إسكات<em&gt; BRCA2</em&gt; من التعرف على رواية الوظائف البيولوجية التنظيم BRCA2 في الخلايا البشرية المستزرعة

Summary

Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented.

Abstract

إسكات الكابتة للورم البروتين BRCA2 وكشف من خلال التحليلات الكيميائية الحيوية التقليدية تمثل تحديا تقنيا كبيرا نظرا لحجم كبير من البروتين البشري BRCA2 (حوالي 390 كيلو دالتون). نفيدكم التعديلات ترنسفكأيشن وimmunoblotting بروتوكولات سيرنا القياسية لإسكات BRCA2 البشري وكشف الذاتية البروتين BRCA2، على التوالي، في خطوط الخلايا الظهارية الإنسان. وتشمل الخطوات الرئيسية لسيرنا ارتفاع نسبة ترنسفكأيشن الكاشف لواثنين من الجولات اللاحقة من سيرنا ترنسفكأيشن داخل نفس التجربة. باستخدام هذه وغيرها من التعديلات على بروتوكول قياسي نحن باستمرار تحقيق أكثر من 70٪ إسكات الجينات BRCA2 البشري كما تقرره immunoblotting التحليل مع أضداد BRCA2. بالإضافة إلى ذلك، تمسخ من الخلية لست] في 55 ° C بدلا من التقليدية 70-100 ° C والتحسينات التقنية الأخرى من الإجراء immunoblotting السماح الكشف عن البروتين BRCA2 سليمة حتى WHأون كميات قليلة جدا من بدء المواد المتاحة أو عندما تكون مستويات بروتين تعبير BRCA2 منخفضة جدا. إسكات الفعال للBRCA2 في الخلايا البشرية يقدم استراتيجية ثمينة لتعطيل وظيفة BRCA2 في الخلايا مع BRCA2 سليمة، بما في ذلك الخلايا السرطانية، لدراسة المسارات الجزيئية الجديدة والوظائف الخلوية التي قد تتأثر طفرات BRCA2 المسببة للأمراض في الأورام. وينبغي أن يكون التكيف هذا البروتوكول لإسكات وتحليل البروتينات الأخرى كبيرة "مثل BRCA2 كفاءة تحقيقه بسهولة.

Introduction

بترميز الجين BRCA2 (سرطان الثدي قابلية الجينات 2) لبروتين القامع الورم الذي يلعب دورا حاسما في إصلاح DNA فواصل مزدوج الجديلة من خلال تنظيم وظيفة الانزيم recombinase Rad51 ^1. كما تم المتورطين BRCA2 في التشكيل النسخ والسيطرة في الخلية دورة ^2. الطفرات سلالة الجرثومية في الجين BRCA2 تحفز الحساسية جسمية مهيمنة لسرطان الثدي وسرطان المبيض لدى النساء وسرطان البروستاتا لدى الرجال، فضلا عن الاستعداد لأنواع السرطان الأخرى ^3،4. ومع ذلك، على الرغم من زيادة خطر في الاصابة بسرطان، والطفرات BRCA2 التي تقمع أو الحد من وظيفة BRCA2 قد تجعل الخلايا السرطانية أكثر عرضة لعوامل العلاج الكيميائي الذي يسبب التلف في الحمض النووي ^07/05. السرطان متفرقة يحمل انخفاض معدل الطفرات BRCA2 (<3٪) على الرغم من انخفاض مستويات البروتين BRCA2 قد تم الكشف عنها في بعض أنواع السرطان، مما يشير إلى أن البروتين BRCA2قد يتم فقدان أثناء تكون الأورام في أمراض السرطان متفرقة خلال آليات غير طفري ​​التي تعتمد على ^7،8. وبالتالي، فمن المهم أن نفهم بشكل كامل وظائف BRCA2 في سياق بيولوجيا السرطان وكذلك في إعدادات البيولوجية الأخرى.

أداة قوية تستخدم لتحديد وظائف جديدة من الجينات في خلايا الثدييات هي لإسكات تعبيرها. وكمثال على ذلك، فقد أدت إسكات التعبير BRCA2 في مجموعة متنوعة من الخلايا الظهارية الطبيعية مؤخرا إلى تحديد وظيفة جديدة للBRCA2 كمنظم للمقاومة anoikis، خطوة هامة خلال الاستحواذ على الخلايا السرطانية الغازية والمتنقل قدرة ^9. لا يمكن أن يتحقق الجينات إسكات عن طريق إدخال في الخلايا إما صغير التدخل (سي) RNA أو دبوس الشعر القصير (ش) جزيئات الحمض النووي الريبي استهداف جين معين. رجولية عالية من سيرنا وسهولة الاستخدام جعله أداة تفضيلية لإسكات التجارب التي تهدف إلى اكتساب رؤى جديدة في العمليات البيولوجية الهامة لالثانية لتحديد أهداف علاجية جديدة. ومع ذلك، ضربة قاضية كفاءة في التعبير الجيني قد لا تكون قابلة للتحقيق بسهولة لجميع الجينات وربما يكون متغير بدرجة كبيرة اعتمادا على نوع من الخلايا. بسبب انخفاض في مستويات البروتين داخل الخلايا هو النمط الظاهري الأكثر ملاءمة قيد التحقيق، لا بد من تحديد إسكات الجينات التي immunoblotting تحليل للمنتج الجين. مع هذا الصدد، يقدم البروتين BRCA2 تحديا آخر: كونه بروتين كبير (حوالي 390 كيلو دالتون)، والصعوبات التقنية موجودة لتحليل الكيمياء الحيوية التقليدية، بما في ذلك immunoblotting.

نحن هنا التقرير بروتوكول الأمثل لإسكات الفعال للBRCA2 في خطوط الخلايا الظهارية الإنسان وللكشف السريع والناجح من البروتين BRCA2 ضربة قاضية من قبل immunoblotting التحليل.

Protocol

1. إعداد الحلول سيرنا

1. و resuspend 5 نانومول من مخلوط (السيطرة) و 5 نانومول من BRCA2 سيرنا الكريات المجففة في 100 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه (تركيز سيرنا النهائي: 50 ميكرومتر). هذا هو مخزون سيرنا ويجب تخزينها في -20 درجة مئوية في 10 مكل.
2. اتخاذ قسامة من 10 ميكرولتر من الأسهم سيرنا وإضافة 40 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه للحصول على حل العاملة 10 ميكرومتر سيرنا. يجب أن يتم تخزين هذا التخفيف في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
   ملاحظة: الحل العمل سيرنا لا ينبغي أن تخضع لتجميد / الذوبان أكثر من 3 مرات.

2. البذر من الظهارية الإنسان خطوط الخلايا

1. إزالة المتوسطة النمو من خطوط الخلايا الظهارية الإنسان متنامية مع الطبقات الوحيدة الخلية في لوحات زراعة الأنسجة في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO _2.
2. غسل الخلايا في لوحة واحدة مع RT PBS (10 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 100 ملم لوحة).
3. لفصل الخلايا من لوحة،إضافة 2 مل من 0.25٪ التربسين / 0.53 ملي EDTA الحل واحتضان 3-5 دقائق اعتمادا على نوع من الخلايا.
4. قبل جمع خلايا منفصلة، ​​تحييد التربسين بإضافة 2 مل من وسط النمو تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني.
5. نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل.
6. الطرد المركزي الخلايا في 320-330 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية في الدوار الدلو المتأرجح.
7. Resuspend وكريات خلية في 5 مل من المضادات الحيوية مجانا المتوسطة.
8. عد الخلايا تحت المجهر في غرفة Burker أو باستخدام نظام العد الآلي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
9. البذور الخلايا في 6 لوحات جيدا لتكون حوالي 80٪ متموجة بعد 24 ساعة (0.5-1 X10 ⁶ الخلايا في 2 مل من المتوسط ​​لكل بئر). عدد الخلايا الأمثل ليكون المصنف قد تختلف اعتمادا على خطوط معينة من الخلايا ومعدل النمو.
   ملاحظة: لا تقم بإضافة المضادات الحيوية على المدى المتوسط ​​عند هذه النقطة لأن المضادات الحيوية سوف تتداخل سلبيا مع كفاءة حوالةction. من المهم جدا أن الخلايا هي في الممرات ثقافة منخفضة (<10) لتحقيق كفاءة عالية من BRCA2 سيرنا ترنسفكأيشن.

3. خلايا Transfect مع سيرنا

1. بعد أربع وعشرين ساعة طلاء الخلايا، المضي قدما في الجولة الأولى من ترنسفكأيشن.
   1. تمييع 6 ميكرولتر من الدهون على أساس ¹⁰ سيرنا كاشف ترنسفكأيشن محدد في 130 ميكرولتر من انخفاض متوسط ​​المصل.
   2. تمييع 3 ميكرولتر من 10 ميكرومتر سيرنا (30 بمول) في 130 ميكرولتر من انخفاض متوسط ​​المصل.
   3. الجمع بين سيرنا المخفف مع كاشف ترنسفكأيشن المخفف واحتضان لمدة 5-10 دقيقة في RT.
   4. أثناء الحضانة، وإزالة المتوسطة من الخلايا وإضافة 2 مل من متوسطة جديدة قبل تحسنت عند 37 درجة مئوية (من دون مضادات حيوية).
   5. إضافة 250 ميكرولتر من المجمعات كاشف سيرنا ترنسفكأيشن إلى الخلايا (هذا المبلغ هو بئر واحدة من لوحة 6 أيضا).
   6. احتضان الخلايا في حاضنة ترطيب عند 3776؛ C مع 5٪ CO _2.
2. بعد 24 ساعة، المضي قدما في الدور الثاني من ترنسفكأيشن بتكرار الخطوات 3.1.1-3.1.5 مع التعديلات التالية لخطوة 3.1.2: تمييع 5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر سيرنا (50 بمول) في 130 ميكرولتر من انخفاض متوسط ​​المصل.
   1. احتضان الخلايا لمدة 1-2 أيام عند 37 درجة مئوية قبل التحليل.
      ملاحظة: جولتان من transfections واستخدام نسبة عالية كاشف سيرنا / ترنسفكأيشن في الجولة الثانية ضرورية للحصول على كفاءة عالية من BRCA2 إسكات.

4. الخلايا ليز لتحليل immunoblotting

1. إعداد العازلة تحلل جديدة مع برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) تحتوي على 1٪ من غير أيوني، غير تغيير طبيعة المنظفات octylphenoxypolyethoxyethanol، 5 ملي بيروفسفات الصوديوم، 1 ملم orthovanadate الصوديوم، و 10 ملي فلوريد الصوديوم، 2 مم phenylmethylsulfonyl الفلوريد، 10 ميكروغرام / مل leupeptin، 10 ميكروغرام / مل أبروتينين. يبقيه على الجليد.
2. إزالة متوسطة من الخلايا وثرماد لهم مرة واحدة مع PBS الباردة (2 مل / جيد) في لوحة. لمنع أي المرحل PBS، إزالة ذلك من لوحة.
3. إضافة 200 ميكرولتر من تحلل العازلة على كل جانب.
   ملاحظة: إذا كانت الخلايا يجب أن تستخدم أيضا لفحوصات أخرى، يعرض للتريبسين الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2،1-2،6 وresuspend الخلايا غير مناسب العازلة / متوسطة وفقا للتطبيق لاستخدامها.
4. تناوب بلطف لوحة لتوزيع موحد للتحلل العازلة واحتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية على محور دوار.
5. جمع المحللة خلية في أنبوب microcentrifuge على الجليد باستخدام مكشطة الخلية.
6. الطرد المركزي في 17900 x ج لمدة 25 دقيقة في 4 درجات مئوية وجمع طاف في أنبوب جديد.
7. قياس تركيز البروتين باستخدام فحص البروتين المتاحة تجاريا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.

تحليل immunoblotting 5. BRCA2

1. إعداد المخزن المؤقت تشغيل عن طريق تمييع 50 مل من 20X تريس، خلات SDS تشغيل بuffer (50 ملي Tricine، 50 ملي تريس قاعدة، 0.1٪ SDS، ودرجة الحموضة 8.24) مع 950 مل من الماء المقطر.
2. تحضير العينة على النحو التالي: إضافة 15 ميكروغرام من إجمالي المحللة الخلية، 5 ميكرولتر من 4X عينة العازلة التي تحتوي على ليثيوم دوديسيل كبريتات في الرقم الهيدروجيني 8.4، 2 ميكرولتر من 10X عينة الحد من وكيل (0.5 M DTT)، وتحلل العازلة إلى الحجم النهائي من 20 ميكرولتر.
   ملاحظة: يسمح هذا البروتوكول الكشف عن BRCA2 في خطوط الخلايا العادية أيضا عند استخدام كمية أقل من البروتين الكلي (وصولا الى 5 ميكروغرام).
3. تفسد العينات عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
   ملاحظة: ومن الأهمية بمكان استخدام 55 ° C. منذ البروتين BRCA2 هو حساس للحرارة ¹¹ ودرجات الحرارة أعلى تغيير طبيعة يسبب خسارة ثابتة للسليما كامل طول (390 كيلو دالتون) البروتين BRCA2.
4. إعداد غرفة الكهربي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
5. تحميل العينات و 10 ميكرولتر من ارتفاع الوزن الجزيئي قبل الملطخة البروتين القياسية على هلام precasted (تريس، خلات 3-8٪) وتعمل في 120 V لABخارج 2 ساعة ^12. إيقاف تشغيل الكهربي قبل يترك 55 كيلو دالتون علامة زرقاء هلام precasted.
6. إعداد المخزن المؤقت نقل مع 50 مل من 20x ونقل العازلة، 100 مل من الميثانول بنسبة 100٪ و 850 مل من الماء.
7. تنشيط الغشاء PVDF (0.45 ميكرون حجم المسام) عن طريق نقع في الميثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 دقائق ثم يشطف بالماء المقطر وتتوازن في المخزن نقل على الأقل لمدة 5 دقائق. نقع الإسفنج لجهاز نقل في المخزن نقل في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
8. عندما المدى الكهربي هو أكثر، وتجميع شطيرة في كومة نقل بالترتيب التالي (من أسفل إلى أعلى): ثلاثة الإسفنج مشبعة في المخزن نقل، 3MM واحد ورقة ورقة الصف المشبعة في المخزن نقل، وهلام، غشاء PVDF تفعيلها، واحدة 3MM ورقة ورقة الصف المشبعة في المخزن نقل، ثلاثة الإسفنج مشبعة في نقل العازلة ^13،14. وضع كومة في جهاز ونقل البروتينات في 350 مللي أمبير لمدة 4 ساعة عند 4 درجات مئوية أو 180 مللي أمبير بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: يجري BRCA2 بروتين كبير جدا، لا بد من تمديد الوقت نقل من 1 ساعة (كما اقترح من قبل الشركة المصنعة ومعظم بروتوكولات نقل) إلى 4 ساعات أو طوال الليل لضمان نقل كامل من البروتينات عالية الوزن الجزيئي. وبالإضافة إلى ذلك، ويرجع ذلك إلى وقت طويل نقل، فمن الضروري لأداء النشاف في غرفة باردة في 4 درجات مئوية للحد من ارتفاع درجة الحرارة وتسهيل تفكيك شطيرة. أنظمة نقل شبه الجافة ليست جيدة لنقل البروتينات الكبيرة.
9. بعد نقل، ويغسل الغشاء مع TBS، منعه لمدة 1 ساعة على RT في TBS-توين 0.25٪ (TBS-T) التي تحتوي على 5٪ غير دهن الحليب الجاف والتحقيق بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع 30 ميكرولتر مكافحة BRCA2 الأرنب بولكلونل الأجسام المضادة ( 200 ميكروغرام / مل)، مخففة في 9 مل TBS-T + 5٪ غير دهن الحليب الجاف [1: 300 (V / V) التخفيف].
10. يغسل الغشاء ثلاث مرات (10 دقيقة لكل منهما) مع TBS-T، ثم احتضان مرشح لمدة 1 ساعة مع 1 ميكرولتر من الفجل-البيروكسيديز مترافق المضادة للأرنب الضد الثانوية مخففة في 10 مل من TBS-T + 5٪ غير دهن الحليب الجاف. بعد ذلك، ويغسل الغشاء ثلاث مرات (10 دقيقة لكل منهما) مع TBS-T.
11. أداء مناعي من قبل ECL للكشف عن البروتين BRCA2 باستخدام تعزيز التوهج (ECL) الغربية التنشيف كشف الكاشف، باتباع إرشادات الشركة المصنعة. تصور العصابات immunochemiluminescent على ارتفاع القرار الأفلام ECL.
12. أداء مناعي مع الأجسام المضادة للجين التدبير المنزلي، مثل β تويولين (55 كيلو دالتون)، على مرشح واحد عن السيطرة التحميل باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة إلى β تويولين المخفف في 1: 1000 (10 ميكرولتر من الأجسام المضادة لمكافحة تويولين في 10 مل TBS-T + 5٪ الحليب المجفف منزوع الدسم) لمدة 1 ساعة على RT. غسل واحتضان الضد الثانوية كما هو موضح BRCA2 (5،10-5،11)، باستثناء استخدام الفجل-البيروكسيديز مترافق مكافحة الفأر بدلا من المضادة للأرنب الضد الثانوية.
13. الحصول على صورة رقمية للأفلام أعجب مع عصابات immunochemiluminescent وتحليل كثافة الفرقة التي كتبها صورة مخصصة برامج التحليل (على سبيل المثال.، يماغيج).

النتائج

قبل الشروع في / الفحص البيولوجي والكيمياء الحيوية لدراسة تأثير BRCA2 إسكات على وظائف الخلية، فإن الخطوة الأولى هي لتأكيد خصوصية إسكات باستخدام سيرنا المخفوق (عدم استهداف سيرنا) جنبا إلى جنب مع BRCA2 سيرنا (الشكل 1A ). من المهم إجراء الجولة الثانية من سيرنا ترن?...

Discussion

بسبب الطفرات سلالة الجرثومية من الرصاص BRCA2 الجينات إلى زيادة خطر عدة أنواع من السرطان، بما في ذلك الذكور والإناث سرطان الثدي وسرطان المبيض وسرطان البروستاتا، وسرطان البنكرياس، وسرطان الجلد ^3،4، وقد أجريت العديد من الدراسات لفهم الوظيفة البيولوجية من البر...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BRCA2 siRNA	Dharmacon	L-003462-00	SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA
Ctrl siRNA	Dharmacon	D-001810-10-05	ON-TARGETplus Non-targeting Pool
Lipofectamine RNAiMAX Reagent	Life Technologies	13778075	Transfection Reagent
OPTI-MEM I Reduced Serum Medium	Life Technologies	31985-070	Medium for transfection procedure
NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 mm Gel precast	Life Technologies	EA0378	Gel for protein electrophoresis
NuPAGE LDS Sample buffer	Life Technologies	NP0007	Reagent for protein electrophoresis
NuPAGE Sample Reducing agent (10x)	Life Technologies	NP0004	Reagent for protein electrophoresis
NuPAGE Antioxidant	Life Technologies	NP0005	Reagent for protein electrophoresis
HiMark Pre-stained protein standard	Life Technologies	LC5699	Prestained marker for gel electrophoresis
XCell SureLoc Mini-Cell  System	Life Technologies	EI0002	Equipment for protein electrophoresis/transfer
NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer	Life Technologies	LA0041	Reagent for Western blotting
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010	Reagent for Western blotting
NuPAGE Transfer Buffer	Life Technologies	NP0006-1	Reagent for Western blotting
BRCA2 H-300 rabbit polyclonal antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-8326	1:300 dilution
Beta-tubulin monoclonal antibody	Sigma Aldrich	T4026-100UL	1:1000 dilution
Skim Milk powder	Sigma Aldrich	70166	Reagent for Western blotting
Tween-20	Sigma Aldrich	P1379	Reagent for Western blotting
SuperSignal West Pico/Femto Chemiluminescent Substrate	Pierce Thermo Scientific	34080/34096	Chemiluminescence system
PNT1A cells	SIGMA Aldrich (for ECACC)	95012614	PNT1A human, normal prostate epithelium immortalized with SV40
Nthy cells	SIGMA Aldrich (for ECACC)	90011609	Nthy-ori 3-1 Cell Line human, thyroid follicular epithelial cells
Cell Proliferation Kit I (MTT)	Roche	11465007001	Kit for cell proliferation assays