Silencing di<em&gt; BRCA2</em&gt; Per identificare le funzioni biologiche Novel BRCA2-regolamentato coltivate cellule umane

Riepilogo

Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented.

Abstract

Silenziamento della proteina BRCA2 soppressore del tumore e la sua individuazione da analisi biochimiche convenzionali rappresentano una grande sfida tecnica a causa delle grandi dimensioni della proteina BRCA2 umana (circa 390 kDa). Riportiamo modifiche di protocolli di trasfezione e immunoblotting siRNA standard per tacere BRCA2 umano e rilevare proteina BRCA2 endogena, rispettivamente, nelle linee di cellule epiteliali umane. Passaggi chiave includono un alto siRNA rapporto reagente di trasfezione e due successivi turni di siRNA trasfezione all'interno dello stesso esperimento. Utilizzando queste e altre modifiche al protocollo standard che costantemente raggiungere oltre il 70% silenziamento del gene BRCA2 umano come giudicato da immunoblotting con anticorpi anti-BRCA2. Inoltre, denaturazione dei lisati cellulari a 55 ° C invece che nel tradizionale 70-100 ° C e altre ottimizzazioni tecniche della procedura immunoblotting consentono di individuare proteina BRCA2 intatta anche when molto basse quantità di materiale di partenza sono disponibili o quando i livelli di espressione della proteina BRCA2 sono molto basse. Silenziamento efficiente di BRCA2 nelle cellule umane offre una valida strategia per interrompere la funzione BRCA2 in cellule con BRCA2 intatte, comprese le cellule tumorali, per esaminare nuovi percorsi molecolari e funzioni cellulari che possono essere interessati da mutazioni BRCA2 patogeni nei tumori. L'adattamento di questo protocollo per tacere e l'analisi di altre proteine ​​"grandi" come BRCA2 efficiente dovrebbe essere facilmente realizzabile.

Introduzione

Il BRCA2 (Breast Cancer suscettibilità gene-2) gene codifica per una proteina soppressore del tumore che gioca un ruolo cruciale nella riparazione del DNA rotture del doppio filamento regolando la funzione dell'enzima recombinase Rad51 ^1. BRCA2 è stato anche coinvolto nella modulazione della trascrizione e nel controllo del ciclo cellulare ^2. Mutazioni germinali nel gene BRCA2 inducono un autosomica dominante suscettibilità cancro al seno e alle ovaie nelle donne e il cancro alla prostata negli uomini, nonché la predisposizione di altri tipi di cancro ^3,4. Tuttavia, nonostante l'aumento del rischio di sviluppare il cancro, mutazioni BRCA2 che sopprimono o riducono la funzionalità BRCA2 possono rendere le cellule tumorali più vulnerabili agli agenti chemioterapici che causano danni al DNA ^5-7. Tumori sporadici presentano un basso tasso di mutazioni BRCA2 (<3%) anche se sono stati rilevati livelli ridotti di proteina BRCA2 in alcuni tipi di cancro, suggerendo che la proteina BRCA2può essere perso durante la tumorigenesi nei tumori sporadici attraverso meccanismi non mutazionale dipendenti ^7,8. Pertanto, è importante comprendere appieno funzioni BRCA2 nel contesto della biologia cancro e in altri contesti biologici.

Uno strumento potente usato per identificare nuove funzioni di un gene in cellule di mammifero è di mettere a tacere la sua espressione. Come esempio, il silenziamento dell'espressione BRCA2 in una varietà di cellule epiteliali normali ha recentemente portato all'identificazione di una nuova funzione di BRCA2 come regolatore di anoikis resistenza, un passo importante durante l'acquisizione di cellule di cancro invasivo e metastatico capacità ^9. Gene silenziamento può essere raggiunto con l'introduzione nelle cellule o small interfering (si) RNA o brevi tornanti (sh) molecole di RNA rivolti al gene specifico. L'elevata potenza di siRNA e la sua facilità d'uso ne fanno lo strumento preferenziale per tacere esperimenti volti ad acquisire nuove conoscenze sui processi biologici critici unnd di identificare nuovi bersagli terapeutici. Tuttavia, l'abbattimento efficiente di espressione genica può non essere facilmente raggiungibile per tutti i geni e può essere molto variabile a seconda del tipo di cellula. Poiché una diminuzione dei livelli di proteine ​​intracellulari è il fenotipo più rilevante in esame, è fondamentale quantificare silenziamento genico mediante immunoblotting analisi del prodotto del gene. Con questo proposito, la proteina BRCA2 presenta un'ulteriore sfida: essere una grande proteina (circa 390 kDa), esistono difficoltà tecniche per l'analisi biochimica convenzionale, compresi immunoblotting.

Riportiamo qui un protocollo ottimizzato per tacere efficiente di BRCA2 in linee cellulari epiteliali umane e per la rilevazione rapida e positiva di proteine ​​BRCA2 knockdown mediante immunoblotting analisi.

Protocollo

1. Preparare le soluzioni di siRNA

1. Risospendere 5 nmol di strapazzate (Ctrl) e 5 nmol di BRCA2 siRNA pellet secchi in 100 ml di acqua RNase-free (concentrazione siRNA finale: 50 micron). Questo è lo stock siRNA e deve essere conservato a -20 ° C in 10 microlitri aliquote.
2. Prendete una aliquota di 10 ml dal magazzino siRNA e aggiungere 40 ml di acqua RNase-free per ottenere la soluzione di lavoro 10 micron siRNA. Questa diluizione deve essere conservata a -20 ° C fino al momento dell'uso.
   NOTA: La soluzione di lavoro siRNA non deve essere sottoposto a congelamento / scongelamento più di 3 volte.

2. Semina di epiteliali umane linee cellulari

1. Rimuovere il mezzo di crescita di linee cellulari epiteliali umane che crescono come monostrati di cellule in piastre di coltura di tessuti in un incubatore umidificato a 37 ° C, 5% CO _2.
2. Lavare le cellule nella piastra una volta con PBS RT (10 ml di PBS per una piastra di 100 mm).
3. Per staccare le cellule dalla piastra,aggiungere 2 ml di 0,25% tripsina / EDTA soluzione 0,53 mM e incubare 3-5 min a seconda del tipo di cellula.
4. Prima di raccogliere le cellule staccate, neutralizzare tripsina aggiungendo 2 ml di terreno di coltura completo contenente siero bovino fetale al 10%.
5. Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml.
6. Centrifugare le cellule a 320-330 xg per 3 min a 4 ° C in un rotore oscillante secchio.
7. Risospendere il pellet di cellule in 5 ml di free-antibiotici medie.
8. Contare le cellule sotto il microscopio in una camera di Burker o utilizzando un sistema di conteggio automatico secondo le istruzioni del produttore.
9. Seed le cellule in 6 pozzetti per essere circa l'80% confluenti dopo 24 ore (0,5-1 x10 ⁶ celle in 2 ml di terreno per ogni bene). Numero ottimale di cellule per essere seminati possono variare a seconda delle linee cellulari specifiche e il tasso di crescita.
   NOTA: Non aggiungere antibiotici nel mezzo a questo punto, perché gli antibiotici interferiscono negativamente con l'efficienza di trasferction. È molto importante che le cellule sono a passaggi su coltura basse (<10) per ottenere un'elevata efficienza di BRCA2 siRNA trasfezione.

3. Le cellule trasfezione con siRNA

1. Ventiquattro ore dopo la placcatura le cellule, procedere con il primo turno di trasfezione.
   1. Diluire 6 ml di base lipidica ¹⁰ siRNA specifico reagente di trasfezione in 130 ml di mezzo di siero ridotto.
   2. Diluire 3 ml di 10 micron siRNA (30 pmol) in 130 ml di mezzo di siero ridotto.
   3. Unire il siRNA diluito con il reagente di trasfezione diluito e incubare per 5-10 minuti a temperatura ambiente.
   4. Durante l'incubazione, rimuovere il terreno dalle cellule e aggiungere 2 ml di mezzo fresco pre-riscaldato a 37 ° C (senza antibiotici).
   5. Aggiungere 250 l di siRNA-trasfezione complessi reagenti alle cellule (l'importo è per un singolo pozzo di un 6-pozzetti).
   6. Incubare le cellule in un incubatore umidificato a 3776; C con 5% di CO _2.
2. Dopo 24 ore, procedere con il secondo turno di trasfezione ripetendo i punti 3.1.1-3.1.5 con la seguente modifica di passo 3.1.2: diluire 5 ml di 10 micron siRNA (50 pmoli) in 130 ml di mezzo di siero ridotto.
   1. Incubare le cellule per 1-2 giorni a 37 ° C prima dell'analisi.
      NOTA: Due turni di trasfezioni e l'uso di un rapporto di reagenti alto siRNA / trasfezione al secondo turno sono essenziali per ottenere un'elevata efficienza di silenziamento BRCA2.

4. cellule Lisare per l'analisi immunoblotting

1. Preparare tampone di lisi fresca con PBS (pH 7.4) contenente 1% di non ionico, non denaturante detergente ottilfenossipolietossietanolo, 5 mM sodio pirofosfato, 1 mM orthovanadate di sodio, fluoruro di sodio 10 mM, fluoruro phenylmethylsulfonyl 2 mM, 10 mg / ml leupeptina, 10 ug / ml aprotinina. Keep it sul ghiaccio.
2. Rimuovere il supporto da parte delle cellule e wcenere una volta con PBS freddo (2 ml / pozzetto) nella piastra. Per evitare qualsiasi riporto PBS, rimuoverlo completamente dalla piastra.
3. Aggiungere 200 ml di tampone di lisi a ciascun pozzetto.
   NOTA: Se le cellule devono essere utilizzati anche per altri saggi, trypsinize le cellule come descritto al punto 2.1-2.6 e risospendere le cellule in appropriato tampone / supporto secondo l'applicazione da usare.
4. Ruotare delicatamente la piastra per distribuire uniformemente il tampone di lisi e incubare per 15 min a 4 ° C su un rotatore.
5. Raccogliere il lisato cellulare in una provetta su ghiaccio con un raschietto cellulare.
6. Centrifugare a 17.900 xg per 25 min a 4 ° C e raccogliere il surnatante in una nuova provetta.
7. Misurare la concentrazione proteica utilizzando un saggio proteico disponibile in commercio secondo le istruzioni del produttore.

5. BRCA2 analisi immunoblotting

1. Preparare il tampone di corsa diluendo 50 ml di 20x Tris-acetato SDS esecuzione bUffer (Tricine 50 mM, 50 mM Tris Base, 0,1% SDS, pH 8.24) con 950 ml di acqua distillata.
2. Preparare il campione come segue: aggiungere 15 ug di lisato cellulare totale, 5 ml di tampone campione 4x contenenti litio dodecil solfato a pH 8,4, 2 ml di agente riducente 10x campione (0.5 M DTT), e tampone di lisi a un volume finale di 20 ul.
   NOTA: Questo protocollo consente il rilevamento di BRCA2 in linee cellulari normali anche quando si utilizza una minore quantità di proteine ​​totali (fino a 5 mg).
3. Denaturare i campioni a 55 ° C per 10 min.
   NOTA: E 'fondamentale utilizzare 55 ° C. Dal momento che la proteina BRCA2 è termosensibile ^11, le temperature più elevate denaturanti provocano la perdita costante di intatta tutta lunghezza (390 kDa) proteina BRCA2.
4. Impostare la camera elettroforetico secondo le istruzioni del produttore.
5. Caricare i campioni e 10 ml di alto peso molecolare pre-tinto standard di proteine ​​su un gel precasted (Tris-acetato 3-8%) e correre a 120 V per abfuori 2 ore ^12. Fermare la corsa elettroforetica prima del 55 kDa indicatore blu lascia il gel precasted.
6. Preparare il buffer di trasferimento con 50 ml di 20x tampone di trasferimento, 100 ml di metanolo 100% e 850 ml di acqua.
7. Attiva membrana PVDF (0,45 micron dimensione dei pori) immergendolo in metanolo 100% per 5 minuti, risciacquare con acqua distillata ed equilibrare in tampone di trasferimento almeno per 5 min. Immergere le spugne del dispositivo di trasferimento in tampone di trasferimento a 4 ° C fino al momento dell'uso.
8. Quando la corsa elettroforetica è finita, montare il sandwich nella pila di trasferimento nel seguente ordine (bottom-up): tre spugne saturi nel buffer di trasferimento, un foglio di carta 3MM grado saturo in buffer di trasferimento, il gel, membrane PVDF attivato, uno 3MM foglio di carta di grado saturi in buffer di trasferimento, tre spugne saturo in buffer di trasferimento ^13,14. Posizionare la pila nelle proteine ​​apparecchi e di trasferimento a 350 mA per 4 ore a 4 ° C o 180 mA notte a 4 ° C.
   NOTA: Essendo BRCA2 una grande proteina, è fondamentale per estendere il tempo di trasferimento da 1 hr (come suggerito dal produttore e la maggior parte dei protocolli di trasferimento) per 4 ore o durante la notte per garantire la completa trasferimento di proteine ​​ad alto peso molecolare. In aggiunta, a causa del tempo di trasferimento lungo, è indispensabile effettuare il blotting in una camera fredda a 4 ° C per ridurre al minimo il surriscaldamento e facilitare smontaggio sandwich. Sistemi di trasferimento semi-dry non sono buone per il trasferimento di grandi proteine.
9. Dopo il trasferimento, lavare la membrana con TBS, bloccarlo per 1 ora a RT in TBS-Tween 0,25% (TBS-T) contenente latte in polvere 5% nonfat e sonda notte a 4 ° C con 30 microlitri anti-BRCA2 anticorpo policlonale di coniglio ( 200 mcg / ml), diluito in 9 ml TBS-T + 5% latte scremato secca [1: 300 (v / v)] diluizione.
10. Lavare la membrana tre volte (10 min ciascuno) con TBS-T, allora il filtro incubare per 1 ora con 1 ml di rafano anti-coniglio anticorpo secondario coniugato con perossidasi diluito in 10 ml di TBS-T + 5% senza grassi latte in polvere. Successivamente, lavare la membrana per tre volte (10 min ciascuno) con TBS-T.
11. Eseguire immunolocalizzazione di ECL per rivelare la proteina BRCA2 con chemiluminescenza (ECL) Western Blotting Detection Reagent, seguendo le istruzioni del produttore. Visualizza bande immunochemiluminescenti ad alta risoluzione su pellicole ECL.
12. Eseguire immunolocalizzazione con un anticorpo per un gene housekeeping, come β-tubulina (55 kDa), sullo stesso filtro come controllo di caricamento utilizzando un anticorpo monoclonale di β-tubulina diluito a 1: 1.000 (10 ml di anticorpo anti-tubulina in 10 ml TBS-T latte in polvere senza grassi + 5%) per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare e incubare anticorpo secondario come descritto per BRCA2 (5,10-5,11), fatta eccezione per l'utilizzo di perossidasi di rafano-coniugato anti-mouse invece di anticorpo secondario anti-coniglio.
13. Acquisire un'immagine digitale dei film impressi con bande immunochemiluminescenti e analizzare l'intensità della banda da immagine dedicato software di analisi (per esempio., ImageJ).

Risultati

Prima di procedere con un saggio biologico / biochimico per esaminare l'effetto di silenziamento BRCA2 sulle funzioni cellulari, il primo passo è per confermare la specificità del silenziamento utilizzando un siRNA criptato (non-targeting siRNA) fianco a fianco con BRCA2 siRNA (Figura 1A ). E 'importante eseguire una seconda tornata di siRNA trasfezione con un elevato rapporto siRNA / trasfezione per ottenere un'elevata efficienza di silenziamento BRCA2. In effetti, l'...

Discussione

A causa mutazioni germinali del gene BRCA2 piombo ad un aumentato rischio di diversi tipi di cancro, tra cui il cancro al seno maschile e femminile, il cancro ovarico, il cancro alla prostata, cancro al pancreas, e il melanoma ^3,4, sono state avviate una serie di studi per comprendere la funzione biologica della proteina BRCA2. La maggior parte di questi studi sono genetiche a base principalmente a causa di difficoltà tecniche analizzando una proteina gigante come BRCA2. Il metodo descritto qui di s...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BRCA2 siRNA	Dharmacon	L-003462-00	SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA
Ctrl siRNA	Dharmacon	D-001810-10-05	ON-TARGETplus Non-targeting Pool
Lipofectamine RNAiMAX Reagent	Life Technologies	13778075	Transfection Reagent
OPTI-MEM I Reduced Serum Medium	Life Technologies	31985-070	Medium for transfection procedure
NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 mm Gel precast	Life Technologies	EA0378	Gel for protein electrophoresis
NuPAGE LDS Sample buffer	Life Technologies	NP0007	Reagent for protein electrophoresis
NuPAGE Sample Reducing agent (10x)	Life Technologies	NP0004	Reagent for protein electrophoresis
NuPAGE Antioxidant	Life Technologies	NP0005	Reagent for protein electrophoresis
HiMark Pre-stained protein standard	Life Technologies	LC5699	Prestained marker for gel electrophoresis
XCell SureLoc Mini-Cell  System	Life Technologies	EI0002	Equipment for protein electrophoresis/transfer
NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer	Life Technologies	LA0041	Reagent for Western blotting
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010	Reagent for Western blotting
NuPAGE Transfer Buffer	Life Technologies	NP0006-1	Reagent for Western blotting
BRCA2 H-300 rabbit polyclonal antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-8326	1:300 dilution
Beta-tubulin monoclonal antibody	Sigma Aldrich	T4026-100UL	1:1000 dilution
Skim Milk powder	Sigma Aldrich	70166	Reagent for Western blotting
Tween-20	Sigma Aldrich	P1379	Reagent for Western blotting
SuperSignal West Pico/Femto Chemiluminescent Substrate	Pierce Thermo Scientific	34080/34096	Chemiluminescence system
PNT1A cells	SIGMA Aldrich (for ECACC)	95012614	PNT1A human, normal prostate epithelium immortalized with SV40
Nthy cells	SIGMA Aldrich (for ECACC)	90011609	Nthy-ori 3-1 Cell Line human, thyroid follicular epithelial cells
Cell Proliferation Kit I (MTT)	Roche	11465007001	Kit for cell proliferation assays