עיצוב ובנייה של תאי מטריקס המלאכותי (aECM) חלבונים מ<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; להנדסת רקמות עור

Summary

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

Abstract

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Introduction

For several decades, both synthetic and natural materials have been explored for use as scaffolds in tissue engineering^1,2. While synthetic materials such as polymers offer excellent structural integrity and tunable mechanical properties, they often have insufficient bioactivity to promote growth and infiltration of tissues. On the other hand, natural materials such as extracellular matrix (ECM) proteins have excellent biological activity, but have limitations such as batch-to-batch variability, rapid degradation and immunogenicity issues. As such, recombinant proteins are desired, since they can be designed to mimic only the desirable properties of native proteins^3,4.

Recombinant protein engineering has garnered widespread interests as a versatile platform for the design and production of novel artificial protein biopolymers. By controlling the genetic sequence, the functionalities of the artificial proteins can be tailored for a wide variety of applications^5,6. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins can be tailored to have multiple functionalities for applications in tissue engineering, regeneration and wound repair^2,7. More importantly, advances in cloning and purification technologies have increased scalability and reduced the cost of manufacturing recombinant proteins tremendously. It is possible to produce large quantities of recombinant proteins at low production costs which are economic for use in the clinic⁵.

Artificial extracellular matrix proteins have been developed for tissue engineering applications^8-11. For instance, Tirrell et al. designed a small diameter vascular graft using artificial proteins containing fibronectin CS5 sequence and elastin-like repeats (ELP-CS5). They showed that human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were able to adhere and grow on these materials¹². Others have also incorporated short bioactive sequences taken from fibronectin, collagen, laminin, fibrinogen and vitronectin as well as structural domains that mimic elastin, spider silk and collagens to create a variety of fusion proteins¹⁰. Bulk cross-linked films made out of elastin-based aECM proteins also exhibited mechanical properties similar to that of native elastin (elastic moduli ranges between 0.3-0.6 MPa)¹³. Subsequently, aECM proteins containing longer fibronectin fragments were also reported to accelerate wound healing in vitro due to increased integrin binding affinities⁸.

Recently, integrin-specific artificial ECM proteins have been developed by Tjin and coworkers¹⁴. Each aECM protein contains a bioactive cell-binding domain taken from ECM components of native human skin^2,7,15, such as laminin-5, collagen-IV and fibronectin. For example, the integrin α₃Β₁ has been shown to bind the PPFLMLLKGSTR sequence found in the laminin-5 alpha-3 chain globular domain 3 (LG3)^16,17. In their report, they showed that primary human skin epidermal keratinocytes preferentially engage different integrins for binding to each of the aECM proteins, depending on the type of cell binding domain present.

The aECM proteins discussed in the work by Tjin et al. contain flanking elastin-like domains {(VPGIG)₂VPGKG(VPGIG)₂}₈ that confer elasticity which mimics the mechanical properties of human skin. In addition, the incorporation of lysine residues within the elastin-like repeats also increases the overall protein solubility in aqueous solvents. In addition, the lysine residues also serve as crosslinking sites to facilitate the formation of crosslinked aECM films¹². Inclusion of elastin-like repeats within the aECM protein sequence allow the proteins to be readily purified via Inverse Transition Cycling (ITC)¹⁴. Elastins undergo a sharp and reversible phase transition at a specific temperature known as the lower critical solution temperature (LCST) or the inverse transition temperature (T_t)^18-20. Elastins and elastin-like repeats adopt hydrophilic random coil conformations below their LCST and become soluble in water, whereas above their LCST, elastins aggregate rapidly into micron-size particles. Such phase transitions are reversible and hence, can be exploited to allow elastin-based aECM proteins to be readily purified via the ITC technique²¹.

In this work, we report a generalized procedure to design, construct and purify artificial ECM proteins containing bioactive cell-binding domains, fused to elastin-like repeats. The process to design and clone the plasmids that encode for the amino acid sequences for the aECM proteins is described. The steps involved to purify the aECM proteins using ITC are outlined. Finally, the methods to determine the purity of the aECM proteins obtained using SDS-PAGE electrophoresis and Western Blotting are discussed.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. שיבוט של רקומביננטי פלסמידים קידוד לחלבונים aECM

1. לעצב את רצף החומצות האמיניות של תחום הפונקציונלי (למשל, תחום מחייב תא וחוזר כמו אלסטין). אתרי הגבלת עיצוב איגוף הקצוות של תחומים הפונקציונליים כדי להקל על שימוש בתוכנה חופשית בהתאם להוראות תוכנת שיבוט-משנה (לדוגמא, http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/). כאן, בחר אתרי הגבלה ייחודיים שאינם קיים בתחום הפונקציונלי להגביל עיכול לאתרים המיועדים. בחר אתרי הגבלה המופיעים באתר השיבוט מרובה (MCS) של וקטור המארח (למשל, pET22b (+)) למשנה שיבוט.
2. הפוך לתרגם את רצף חומצות אמינו לתוך רצף נוקליאוטידים באמצעות אתרים בחינם על פי הוראות תוכנה. (למשל, http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html). קודונים להבטיח מותאמים E. מארחי coli.
3. גן של עניין יכול להיות purchasoligonucleotides אד מסחרי יחיד שנתקע (כלומר, אם oligonucleotides <100 זוגות בסיסים (BP)) ולבצע חישול DNA (ראה שלב 1.4) כדי להפחית את העלות. אחרת, לגנים גדולים יותר מ -100 נ"ב, הם יכולים לרכוש דרך חברות מסחריות.
4. חישול DNA של oligonucleotides
   1. לחשל oligomers DNA כדי להשיג את רצף הגן הרצוי. ממיסים oligonucleotides דנ"א במאגר oligomer DNA (10 מ"מ טריס: 2-אמינו-2- (hydroxymethyl) -propan-1,3-דיאול, pH 8.0, מסונן) לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / μl.
   2. הוסף 4 μl של כל oligomer 32 μl של חיץ חישול DNA (10 מ"מ טריס, 100 מ"מ NaCl 100 ננומטר וMgCl ₂₎ כדי להשיג כוללת תערובת 40 μl.
   3. מרתיחים כוס מים באמצעות פלטה חשמלית ולטבול את התערובת ל5 דקות, 95 מעלות צלזיוס. הסר את הכוס ולקרר את כל להגדיר בתיבת קלקר O / N בהדרגה. Oligomers כבר מרותק ומוכנים לעיכול.
5. הוסף את אנזימי הגבלה המקביל לעכל oligomers מורפה (כלומר, המכונה להוסיף) ווקטור מארח (כלומר, pET22b (+)) בנפרד. השתמש במתכון הבא (1-2 מיקרוגרם של ה- DNA, 2 μl של כל אנזים הגבלה, 5 μl של חיץ 10x הגבלת אנזים, ומים עד לסך תערובת 50 μl) במשך 3-4 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
   הערה: pET22b (+) וקטור פלסמיד הוא עמיד לאנטיביוטיקה אמפיצילין ומכיל 6x-תג בC-הסופי. 6x-התג הנוכחי בpET22b (+) מאפשר לנו להשתמש בנוגדנים מתויגים כדי לזהות את חלבון המטרה באמצעות מערבי סופג בשלב 7.
6. להוסיף צבע טעינת 6x לכל תערובת עיכול. הפעל את תערובות העיכול בנפרד כוללים סולם DNA בג'ל agarose DNA של 1.2% המכיל DNA כתם UV-ניאון עבור שעה 1 ב 100 V. דמיין 1.2% ג'ל agarose DNA עם הפנס אור UV.
7. פורסים את ג'ל לחלץ מוצרי DNA מתעכלים באמצעות ערכות טיהור ג'ל המסחרי. Elutדואר באמצעות הנפח המינימאלי לטור כדי להשיג ריכוז ה- DNA מינימום של 50-100 ng / μl.
8. מערבבים את הגן של ריבית על ידי רצף ligating להכניס DNA מתעכל (כלומר, חוזר אלסטין או תחומים תא מחייב מתקבלים על ידי חישול DNA) לתוך וקטור פלסמיד באמצעות האנזים T4 באמצעות המתכון הבא: (2 μl של וקטור, μl 1 של האנזים T4, 1.5 μl של חיץ קשירת T4, x μl של הכנס, 10.5 x-מים μl לסך תערובת 15 μl). דגירה את תערובת קשירה ב RT עבור שעה 2.
   הערה: ריכוז טוחן של וקטור להכניס צריכה להיות מגוון כדי לייעל את יעילות קשירה. נפח של הכנס תאר כx במתכון תלוי בריכוז ה- DNA eluted מצעד 1.7.
9. ההפשרה E. קולי תאי DH5α כימיים מוסמך (או כל זן שיבוט) על קרח. צלחות אגר 2xYT החם (טבלה 1) המכילה אמפיצילין (25 מיקרוגרם / מיליליטר) עד 37 מעלות צלזיוס.
10. להפוך את התאים באמצעותהלם חום:
    1. Aliquot 50 μl של תאים המוסמכים לתוך צינורות נקיים, טרום צוננים מיקרו צנטריפוגות. μl פיפטה 5 (בין 100 עמ '100 ng) של תערובת קשירה לתאים, pipetting בעדינות מעלה ומטה כדי לערבב. השאר את התערובת על קרח למשך 20 דקות.
    2. לטבול את צינור מיקרו צנטריפוגות המכיל התערובת של התאים באמבט מים 42 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות וחזר לעל קרח למשך 2 דקות. זמן משך הטבילה כדי למזער נזקי חום לתאים.
    3. הוסף 500 μl של תקשורת SOC (טבלת 1) לתוך צינור מיקרו צנטריפוגות ולדגור על 37 מעלות צלזיוס עם רעד במשך שעה 1.
    4. מורחים 50 500 μl של תערובת תא / קשירה על צלחת אגר 2xYT כי כבר מראש לחמם RT, המכיל אמפיצילין (25 מיקרוגרם / מיליליטר) ודגירה צלחות הפוכה ב 37 מעלות CO / N (12-16 שעות) .
11. למחרת, לאסוף מושבות DNA מהצלחת אגר באמצעות טיפים פיפטה נקיים. לגדול המושבות ב 5 מיליליטר של תקשורת 2YT (טבלה 1) המכיל אמפיצילין (25 מיקרוגרם / מיליליטר) O / N ב 37 מעלות CO / N (12-16 שעות) עם (סל"ד רועד 225).
12. למחרת, השתמש בערכת בידוד פלסמיד כדי לחלץ את פלסמידים DNA לכל מושבה הרימה על פי הפרוטוקול של היצרן. Elute DNA עם 50 μl של מים.
13. לבצע בדיקה לעכל עם אנזימי הגבלת שימוש במתכון הבא: (DNA 5 μl, 0.2 μl של כל אנזים הגבלה, חיץ 1 μl 10x הגבלת אנזים ומים העליונים לסך תערובת 10 μl), דגירה של השעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס למסך למושבות שעשויות לכלול את הכנס ולרוץ על 1.2% ג'ל agarose DNA כמו בשלב 1.6.
    הערה: לאחר העיכול, קשירה מוצלחת צריכים תוצאות בשתי להקות, אחד עבור כל וקטור ולהוסיף שמתאימים למשקל המולקולרי שלהם (איור 1).
14. שלח הסבירות מושבות לרצפי DNA באמצעות אמרגן T7 קדימה ולהפוך פריימרים לsequencers המסחרי.

ילדה = "jove_title"> 2. הפיכתו של רקומביננטי פלסמיד למארח ביטוי בקטריאלי

1. מהתוצאה הרצף, בחר מושבה שכבר ligated בהצלחה ולהשתמש בפלסמיד דנ"א להפיכה ה מארח ביטוי coli.
2. ההפשרה E. זן ביטוי coli (BL21 (DE3) pLysS) על קרח. בינתיים, צלחות אגר חמות המכילות אמפיצילין (25 מיקרוגרם / מיליליטר) וchloramphenicol (34 מיקרוגרם / מיליליטר) לRT.
   הערה: פלסמיד pLysS הנוכחי בחיידקים להתאמץ BL21 (DE3) pLysS מכילה גן התנגדות chloramphenicol. פלסמיד pLysS מכיל גן מדכא T7 אשר בא לידי ביטוי constitutively להגביל ביטוי דולף של חלבון aECM. Chloramphenicol יש צורך לבחור לתאי חיידקים המכילים pLysS בתרבות.
3. חזור על שלב 1.10 להשיג הפך E. תאי coli כי הם מוכנים לבטא את החלבונים המלאכותיים. לעטוף צלחות אגר בParafilm ולאחסן הפוך ב 4 6; C עד חודש אחד.

3. ביטוי של חלבונים בקטריאלי aECM

1. עיין באיור 2, פיק מושבה מהצלחת אגר הפכה עם קצה פיפטה ולחסן לתוך 10 מיליליטר של תקשורת סטרילית נהדר מרק (TB) (טבלה 1) המכילה את שני אמפיצילין ואנטיביוטיקה chloramphenicol במבחנה. דגירה תרבות המתנע זה על 37 מעלות CO / N (12-16 שעות) עם רעד ב225 סל"ד.
2. העברה 10 מיליליטר של תרבות המתנע לתקשורת שחפת 1 ליטר טרי וסטרילי בתוספת אותה האנטיביוטיקה בבקבוק 3 L Erlenmeyer. דגירה התרבות על 37 מעלות צלזיוס עם הרועד ב 225 סל"ד במשך 2-3 שעות ולבחון את הצפיפות האופטית של התרבות (OD ₆₀₀₎ הגיע .6-0.8 ידי pipetting 1 מיליליטר של התרבות לתוך קובט ריק לקריאה. חוסכים 1 מיליליטר של התרבות לפני הגיוס לאפיון SDS-עמוד.
   1. כדי למדוד OD ₆₀₀ של תרבית התאים, להכין בקבוקון 1 של תקשורת שחפת בקובטלמדידה ריקה. בנפרד, להעביר 1 מיליליטר של תרבות מהבקבוק התרבות לקובט הריק חדש. מדוד את הצפיפות האופטית של התרבות באמצעות ספקטרופוטומטר נגד השליטה ריקה בספיגה של 600 ננומטר.
   2. שמור את המדגם (לניתוח SDS-עמוד שלאחר מכן) על ידי העברת 1 מיליליטר של מדגם התרבות לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר, צנטריפוגות ב XG 12,000 במשך 2 דקות, ולמזוג supernatant.
3. לגרום לתרבות עם איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) לריכוז סופי של 1 מ"מ ולדגור על 37 מעלות צלזיוס עם הרועד ב 225 סל"ד עוד 4 שעות. חוסכים 1 מיליליטר של תרבות בסוף האינדוקציה ב 4 שעות לאפיון SDS-עמוד.
4. קציר התאים על ידי העברת התרבות לבקבוקי צנטריפוגות 1 ליטר ו צנטריפוגות ב XG 12,000 למשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. בטל supernatant, לשקול את כדורי תא וגלול בעשרה חיץ (1 M טריס, 0.01 M EDTA, 0.1 מ 'NaCl, pH = 8.0) ברמה של 0.5 גר' / מיליליטר.

4. תמוגה של תרבויות חיידקים

1. להקפיא את תרבות התא מחדש המושעה ב -80 CO ° / N. להפשיר את תרבות תאים קפואה באמבט מים ב RT או על קרח כדי lyse התאים. הוסף 10 מיקרוגרם / מיליליטר Deoxyribonuclease אני (DNase אני), 10 מיקרוגרם / מיליליטר Ribonuclease (RNase אני), ומיקרוגרם 50 / מיליליטר phenylmethylsulfonyl פלואוריד (PMSF) תוך הפשרה וhomogenize הפתרון עם ערבוב איטי.
2. לאחר כל תאי resuspended הם הפשירו, להתאים את הפתרון ל- pH 9.0 להגדיל את מסיסות החלבון במים ^12. הוסף 6 ירידת N NaOH חכמה עם ערבוב על קרח כדי להשיג עקביות הומוגנית. Lyse על ידי שיבוש קולי במשך 20 דקות על קרח באמצעות קצה 2 מ"מ קוטר שטוח, 5 שניות דופק.
3. צנטריפוגה פתרון התא ב XG 12,000 למשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. מעבירים את supernatant ל, בקבוק ריק נקי וחנות על 4 מעלות צלזיוס לטיהור מאוחר יותר.
4. בינתיים, resuspend התא גלולה שוב עם עשרה חיץ ומחדש הקפאה ב -80 מעלות צלזיוס. לתמוגה מלאה התא, הקפאה / הפשרה חוזרת וsonication תהליך עד שלוש פעמים. חסוך 20 lysate תא μl לאפיון SDS-עמוד.

5. טיהור החלבונים aECM שימוש הפוך מעבר רכיבה על אופניים

1. איסוף lysate התא מהשלב 4.3 ולהמשיך לטהר את חלבוני aECM באמצעות ITC, דומה לזה המשמש לטיהור חלבונים מבוסס אלסטין ^21. מחזורים ייעשו עם הטמפרטורות שונות שהם 4 ° C (המכונה "קר") ו- 37 ° C (המכונה "חמים") מחזורי בהתאמה.
2. פיצול lysate התא לתוך 50 מיליליטר בקבוקי צנטריפוגות, וצנטריפוגות ב 40,000 XG לשעה 2 ב 4 מעלות צלזיוס. המראה של התא גלולה צריך להיות בצבע חום כהה ולחפש נזלת.
3. הסר את supernatant ידי pipetting כדי לקבל הפרדה נקייה מגלולה. לאסוף את supernatant בבקבוקי צנטריפוגות נקיים ולהוסיף NaCl לריכוז סופי של 1 M (עד למקסימום של 3 מ '). חםהפתרון ל -37 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 עם רעד ב225 סל"ד.
   הערה: תוספת של NaCl תפעיל את המעבר של רכיב אלסטין של הצבירה גורמת aECM. Supernatant יהפוך עכור. אם ריכוז החלבון הוא גבוה מספיק, חלבון מוקצף לבן ניתן לראות בצדדים של בקבוק צנטריפוגות.
4. צנטריפוגה supernatant משלב 5.3 ב40,000 XG לשעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס. למזוג supernatant. לרסק את הכדור בעזרת מרית מתכת וresuspend הביטים גלולה בautoclaved מים מזוקקים קר כקרח (50 מ"ג / מיליליטר) עם O ערבוב נמרץ / N ב 4 ° C באמצעות סרגל מערבבים מגנטי וצלחת. גלולה צריכה להיות נמסה לגמרי.
5. חזור על שלבים 5.2-5.4 לשלוש עד חמש פעמים נוספות כדי להשיג טוהר גבוה יותר של החלבון.
6. לאחר המחזור האחרון של טיהור, desalt פתרון החלבון על ידי dialyzing זה נגד מים מזוקקים ב 4 מעלות צלזיוס. Dialyze פתרון חלבון נגד מים במשך 2-3 ימים עם שינויים במים כל 4שעות או 8 שעות לO / N. חסוך 20 μl של החלבון המטוהר לSDS-PAGE וLyophilize שאר החלבון והחנות המטוהרים ב -80 ° C עד לשימוש נוסף.

6. אפיון של החלבונים aECM שימוש SDS-PAGE אלקטרופורזה

1. הכן 12% ג'ל SDS-עמוד (אם המשקל המולקולרי גדול, להשתמש בג'לים SDS-עמוד 8% להפרדה טובה יותר). הוסף חוצץ טעינת SDS 2x מדגם זה, לחמם את הדגימות למשך 10 דקות ב 100 מעלות צלזיוס ולהפעיל דגימות על הג'ל לשעה 1 ב 100 V או עד סולם החלבון המתאים למשקל המולקולרי של חלבון aECM מגיע אמצע ג'ל.
2. אחזר את הג'ל מSDS עמוד-להגדיר ולהוסיף Coomassie כתם כחול מבריק (טבלה 2) עם נפח כדי להטביע את הג'ל לשעה 1 בצלחת פטרי. ג'ל שטיפה בתמיסת destaining (טבלה 2) במשך 5 דקות על כיסא נדנדה. לשנות את פתרון destaining, וימשיך destain ג'ל עם נדנדה עד שהרקע של tהוא ג'ל הופך ברור. להקות חלבון צריכה להיות ברור לעין.
3. להשוות את מעמדו של חלבון המטרה נגד סולם החלבון כדי לקבוע את המשקל המולקולרי של חלבון המטרה.
4. כדי לאשר את קיומו של חלבון המטרה נוסף, לבצע מערבי סופג כמו בשלב 7.

7. אפיון של החלבונים aECM שימוש סופג מערבי

1. הפעל את הדגימות על 12% ג'ל SDS-עמוד כאמור בסעיף 6 ללא הכתמה.
2. חותך קרום nitrocellulose לגודל מעט גדול יותר מג'ל SDS-עמוד. חותך 4 חתיכות של נייר סינון באותו הגודל.
3. חתיכה אחת רטובה של נייר סינון עם הצפת העברה המערבית (20% מתנול / V V, 25 מ"מ טריס, 190 מ"מ גליצין, pH 8.3), הנח את ג'ל SDS-עמוד על גבי נייר הסינון, ואחריו פיסת נייר סינון נוספת , אז קרום nitrocellulose וסופי שתי חתיכות של נייר סינון אחרות. ודא ההגדרה כולו שקועה עם חיץ העברה מערבי מספיק.
   הערה: ג'ל והקרום לא צריך להיות במגע בנקודת זמן זו כחלבונים יכולים להיקשר לממברנה במגע.
4. העבר את החלבונים על הממברנה nitrocellulose על ידי הצבת שני מסמכי מסנן ליחידה מערבית חצי יבש העברה, ואחריו את קרום nitrocellulose, ומניח בזהירות את ג'ל SDS-עמוד ובעל הקרום, ולבסוף מניח את נייר הסינון האחרון שני הרטוב ב ג'ל SDS-עמוד. הפעל את ההעברה המערבית ב 45 מילי-אמפר, 30 דקות. הוסף חוצץ אם מתח גבוה מ -30 V.
   הערה: רצוי למקם את ג'ל SDS-PAGE על הממברנה עם ניסיון אחד ולהימנע מהעברת ג'ל שלא לצורך על קרום חלבונים יכולים להיקשר לממברנה במגע.
5. אחזר ולחסום את קרום nitrocellulose עם פתרון החסימה (5% חלב דל שומן בpH 7.4 PBS, מסונן עם נייר סינון) לשעה 2 ב RT. השלך חיץ החסימה ולהוסיף PBS לשטוף.
   הערה: שינוי לכפפות חדשות, כדי למנוע זיהום הקרום עם הגנה של מחזור לא רצויתוספות.
6. דגירה הנוגדן הראשוני נגדו בדילול PBS ב 1: 1,000 ב RT עבור שעה 1 עם נדנדה. הכן תערובת בנפח שיכול להטביע את כל הקרום, למשל, עם יחס דילול 1: 1,000, להוסיף 1 μl של נוגדן (ריכוז מניות: 1 מ"ג / מיליליטר) עד 999 μl PBS לתערובת כוללת של 1 מיליליטר.
7. יש לשטוף את הממברנה עם 5 מיליליטר של PBST (PBS עם 0.1% Tween20).
8. דגירה עם נוגדנים משני מצומדת לperoxidase סוס-צנון (HRP) בדילול PBS ב 1: 5000 ב RT עבור שעה 1 עם נדנדה. הכן תערובת בנפח שיכול להטביע את כל הקרום, למשל, עם יחס דילול 1: 5,000, להוסיף 1 μl של נוגדן (ריכוז מניות: 1 מ"ג / מיליליטר) ל4,999 μl PBS לתערובת כוללת של 5 מיליליטר.
9. לשטוף את הממברנה עם 5 מיליליטר של PBST וחזור פעמיים.
10. החל מצע chemiluminescent הקרום בהיקף כדי לכסות את הקרום ודגירה על ידי ביצוע ההוראות למצע בשימוש.
    הערה: הרגישות של המצע לגילוי חלבון עשויה להשתנות, אנו ממליצים מצע עם רגישות מקסימלי לאותות נמוכים מאוד במקרה הגדלת ריכוז נוגדנים אינו מגביר אותות.
11. ללכוד את אותות chemiluminescent באמצעות תרמי מבוסס מצלמת CCD. התאם את יחס דילול נוגדן הראשוני ומשניים אם אותות חלשים ואינם ספציפיים. דגירה ארוכה יותר בחסימת פתרון אם אות רקע היא גבוהה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

בעיצוב חלבוני היתוך המכילים חזרות כמו אלסטין-, חשוב לשמור על תכולת האלסטין כוללת, מספיק חלק גדול של חלבון ההיתוך ^18. זו היא להבטיח כי מבנה חלבון ההיתוך שומר מאפיינים כמו אלסטין-, על מנת להשתמש ITC לטיהור. העיצוב והרצפים המתוארים בסעיף זה חלבוני aECM נלקחו במיוחד מהעב?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הנדסת חלבון רקומביננטי היא טכניקה צדדי כדי ליצור חומרי חלבון רומן באמצעות גישה מלמטה למעלה. יכולים להיות מתוכננים חומרים מבוססי החלבון יש פונקציות מרובות, מותאם בהתאם ליישום של עניין. בשל התקדמות גוברת בטכנולוגיות שיבוט וביטוי חלבון, זה הפך להיות יחסית פשוט (וחסכונ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pET22b (+)	Novagen	69744	T7 expression vectors with resistance to ampicillin
BL21(DE3)pLysS	Invitrogen	C6060-03	additional antibiotics - chloramphenicol
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG)	Gold Biotechnology	I2481C	1 M stock solution with autoclaved water, make fresh prior to induction.
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106	plasmid isolation kit
T4 ligase	New England Biolabs	M0202S
Ampicillin	Affymetrix	11259
Chloramphenicol	Affymetrix	23660
Zymoclean™ gel DNA recovery kit	Zymo Research	D4001
XL10-gold strain	Agilent Technologies	200315