人工細胞外マトリックス（AECM）タンパク質からの設計と構築<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt;皮膚組織工学のための

要約

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

要約

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

概要

For several decades, both synthetic and natural materials have been explored for use as scaffolds in tissue engineering^1,2. While synthetic materials such as polymers offer excellent structural integrity and tunable mechanical properties, they often have insufficient bioactivity to promote growth and infiltration of tissues. On the other hand, natural materials such as extracellular matrix (ECM) proteins have excellent biological activity, but have limitations such as batch-to-batch variability, rapid degradation and immunogenicity issues. As such, recombinant proteins are desired, since they can be designed to mimic only the desirable properties of native proteins^3,4.

Recombinant protein engineering has garnered widespread interests as a versatile platform for the design and production of novel artificial protein biopolymers. By controlling the genetic sequence, the functionalities of the artificial proteins can be tailored for a wide variety of applications^5,6. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins can be tailored to have multiple functionalities for applications in tissue engineering, regeneration and wound repair^2,7. More importantly, advances in cloning and purification technologies have increased scalability and reduced the cost of manufacturing recombinant proteins tremendously. It is possible to produce large quantities of recombinant proteins at low production costs which are economic for use in the clinic⁵.

Artificial extracellular matrix proteins have been developed for tissue engineering applications^8-11. For instance, Tirrell et al. designed a small diameter vascular graft using artificial proteins containing fibronectin CS5 sequence and elastin-like repeats (ELP-CS5). They showed that human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were able to adhere and grow on these materials¹². Others have also incorporated short bioactive sequences taken from fibronectin, collagen, laminin, fibrinogen and vitronectin as well as structural domains that mimic elastin, spider silk and collagens to create a variety of fusion proteins¹⁰. Bulk cross-linked films made out of elastin-based aECM proteins also exhibited mechanical properties similar to that of native elastin (elastic moduli ranges between 0.3-0.6 MPa)¹³. Subsequently, aECM proteins containing longer fibronectin fragments were also reported to accelerate wound healing in vitro due to increased integrin binding affinities⁸.

Recently, integrin-specific artificial ECM proteins have been developed by Tjin and coworkers¹⁴. Each aECM protein contains a bioactive cell-binding domain taken from ECM components of native human skin^2,7,15, such as laminin-5, collagen-IV and fibronectin. For example, the integrin α₃Β₁ has been shown to bind the PPFLMLLKGSTR sequence found in the laminin-5 alpha-3 chain globular domain 3 (LG3)^16,17. In their report, they showed that primary human skin epidermal keratinocytes preferentially engage different integrins for binding to each of the aECM proteins, depending on the type of cell binding domain present.

The aECM proteins discussed in the work by Tjin et al. contain flanking elastin-like domains {(VPGIG)₂VPGKG(VPGIG)₂}₈ that confer elasticity which mimics the mechanical properties of human skin. In addition, the incorporation of lysine residues within the elastin-like repeats also increases the overall protein solubility in aqueous solvents. In addition, the lysine residues also serve as crosslinking sites to facilitate the formation of crosslinked aECM films¹². Inclusion of elastin-like repeats within the aECM protein sequence allow the proteins to be readily purified via Inverse Transition Cycling (ITC)¹⁴. Elastins undergo a sharp and reversible phase transition at a specific temperature known as the lower critical solution temperature (LCST) or the inverse transition temperature (T_t)^18-20. Elastins and elastin-like repeats adopt hydrophilic random coil conformations below their LCST and become soluble in water, whereas above their LCST, elastins aggregate rapidly into micron-size particles. Such phase transitions are reversible and hence, can be exploited to allow elastin-based aECM proteins to be readily purified via the ITC technique²¹.

In this work, we report a generalized procedure to design, construct and purify artificial ECM proteins containing bioactive cell-binding domains, fused to elastin-like repeats. The process to design and clone the plasmids that encode for the amino acid sequences for the aECM proteins is described. The steps involved to purify the aECM proteins using ITC are outlined. Finally, the methods to determine the purity of the aECM proteins obtained using SDS-PAGE electrophoresis and Western Blotting are discussed.

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プロトコル

AECMタンパク質のための組み換えプラスミドエンコーディングの1クローニング

1. 機能的ドメイン（ 例えば 、細胞結合ドメインとエラスチン様反復）のアミノ酸配列を設計します。機能的ドメインの末端に隣接するデザインの制限部位は、サブクローン化ソフトウェア命令に従ってフリーソフトウェアを使用して（ 例えば 、http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/）を容易にします。ここでは、意図したサイトへの消化を閉じ込める機能ドメインに存在しないユニークな制限部位を選択します。サブクローン化のための宿主ベクター（ 例えば 、たpET22b（+））のマルチクローニングサイト（MCS）に表示される制限部位を選択してください。
2. ソフトウェア命令に応じて自由にウェブサイトを使用してヌクレオチド配列にアミノ酸配列を逆翻訳します。 （ 例えば 、http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html）。確認コドンは、Eのために最適化されています大腸菌ホスト。
3. 目的の遺伝子はパーチャスすることができますED商業として一本鎖オリゴヌクレオチドは、DNAとアニールを行う（オリゴヌクレオチド<100塩基対（bp）の場合、すなわち、）（ステップ1.4参照）、コストを低減することができます。それ以外の場合は、100塩基対よりも大きい遺伝子について、それらは商業会社を通じて購入することができました。
4. オリゴヌクレオチドのDNAアニーリング
   1. 所望の遺伝子配列を得るために、DNAオリゴマーをアニール。を1μg/μlの最終濃度まで（濾過2-アミノ-2-（ヒドロキシメチル） - プロパン-1,3-ジオール、pH8.0の、10mMトリス）DNAオリゴマーバッファにおけるDNAオリゴヌクレオチドを​​溶解します。
   2. 合計40μlの混合物を達成するために、DNAのアニーリングバッファー（10mMトリス、100mMのNaClおよび100nMのMgCl _2）の32μlに各オリゴマーの4μlを添加します。
   3. ホットプレートを用いて水の入ったビーカーを沸騰させると5分、95°Cのための混合物を浸します。ビーカーを外し、徐々に発泡スチロールの箱O / Nに設定全体を冷却します。オリゴマーは、アニールし、消化のために準備ができているされています。
5. アニーリングしたオリゴマー（ すなわち 、インサートと呼ばれる）と宿主ベクター別々に（ すなわちたpET22b（+））を消化するために対応する制限酵素を加えます。 37℃で3〜4時間以下のレシピ（DNAの1〜2μgの、それぞれの制限酵素2μlの、合計50μlの混合物に10倍制限酵素バッファー、水までの5μl）を使用してください。
   注：たpET22b（+）プラスミドベクターは、アンピシリン抗生物質耐性であり、C末端に6×Hisタグが含まれています。 6X-HisタグされたpET22b（+）に存在は、私たちは、ステップ7でウェスタンブロッティングを介して標的タンパク質を同定するためにHisタグ抗体を使用することができます。
6. 各消化混合物に6×ローディング色素を追加します。 100 Vで1時間紫外線蛍光DNA染色を含むDNAのアガロースゲルはUV光照明で1.2％のDNAのアガロースゲルを視覚化し、1.2％に個別にDNAラダーを含む消化混合物を実行します。
7. 商業ゲル精製キットを用いて消化DNA産物を抽出するために、ゲルをスライス。 ELUT電子50-100 ng /μLでの最小DNA濃度を達成するために、列の最小ボリュームを使用。
8. 、ベクトルの（2μL、T4リガーゼ1μlの：消化されたDNAは、以下のレシピを使用して、T4リガーゼを用いてプラスミドベクター（ すなわち、エラスチン反復またはDNAアニールにより得られた細胞結合ドメイン）を挿入連結することにより、目的の順次の遺伝子を組み合わせてT4ライゲーションバッファー1.5μlの、Xμlのインサートの、10.5-Xμlの合計15μlの混合物のための水）。室温で2時間ライゲーション混合物をインキュベートします。
   注：挿入するベクターのモル濃度は、ライゲーション効率を最適化するために変化されるべきです。レシピのxと記載インサートの体積は、ステップ1.7から溶出したDNA濃度に依存します。
9. 雪解けE.氷の上で大腸菌 DH5α化学的コンピテント細胞（または任意のクローニング株）。ウォームする2×YT寒天プレートアンピシリン（25μg/ ml）を含有する（ 表1）37℃です。
10. 使用して細胞を形質転換ヒートショック：
    1. きれいな、予備冷却マイクロ遠心チューブに小分けしたコンピテント細胞を50μl。細胞内へのライゲーション混合物（100 ngの100 pgの間）ピペットを5μl、優しく上下にピペッティング混合します。氷上で20分間、混合物を残します。
    2. 2分間42℃の水浴中で細胞混合物を含むマイクロ遠心管を浸し、2分間氷上に戻しました。細胞への熱損傷を最小にするために、浸漬時間を時間。
    3. マイクロ遠心管にSOC培地（ 表1）の500μl加え、1時間37℃で振盪しながらインキュベートします。
    4. 室温に予め温めてきたの2×YT寒天プレート上に細胞/ライゲーション混合物の50〜500μLを広げ、アンピシリン（25μg/ ml）を含有し、37°のCO / N（12〜16時間）でプレート逆さまをインキュベート。
11. 次の日、きれいなピペットチップを使用して、寒天プレートからDNAのコロニーを選択します。 2YT培地（ 表 5 mlにコロニーを育てます1）（225 rpm）し振とうしながら37°CO / N（12〜16時間）で、アンピシリン（25 / mlの）O / Nを含みます。
12. 翌日、製造業者のプロトコルに従って選んだ各コロニーのためのDNAプラスミドを抽出するために、プラスミド単離キットを使用しています。水50μlのDNAを溶出します。
13. （5μlのDNA、各制限酵素の0.2μlを、1μlの10×制限酵素バッファーとトップアップ合計10μlの混合物のための水）、37℃で2時間インキュベート：以下のレシピを使用して、制限酵素で消化試験を行いますそうインサートを含有し、ステップ1.6のように1.2％のDNAのアガロースゲルで泳動したコロニーをスクリーニングするため。
    注：消化すると、それぞれの分子量（ 図1）に対応する1つ各ベクトルと挿入するための2つのバンドで成功したライゲーションすべき結果、。
14. フォワードT7プロモーターを使用して、DNA配列決定のための可能性のコロニーを送ると商業シーケンサにリバースプライマー。

2。細菌発現宿主への組換えプラスミドの形質転換

1. 配列決定の結果から、正常にライゲートされたコロニーを選択し、Eへの形質転換のためのDNAプラスミドを使用大腸菌発現宿主。
2. 雪解けE.氷の上で大腸菌発現株（BL21（DE3）pLysSを）。一方、RTにアンピシリン（25μg/ ml）およびクロラムフェニコール（34μgの/ ml）を含む暖かい寒天プレート。
   注：細菌中に存在するpLysSをプラスミドはBL21（DE3）pLysSをクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む株。 pLysSをプラスミドは、構成AECMタンパク質の漏出性発現を制限するために表現されたT7プレッサー遺伝子が含まれています。クロラムフェニコールは、培養中pLysSをが含まれている細菌細胞を選択することが必要です。
3. Eを形質転換し得るために、繰り返し手順1.10人工タンパク質を発現させるために準備ができている大腸菌細胞 。パラフィルムで寒天プレートをラップし、4で上下逆さまに保存 6; 1ヶ月までのためのC。

AECMタンパク質の3細菌発現

1. 図2をピペットチップで形質転換した寒天プレートからコロニーを選択し、試験管にアンピシリンおよびクロラムフェニコール抗生物質の両方を含有する滅菌テリフィックブロス（TB）培地（ 表1）の10ミリリットルに接種するために参照してください。 225rpmで振盪しながら37°CO / N（12〜16時間）で、このスターター培養をインキュベートします。
2. 転送3 L三角フラスコ内の同じ抗生物質を補充した1 L新鮮な滅菌TB培地にスターター培養の10ミリリットル。 2-3時間、225rpmで振とうしながら37℃で培養をインキュベートし、培養物の光学密度を観察（OD _600）読書のための空のキュベットに1mlの培養物をピペットで0.6〜0.8に達しました。 SDS-PAGEの特徴付けのための誘導の前に1mlの培養物を保存します。
   1. 細胞培養物のOD _600を測定するために、キュベット内のTB培地の1バイアルを準備ブランク測定用。これとは別に、新しい空のキュベットに培養フラスコからの1mlの培養物を移します。 600 nmでの吸光度でブランク対照に対して分光光度計を用いて培養物の光学密度を測定します。
   2. 1.5 mlのマイクロチューブに培養サンプルの1ミリリットルを転送することによって（その後のSDS-PAGE分析のために）サンプルを保存して2分間12,000×gで遠心分離し、上清をデカント。
3. 1mMの最終濃度までイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）を用いて培養物を誘導し、さらに4時間、225rpmで振盪しながら37℃でインキュベートします。 SDS-PAGEの特徴付けのために4時間で、誘導の最後に1mlの培養物を保存します。
4. 4℃で30分間12,000×gで1 Lの遠心ボトル及び遠心分離機に培養を転送することによって細胞を回収。上清を捨て、0.5グラム/ mlでTEN緩衝液（1Mトリス、0.01MのEDTA、0.1 MのNaCl、pH値= 8.0）で細胞ペレットを再懸濁の重量を量ります。

細菌培養の4溶解

1. -80°CO / Nで再懸濁細胞培養をフリーズします。細胞を溶解し、室温でまたは氷上で水浴中で凍結した細胞培養物を解凍します。解凍しながら10 / mlのデオキシリボヌクレアーゼI（DNアーゼI）、10 / mlのリボヌクレアーゼA（RNアーゼI）、および50μg/ mlのフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）を追加し、ゆっくり攪拌しながら溶液を均質化します。
2. すべての再懸濁した細胞を解凍した後、水¹²中のタンパク質の溶解度を増加させるためにpHを9.0に溶液を調整します。 6 N NaOHを均質な一貫性を達成するために氷上で撹拌しながら滴下して加えます。直径2mmの平坦な先端、5秒のパルスを用いて、氷上で20分間、超音波破砕によって溶解します。
3. 4℃で30分間、12,000×gで細胞溶液を遠心。後の精製のために4℃で清潔、空き瓶や店舗に上清を移します。
4. 一方、-80℃で10バッファおよび再凍結で再び細胞ペレットを再懸濁します。へ完全な細胞溶解、3回まで繰り返し凍結/解凍し、超音波処理プロセス。 SDS-PAGEの特徴付けのための20μlの細胞溶解物を保存します。

逆転移サイクリングを使用AECMタンパク質の5精製

1. ステップ4.3からの細胞溶解物を照合し、エラスチンベース²¹タンパク質の精製に使用されるものと同様のITCを用いAECMタンパク質を精製するために進みます。サイクルは、それぞれ、4°C（「コールド」と呼ばれる）、37℃（「温かい」と呼ばれる）のサイクルであり、異なる温度で行われます。
2. 4℃で2時間、40,000×gで50mlの遠心分離ボトル、遠心に細胞溶解液を分割します。細胞ペレットの外観は暗褐色であることと鼻水になります。
3. ペレットからの明確な分離を得るために、ピペットで上清を取り除きます。きれいな遠心ボトルに上清を収集し、（3 Mの最大値に）1 Mの最終濃度までのNaClを追加します。暖かいです225rpmで振盪しながら2時間37℃を解決。
   注：塩化ナトリウムの添加はAECM引き起こす凝集のエラスチン成分の推移をトリガーします。上清を濁っになります。タンパク質濃度が十分に高い場合、白色泡状タンパク質は、遠心分離ボトルの側面に見られます。
4. 37℃で2時間、40,000×gでステップ5.3から上清を遠心します。上清を除去。金属へらを使用して、ペレットを粉砕し、磁気攪拌棒と板を用いて、4℃で激しく撹拌しながらのO / Nで氷のように冷たいオートクレーブした蒸留水（50 mg / mlの）でペレットを再懸濁ビット。ペレットが完全に溶解する必要があります。
5. 繰り返しは、タンパク質の高い純度を得るために、他の3倍から5倍のために5.2〜5.4を繰り返します。
6. 精製の最終サイクルの後、4℃の蒸留水に対して、それを透析することによってタンパク質溶液を脱塩。水のすべての4の変化で2〜3日間水に対してタンパク質溶液を透析します時間またはO / Nのための8時間。 SDS-PAGEのために精製したタンパク質の20μLを保存し、さらに使用するまで-80℃で精製したタンパク質や店舗の残りの部分を凍結乾燥。

SDS-PAGE電気泳動を用いてAECMタンパク質の6キャラクタリゼーション

1. （分子量が大きい場合には、より良好な分離のために、8％SDS-PAGEゲルを使用）を12％SDS-PAGEゲルを調製します。 AECMタンパク質の分子量に対応するタンパク質ラダーの中間に到達するまで、各サンプルに2×SDSローディング緩衝液を加え、100℃で10分間、試料を加熱し、100 Vまたはで1時間、ゲル上のサンプルを実行しますゲル。
2. セットアップSDS-PAGEからゲルを取り出し、ペトリ皿に1時間ゲルを沈めるためのボリュームとクマシーブリリアントブルー染色した（ 表2）を追加します。ロッカーで5分間脱色液（ 表2）でゲルをすすぎます。脱色液を変更し、Tの背景まで揺動してゲルを脱色し続けます彼ゲルは透明になります。タンパク質バンドは明らかに見えるはずです。
3. 標的タンパク質の分子量を決定するために、タンパク質ラダーに対する標的タンパク質の位置を比較します。
4. さらに、標的タンパク質の存在を確認するには、ステップ7と同様にウェスタンブロッティングを行います。

ウエスタンブロッティングを使用してAECMタンパク質の7キャラクタリゼーション

1. 無染色のセクション6のように、12％SDS-PAGEゲル上でサンプルを実行します。
2. SDS-PAGEゲルよりも若干大きいサイズにニトロセルロース膜をカットします。同じ大きさにろ紙の4枚をカット。
3. 濾紙の別の部分に続くウエスタントランスファーと濾紙の湿潤一体緩衝液（20％（v / v）のメタノール、25 mMトリス、190 mMのグリシン、pHは8.3）、濾紙の上にSDS-PAGEゲルを配置し、 、その後、ニトロセルロース膜、フィルターペーパーの最終的な他の二枚。全体のセットアップが十分な西部の転送バッファに沈めていることを確認します。
   注：タンパク質が接触した際に膜に結合することができるようにゲルと膜がこの時点で接触してはなりません。
4. ニトロセルロース膜に続く西部の半乾燥転写部へ2の濾紙を配置することによりニトロセルロース膜にタンパク質を移し、慎重に膜内と上のSDS-PAGEゲルを置き、最後の最後の2湿った濾紙を配置SDS-PAGEゲル。 45ミリアンペア、30分で西部の転送を実行します。電圧が30 [V]よりも高い場合に、バッファを追加
   注：好ましくは、1つの試みで膜上のSDS-PAGEゲルを配置し、タンパク質が接触した際に膜に結合することができるように膜に不必要にゲルをシフトすることは避けてください。
5. 取得し、RTで2時間（ろ紙でろ過PBSのpHは7.4、5％無脂肪乳）をブロッキング溶液でニトロセルロース膜をブロックします。ブロッキング緩衝液を処分し、すすぐためにPBSを追加します。
   注：不要なproteを有する膜を汚染しないために、新しい手袋に変更イン。
6. 揺らしながら室温で1時間：1,000 1でPBS中に希釈で一次抗His抗体をインキュベートします。 1ミリリットル全混合物のために999μlのPBSに：抗体の1μlを添加1,000（1 mg / mlのストック濃度：）希釈率1で、例えば、膜全体を沈めることができ、ボリュームに混合物を準備します。
7. PBST 5mlの（0.1％のTween20を含むPBS）で膜を洗浄します。
8. 揺らしながら室温で1時間5,000：1でPBSで希釈ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）に結合した二次抗体とインキュベートします。 5ミリリットル全混合物のために4999μlのPBSに：抗体の1μlを添加、5,000（1 mg / mlのストック濃度：）希釈率1で、例えば、膜全体を沈めることができ、ボリュームに混合物を準備します。
9. PBST 5mlでメンブレンを洗浄し、二回繰り返します。
10. 膜をカバーし、使用する基板のための手順に従って、インキュベートするボリュームを有する膜に化学発光基質を適用します。
    注：タンパク質の検出に基板の感度が異なる場合があり、我々は、信号を増加させない抗体濃度を増加させる場合には、非常に低い信号に対して最大感度を有する基板を推奨します。
11. CCDカメラベースのイメージャーを用いて化学発光信号をキャプチャします。信号が弱く、非特異的である場合は、プライマリおよび二次抗体の希釈率を調整します。バックグラウンド信号が高い場合、ブロッキング溶液中でより長くインキュベートします。

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結果

エラスチン様反復を含む融合タンパク質を設計するには、全体のエラスチン含有量は、融合タンパク質¹⁸の十分大きな部分を維持することが重要です。これは、融合タンパク質構築物は、精製のためにITCを使用するために、そのエラスチン様特性を保持することを保証することです。このセクションで説明AECMタンパク質の設計および配列は、特にTjin らによって研究から採取し...

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ディスカッション

組換えタンパク質工学は、ボトムアップアプローチを用いた新規タンパク質材料を作成するための汎用的な技術です。タンパク質ベースの材料は、目的の用途に応じて調整、複数の機能を有するように設計することができます。によるクローニングおよびタンパク質発現技術の増加発展には、再現性があり、スケーラブルな方法で人工タンパク質の様々なを作成するために、比較的簡単な（?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
pET22b (+)	Novagen	69744	T7 expression vectors with resistance to ampicillin
BL21(DE3)pLysS	Invitrogen	C6060-03	additional antibiotics - chloramphenicol
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG)	Gold Biotechnology	I2481C	1 M stock solution with autoclaved water, make fresh prior to induction.
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106	plasmid isolation kit
T4 ligase	New England Biolabs	M0202S
Ampicillin	Affymetrix	11259
Chloramphenicol	Affymetrix	23660
Zymoclean™ gel DNA recovery kit	Zymo Research	D4001
XL10-gold strain	Agilent Technologies	200315