpm durante 2-3 hr y observar la densidad óptica del cultivo (OD ₆₀₀₎ alcanzado 0,6-0,8 pipeteando 1 ml de cultivo en una cubeta vacía para la lectura. Guardar 1 ml de cultivo antes de la inducción para la caracterización de SDS-PAGE.
   1. Para medir OD ₆₀₀ del cultivo celular, preparar 1 vial de medios de comunicación de TB en una cubetapara una medición en blanco. Por otra parte, la transferencia de 1 ml de cultivo del matraz de cultivo en una nueva cubeta vacía. Medir la densidad óptica del cultivo usando un espectrofotómetro contra el blanco de control a una absorbancia de 600 nm.
   2. Guardar la muestra (para el análisis SDS-PAGE posterior) mediante la transferencia de los 1 ml de muestra de cultivo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, se centrifuga a 12.000 xg durante 2 min, y decantar el sobrenadante.
3. Inducir la cultura con isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 1 mM y se incuba a 37 ° C con agitación a 225 rpm durante otras 4 h. Guardar 1 ml de cultivo al final de la inducción a 4 hr para la caracterización de SDS-PAGE.
4. Recoger las células mediante la transferencia de la cultura a botellas de centrífuga de 1 L y se centrifuga a 12.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Descartar el sobrenadante, sopesar los sedimentos de células y resuspender en tampón TEN (Tris 1 M, 0,01 M EDTA, 0,1 M NaCl, pH = 8,0) a 0,5 g / ml.

4. La lisis de cultivos bacterianos

1. Congelar la re-suspendido de cultivo celular a -80 ° CO / N. Descongelar el cultivo celular congelado en un baño de agua a temperatura ambiente o en hielo para lisar las células. Añadir 10 g / ml Deoxyribonuclease I (DNasa I), 10 mg / ml de ribonucleasa A (RNasa I), y 50 mg / ml de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) mientras que la descongelación y homogeneizar la solución con agitación lenta.
2. Después de todas las células resuspendidas se descongelan, ajustar la solución a pH 9,0 para aumentar la solubilidad de la proteína en agua ^12. Añadir 6 N de NaOH gota a gota con agitación en hielo para alcanzar una consistencia homogénea. Lyse por la interrupción de ultrasonidos durante 20 min en hielo utilizando una punta plana de diámetro 2 mm, 5 pulso seg.
3. Centrifugar la solución de células a 12.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un frasco vacío y limpio y se almacena a 4 ° C para la purificación posterior.
4. Mientras tanto, volver a suspender el sedimento celular nuevo con tampón TEN y volver a congelar a -80 ° C. Alisis celular completa, repetición de congelación / descongelación y sonicación proceso hasta tres veces. Ahorra un 20 lisado celular l para la caracterización de SDS-PAGE.

5. Purificación de proteínas usando AECM Inverse Transición Cycling

1. Intercalar el lisado celular de la etapa 4.3 y proceder a purificar las proteínas AECM utilizando ITC, similar a la utilizada para la purificación de proteínas basado en elastina ^21. Ciclos se hará con las diferentes temperaturas que son 4 ° C (referidos como "frío") y 37 ° C (referidos como "calientes") ciclos respectivamente.
2. Dividir el lisado celular en 50 ml botellas de centrífuga, y se centrifuga a 40.000 xg durante 2 horas a 4 ° C. El aspecto del sedimento celular debe ser de color marrón oscuro y buscar nasal.
3. Eliminar el sobrenadante con la pipeta para conseguir una separación limpia del sedimento. Recoger el sobrenadante en botellas de centrífuga limpio y añadir NaCl a una concentración final de 1 M (hasta un máximo de 3 M). Calientela solución a 37 ° C durante 2 horas con agitación a 225 rpm.
   NOTA: La adición de NaCl se disparará la transición del componente elastina de la AECM causando agregación. El sobrenadante se volverá turbia. Si la concentración de proteína es lo suficientemente alta, la proteína blanco espumoso se puede ver en los lados de la botella de centrífuga.
4. Centrifugar el sobrenadante del paso 5.3 a 40.000 xg durante 2 horas a 37 ° C. Decantar el sobrenadante. Triturar el sedimento usando una espátula de metal y resuspender los bits de pellets en autoclave de agua destilada enfriada con hielo (50 mg / ml) con agitación vigorosa O / N a 4 ° C utilizando una barra de agitación magnética y la placa. El sedimento debe ser completamente disuelto.
5. Repita los pasos 5.2 a 5.4 durante otros tres a cinco veces para obtener una mayor pureza de la proteína.
6. Después del ciclo final de la purificación, desalar la solución de proteína por diálisis contra agua destilada a 4 ° C. Dializar solución de proteína contra el agua durante 2-3 días con los cambios de agua cada 4hr o 8 horas de O / N. Ahorre 20 l de la proteína purificada por SDS-PAGE y liofilizar el resto de la proteína purificada y almacenar a -80 ° C hasta su uso posterior.

6. Caracterización de AECM proteínas utilizando SDS-PAGE electroforesis

1. Preparar un gel de SDS-PAGE al 12% (si el peso molecular es grande, utilice 8% en geles de SDS-PAGE para una mejor separación). Añadir tampón de carga SDS 2x a cada muestra, calentar las muestras durante 10 min a 100 ° C y ejecutar muestras en el gel durante 1 hora a 100 V o hasta que la escalera de proteína correspondiente al peso molecular de la proteína AECM alcanza el medio de la gel.
2. Recuperar el gel de la SDS-PAGE configurar y añadir Coomassie Brilliant mancha azul (Tabla 2) con un volumen de sumergir el gel durante 1 hora en una placa de Petri. Enjuague el gel en una solución decolorante (Tabla 2) durante 5 min en un eje de balancín. Cambie la solución decolorante, y continuar destain el gel con balanceo hasta que el fondo de tél gel se vuelve claro. Las bandas de proteínas deben ser claramente visibles.
3. Comparación de la posición de la proteína diana contra la escalera de proteínas para determinar el peso molecular de la proteína diana.
4. Para confirmar aún más la presencia de la proteína diana, lleve a cabo el Western Blot como en el paso 7.

7. Caracterización de AECM proteínas usando Western Blotting

1. Ejecute las muestras en un gel SDS-PAGE al 12%, como en la sección 6 sin manchas.
2. Cortar membrana de nitrocelulosa a un tamaño ligeramente mayor que el gel SDS-PAGE. Cortar 4 trozos de papel de filtro para el mismo tamaño.
3. Moje un pedazo de papel de filtro con transferencia Western Buffer (20% v / v de metanol, 25 mM Tris, 190 mM de glicina, pH 8,3), colocar el gel SDS-PAGE en la parte superior del papel de filtro, seguido de otro pedazo de papel de filtro , a continuación, la membrana de nitrocelulosa y una final otros dos trozos de papel de filtro. Asegúrese de que el conjunto de configuración se sumerge con tampón de transferencia occidental suficiente.
   NOTA: El gel y la membrana no deben estar en contacto en este punto de tiempo como proteínas podrían unirse a la membrana tras el contacto.
4. Transferir las proteínas en la membrana de nitrocelulosa mediante la colocación de dos papeles de filtro en una unidad de transferencia semiseca occidental, seguido de la membrana de nitrocelulosa, y coloque cuidadosamente el gel SDS-PAGE de dentro y de la membrana, por último colocar el último papel de filtro húmedo en dos el gel SDS-PAGE. Ejecutar la transferencia oeste a 45 mA, 30 min. Añadir búfer si el voltaje es superior a 30 V.
   NOTA: De preferencia colocar el gel SDS-PAGE en la membrana con un intento y evitar cambiar el gel de forma innecesaria en la membrana como proteínas podrían unirse a la membrana al entrar en contacto.
5. Recuperar y bloquear la membrana de nitrocelulosa con solución de bloqueo (leche desnatada al 5% en PBS pH 7,4, se filtró con papel de filtro) durante 2 horas a RT. Deshágase de tampón de bloqueo y añadir PBS para enjuagar.
   NOTA: El cambio a los nuevos guantes para evitar la contaminación de la membrana con prote no deseadoins.
6. Incubar anticuerpo anti-His primaria con la dilución en PBS a 1: 1000 a RT durante 1 hr con balanceo. Preparar una mezcla en un volumen que podría sumergir toda la membrana, por ejemplo, con relación de dilución 1: 1.000, añadir 1 l de anticuerpo (concentración Stock: 1 mg / ml) a 999 l de PBS para una mezcla total de 1 ml.
7. Enjuague la membrana con 5 ml de PBST (PBS con 0,1% de Tween 20).
8. Incubar con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) con una dilución en PBS a 1: 5000 a RT durante 1 hr con balanceo. Preparar una mezcla en un volumen que podría sumergir toda la membrana, por ejemplo, con relación de dilución 1: 5.000, añadir 1 l de anticuerpo (concentración Stock: 1 mg / ml) a 4999 l de PBS para una mezcla total de 5 ml.
9. Se lava la membrana con 5 ml de PBST y repetir dos veces.
10. Aplicar el sustrato quimioluminiscente a la membrana con un volumen para cubrir la membrana y se incuba siguiendo las instrucciones para el sustrato utilizado.
    NOTA: La sensibilidad de la detección de la proteína sustrato que puede variar, se recomienda un sustrato con la máxima sensibilidad para señales muy bajas en el caso de aumento de la concentración de anticuerpo no aumenta señales.
11. Captura de las señales de quimioluminiscencia utilizando un generador de imágenes basada cámara CCD. Ajustar la relación de dilución de anticuerpo primario y secundario si las señales son débiles y no específica. Incubar ya en solución de bloqueo si la señal de fondo es alto.

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Resultados

En el diseño de proteínas de fusión que contienen repeticiones tipo elastina, es importante para mantener un contenido de elastina en general, gran parte suficiente de la proteína de fusión ^18. Esto es para asegurar que el constructo de proteína de fusión conserva sus características tipo elastina, con el fin de utilizar ITC para la purificación. El diseño y las secuencias de proteínas descritas en esta sección AECM se tomaron específicamente de la obra por Tjin et al. ^14. En ...

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Discusión

Ingeniería de proteínas recombinantes es una técnica versátil para crear materiales de proteínas novedosas utilizando un enfoque de abajo hacia arriba. Los materiales basados ​​en proteínas pueden ser diseñados para tener múltiples funcionalidades, adaptado de acuerdo con la aplicación de interés. Debido a la creciente avance en las tecnologías de clonación y expresión de proteínas, se ha convertido en relativamente simple (y rentable) para crear una variedad de proteínas artificiales de una manera re...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
pET22b (+)	Novagen	69744	T7 expression vectors with resistance to ampicillin
BL21(DE3)pLysS	Invitrogen	C6060-03	additional antibiotics - chloramphenicol
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG)	Gold Biotechnology	I2481C	1 M stock solution with autoclaved water, make fresh prior to induction.
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106	plasmid isolation kit
T4 ligase	New England Biolabs	M0202S
Ampicillin	Affymetrix	11259
Chloramphenicol	Affymetrix	23660
Zymoclean™ gel DNA recovery kit	Zymo Research	D4001
XL10-gold strain	Agilent Technologies	200315