Silenciamento de<em&gt; BRCA2</em&gt; Identificar funções biológicas regulada-BRCA2 romance em células humanas de cultura

Resumo

Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented.

Resumo

O silenciamento do BRCA2 proteína supressora de tumor e sua detecção por análises bioquímicas convencionais representam um grande desafio técnico, devido ao grande tamanho da proteína BRCA2 humano (cerca de 390 kDa). Relatamos modificações de transfecção e immunoblotting protocolos padrão de siRNA para silenciar BRCA2 e detectar a proteína humana endógena BRCA2, respectivamente, em linhas de células epiteliais humanas. Passos-chave incluem um elevado siRNA à relação de reagente de transfecção e duas rodadas subseqüentes de transfecção siRNA dentro do mesmo experimento. Usando estas e outras modificações introduzidas no protocolo padrão que consistentemente conseguir mais do que 70% silenciamento do gene BRCA2 humano, tal como avaliado por análise de imunotransf erência com anticorpos anti-BRCA2. Além disso, a desnaturação dos lisados ​​celulares a 55 ° C em vez da convencional de 70-100 ° C e outras optimizações técnicas do procedimento de imunotransferência permitir a detecção de proteína intacta, mesmo BRCA2 when quantidades muito pequenas de material de partida estão disponíveis ou quando os níveis de expressão de proteína BRCA2 são muito baixos. Silenciamento eficaz de BRCA2 em células humanas oferece uma estratégia terapêutica valiosa para interromper a função BRCA2 em células intactas com BRCA2, incluindo as células tumorais, para examinar novas vias moleculares e as funções celulares que podem ser afectadas por mutações em tumores BRCA2 patogénicos. Adaptação deste protocolo para silenciamento e análise de outras proteínas "grandes" como BRCA2 eficiente deve ser facilmente alcançável.

Introdução

O gene BRCA2 (cancro da mama susceptibilidade gene-2) codifica para uma proteína supressora de tumor que desempenha um papel crucial na reparação de DNA quebras de cadeia dupla através da regulação da função da enzima recombinase Rad51 ^1. BRCA2 também tem sido implicado na modulação da transcrição e o controlo do ciclo celular em ^dois. Mutações da linha germinativa no gene BRCA2 induzir uma autossómica dominante susceptibilidade para cancro da mama e do cancro do ovário em mulheres e cancro da próstata em homens, assim como a predisposição para outros tipos de cancro ^3,4. No entanto, apesar do aumento do risco de desenvolvimento de cancro, BRCA2 que suprimem ou reduzem a função BRCA2 pode tornar as células de cancro mais vulnerável a agentes quimioterapêuticos que provocam danos no DNA ^5-7. Cânceres esporádicos apresentam uma baixa taxa de mutações BRCA2 (<3%) que os níveis reduzidos de proteína BRCA2 foram detectados em alguns tipos de câncer, o que sugere que a proteína BRCA2podem ser perdidos durante a tumorigênese em cânceres esporádicos através de mecanismos não-mutacional-dependentes ^7,8. Assim, é importante compreender as funções BRCA2 no contexto da biologia do cancro, bem como em outras configurações biológicos.

Uma poderosa ferramenta utilizada para identificar novos funções de um gene em células de mamífero é silenciar a sua expressão. Como um exemplo, o silenciamento BRCA2 expressão numa variedade de células epiteliais normais levou recentemente à identificação de uma nova função de BRCA2 como regulador de resistência anoikis, um passo importante durante a aquisição de célula de cancro invasivo e metastático capacidade ^9. Gene silenciamento pode ser alcançado através da introdução nas células ou de interferência (Si) ou ARN pequeno gancho de cabelo curto (sh) moléculas de RNA alvo do gene específico. A alta potência de siRNA e sua facilidade de uso tornam a ferramenta preferencial para silenciar experiências destinadas a ganhar novos insights sobre processos biológicos críticos umnd para identificar novos alvos terapêuticos. No entanto, knockdown eficiente da expressão do gene pode não ser facilmente possível para todos os genes e pode ser altamente variável dependendo do tipo de célula. Porque a diminuição dos níveis de proteína intracelular é o fenótipo mais relevante sob investigação, que é fundamental para quantificar o silenciamento do gene por análise de imunotransf erência do produto do gene. Com este respeito, a proteína BRCA2 apresenta um desafio adicional: sendo uma proteína grande (cerca de 390 kDa), dificuldades técnicas existem para análise bioquímica convencional, incluindo a imunotransferência.

Nós relatamos aqui um protocolo otimizado para silenciamento eficiente do BRCA2 em linhas de células epiteliais humanas e para a detecção rápida e bem sucedida de proteína BRCA2 knockdown por immunoblotting análise.

Protocolo

1. Prepare soluções siRNA

1. Ressuspender 5 nmol de embaralhada (Ctrl) e 5 nmol de BRCA2 siRNA peletes secos em 100 ul de água isenta de RNase (concentração final de siRNA: 50 uM). Este é o banco de siRNA e deve ser armazenado a -20 ° C em alíquotas de 10 ul.
2. Tomar uma aliquota de 10 ul de estoque de siRNA e adicionar 40 ul de água isenta de RNase para obter a solução de trabalho a 10 ^ M de siARN. Esta diluição deve ser armazenado a -20 ° C até à sua utilização.
   NOTA: A solução de trabalho siRNA não devem ser submetidos a congelamento / descongelamento mais de 3 vezes.

2. Sementeira de linhas celulares epiteliais humanas

1. Remover o meio de crescimento de linhas celulares epiteliais humanas que crescem como monocamadas celulares em placas de cultura de tecidos numa incubadora humidificada a 37 ° C, 5% de CO _2.
2. Lavam-se as células na placa uma vez com PBS temperatura ambiente (10 ml de PBS para uma placa de 100 mm).
3. Para retirar as células a partir da placa,adicionar 2 ml de tripsina a 0,25% / solução de 0,53 mM de EDTA e incubar 3-5 minutos, dependendo do tipo de célula.
4. Antes de recolher as células destacadas, neutralizar a tripsina por adição de 2 ml de meio de crescimento completo contendo 10% de soro fetal bovino.
5. Transferir as células para um tubo de 15 ml.
6. Centrifugar as células a 320-330 x g durante 3 min a 4 ° C num rotor de balde oscilante.
7. Ressuspender as peletes de células em 5 ml de meio livre de antibióticos.
8. Contar as células ao microscópio numa câmara de Burker, quer utilizando um sistema automatizado de contagem de acordo com as instruções do fabricante.
9. Semente as células em placas de 6 poços para ser cerca de 80% confluente após 24 horas (0,5-1 x 10 ⁶ células em 2 ml de meio para cada poço). O número de células óptimas a serem semeadas podem variar dependendo das linhas de células específicas e a taxa de crescimento.
   NOTA: Não adicionar antibióticos a médio neste momento porque os antibióticos irá interferir negativamente com a eficiência de transfection. É muito importante que as células estão na cultura de passagens baixas (<10) para atingir uma elevada eficiência de transfecção siRNA BRCA2.

3. Células de transfecção com siRNA

1. Vinte e quatro horas após o plaqueamento das células, prosseguir com a primeira rodada de transfecção.
   1. Dilui-se 6 ul de ¹⁰ siRNA reagente de transfecção à base de lípidos específicos, em 130 ul de meio de soro reduzido.
   2. Dilui-se 3 ul de siRNA 10 uM (30 pmol) em 130 ul de meio de soro reduzido.
   3. Combinar o siARN diluiu-se com o reagente de transfecção diluído e incubar durante 5-10 min à temperatura ambiente.
   4. Durante a incubação, remover o meio das células e adicionar 2 ml de meio fresco pré-aquecido a 37 ° C (sem antibióticos).
   5. Adicionar 250 ul de complexos de siRNA-reagentes de transfecção para as células (este valor é para um único poço de uma placa de 6 poços).
   6. Incubam-se as células numa incubadora humidificada a 3776; C com 5% de CO _2.
2. Após 24 horas, prosseguir com a segunda rodada de transfecção por passos 3.1.1-3.1.5 repetindo com a seguinte modificação para a etapa 3.1.2: diluir 5 ul de 10 mM siRNA (50 pmol) em 130 mL de meio de soro reduzido.
   1. Incubam-se as células durante 1-2 dias a 37 ° C antes da análise.
      NOTA: Duas rodadas de transfecções e uso de uma relação de reagente alta siRNA / transfecção na segunda rodada são essenciais para obter alta eficiência do BRCA2 silenciamento.

4. Lisar as células para análise de imunotransferência

1. Preparar tampão de lise fresco com PBS (pH 7,4) contendo 1% do não iónico, não-detergente desnaturante octilfenoxipolietoxietanol, pirofosfato de sódio a 5 mM, ortovanadato de sódio 1 mM, fluoreto de sódio 10 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 2 mM, 10 ug / ml de leupeptina, 10 ug / ml de aprotinina. Mantê-lo em gelo.
2. Remover o meio das células e wash-los uma vez com PBS frio (2 ml / poço) na placa. Para evitar qualquer transição PBS, removê-la completamente a partir da placa.
3. Adicionar 200 ul de tampão de lise a cada poço.
   NOTA: Se as células têm de ser usado também para outros ensaios, trypsinize as células tal como descrito no passo 2,1-2,6 e ressuspender as células em tampão / meio apropriado de acordo com a aplicação a ser utilizada.
4. Rodar suavemente a placa para distribuir uniformemente o tampão de lise e incubar durante 15 min a 4 ° C num rotor.
5. Recolhe-se o lisado celular num tubo de microcentrífuga em gelo usando um raspador de células.
6. Centrifugar a 17.900 xg durante 25 min a 4 ° C e recolher o sobrenadante num novo tubo.
7. Medir a concentração de proteína usando um ensaio de proteína disponível comercialmente de acordo com as instruções do fabricante.

Análise immunoblotting 5. BRCA2

1. Preparar o tampão de corrida, diluindo 50 ml de 20x de Tris-Acetato de SDS execução bpode ser prejudicado (Tricina 50 mM, 50 mM Tris Base, 0,1% de SDS, pH 8,24) com 950 ml de água destilada.
2. Preparar a amostra como se segue: adicionar 15? G de lisado celular total, 5 uL de tampão de amostra 4x contendo sulfato de dodecilo de lítio, a pH 8,4, 2 mL de amostra de 10x agente redutor (DTT 0,5 M) e tampão de lise para um volume final de 20 ul.
   NOTA: Este protocolo permite a detecção de BRCA2 em linhas de células normais, também quando se utiliza uma menor quantidade de proteínas totais (inferior a 5 ug).
3. Desnaturar amostras a 55 ° C durante 10 min.
   NOTA: É fundamental usar 55 ° C. Desde que a proteína BRCA2 é termossensível ^11, as temperaturas de desnaturação mais elevadas resultam em perda consistente dos intacto de comprimento completo (390 kDa) da proteína BRCA2.
4. Defina-se a câmara de electroforese de acordo com as instruções do fabricante.
5. Coloque as amostras e 10 ul de alto peso molecular pré-corados padrão de proteína em um gel precasted (Tris-Acetato de 3-8%) e executado em 120 V para aba 2 horas ^12. Parar a corrida eletroforética antes do 55 kDa marcador azul deixa o gel precasted.
6. Preparar o tampão de transferência com 50 ml de tampão de transferência 20x, 100 ml de metanol a 100% e 850 ml de água.
7. Activar a membrana de PVDF (tamanho do poro de 0,45 um) por imersão em 100% de metanol durante 5 minutos, enxaguar com água destilada e equilibrar em tampão de transferência, pelo menos, durante 5 min. Soak as esponjas do aparelho de transferência com tampão de transferência a 4 ° C até à sua utilização.
8. Quando a corrida eletroforética é longo, montar o sanduíche na pilha de transferência na seguinte ordem (bottom-up): três esponjas saturadas em tampão de transferência, uma folha de papel 3MM grau saturado em tampão de transferência, o gel, membrana PVDF ativado, um 3MM folha de papel grau saturado em tampão de transferência, três esponjas saturado em tampão de transferência ^13,14. Colocar a pilha no aparelho e as proteínas de transferência em 350 mA durante 4 horas a 4 ° C ou a 180 mA durante a noite a 4 ° C.
   NOTA: Ser BRCA2 uma proteína muito grande, é crucial para estender o tempo de transferência de 1 hora (tal como sugerido pelo fabricante, e a maioria dos protocolos de transferência) a 4 horas ou durante a noite para assegurar a transferência completa de proteínas de alto peso molecular. Além disso, devido ao longo tempo de transferência, que é essencial para realizar o blotting numa sala fria a 4 ° C para minimizar o sobreaquecimento e facilitar a desmontagem sanduíche. Sistemas de transferência semi-secas não são bons para a transferência de grandes proteínas.
9. Após a transferência, lavar a membrana com TBS, bloqueá-lo durante 1 hora à temperatura ambiente em TBS-Tween 0,25% (TBS-T) contendo 5% de leite seco sem gordura e a sonda durante a noite a 4 ° C com 30 ul de anti-anticorpo policlonal de coelho BRCA2 ( 200 ug / ml), diluído em 9 ml de TBS-T + 5% de leite em pó magro [1: 300 (v / v)] de diluição.
10. Lava-se a membrana três vezes (10 minutos cada) com TBS-T, em seguida, o filtro incubar durante 1 hora com 1 ml de peroxidase de rábano conjugado com anti-anticorpo secundário de coelho diluído em 10 ml de TBS-T + 5% de leite em pó magro. Em seguida, lava-se a membrana três vezes (10 minutos cada) com TBS-T.
11. Realizar imunodetecção por ECL para revelar proteína BRCA2 usando quimioluminescência aumentada (ECL) de Reagente de Detecção de Western Blotting, seguindo as instruções do fabricante. Visualize bandas imunoquimioluminométricos sobre filmes de alta resolução ECL.
12. Realizar imunodetecção com um anticorpo para um gene de manutenção, como β-tubulina (55 kDa), no mesmo filtro como controlo de carga, utilizando um anticorpo monoclonal para β-tubulina diluído a 1: 1000 (10 ul de anticorpo anti-tubulina em 10 ml de TBS-T + 5% de leite seco não gordo) durante 1 h à TA. Lavar e incubar o anticorpo secundário como descrito para BRCA2 (5,10-5,11), excepto na utilização de peroxidase de rábano conjugado com anti-ratinho em vez do anticorpo secundário anti-coelho.
13. Adquirir uma imagem digital dos filmes impressionados com bandas imunoquimioluminométricos e analisar a intensidade da banda por imagem dedicada software de análise (por exemplo,., ImageJ).

Resultados

Antes de prosseguir com um ensaio biológico / bioquímicas para examinar o efeito de silenciamento BRCA2 em funções celulares, o primeiro passo é para confirmar a especificidade do silenciamento usando um siRNA mexidos (não-alvo siARN) lado a lado com BRCA2 siRNA (Figura 1A ). É importante a realização de um segundo turno de transfecção com o siRNA um elevado rácio de siRNA / transfecção para obter uma elevada eficiência de silenciamento BRCA2. Com efeito, a realização ...

Discussão

Porque mutações germinativas do gene BRCA2 chumbo ao aumento do risco de diversos tipos de câncer, incluindo o câncer feminino e masculino de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pâncreas e melanoma ^3,4, uma série de estudos têm sido realizados para compreender a função biológica da proteína BRCA2. A maioria destes estudos são baseados em genética, principalmente devido a dificuldades técnicas na análise de uma proteína gigante como BRCA2. O método descrito aqui...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
BRCA2 siRNA	Dharmacon	L-003462-00	SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA
Ctrl siRNA	Dharmacon	D-001810-10-05	ON-TARGETplus Non-targeting Pool
Lipofectamine RNAiMAX Reagent	Life Technologies	13778075	Transfection Reagent
OPTI-MEM I Reduced Serum Medium	Life Technologies	31985-070	Medium for transfection procedure
NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 mm Gel precast	Life Technologies	EA0378	Gel for protein electrophoresis
NuPAGE LDS Sample buffer	Life Technologies	NP0007	Reagent for protein electrophoresis
NuPAGE Sample Reducing agent (10x)	Life Technologies	NP0004	Reagent for protein electrophoresis
NuPAGE Antioxidant	Life Technologies	NP0005	Reagent for protein electrophoresis
HiMark Pre-stained protein standard	Life Technologies	LC5699	Prestained marker for gel electrophoresis
XCell SureLoc Mini-Cell  System	Life Technologies	EI0002	Equipment for protein electrophoresis/transfer
NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer	Life Technologies	LA0041	Reagent for Western blotting
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010	Reagent for Western blotting
NuPAGE Transfer Buffer	Life Technologies	NP0006-1	Reagent for Western blotting
BRCA2 H-300 rabbit polyclonal antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-8326	1:300 dilution
Beta-tubulin monoclonal antibody	Sigma Aldrich	T4026-100UL	1:1000 dilution
Skim Milk powder	Sigma Aldrich	70166	Reagent for Western blotting
Tween-20	Sigma Aldrich	P1379	Reagent for Western blotting
SuperSignal West Pico/Femto Chemiluminescent Substrate	Pierce Thermo Scientific	34080/34096	Chemiluminescence system
PNT1A cells	SIGMA Aldrich (for ECACC)	95012614	PNT1A human, normal prostate epithelium immortalized with SV40
Nthy cells	SIGMA Aldrich (for ECACC)	90011609	Nthy-ori 3-1 Cell Line human, thyroid follicular epithelial cells
Cell Proliferation Kit I (MTT)	Roche	11465007001	Kit for cell proliferation assays