השתקת<em&gt; BRCA2</em&gt; לזיהוי פונקציות ביולוגיות-מוסדר BRCA2 רומן בתאי אדם בתרבית

Summary

Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented.

Abstract

השתקה של BRCA2 החלבון המדכא הסרטן וגילויה על ידי ניתוח ביוכימי קונבנציונלי מהווה אתגר טכני גדול בגלל הגודל הגדול של חלבון BRCA2 האנושי (כ 390 KDA). אנו מדווחים שינויים של פרוטוקולי transfection וimmunoblotting siRNA סטנדרטיים להשתיק BRCA2 האנושי ולזהות חלבון אנדוגני BRCA2, בהתאמה, בשורות תאי אפיתל אנושיות. צעדים עיקריים כוללים siRNA גבוה יחס מגיב transfection ושני סיבובים הבאים של transfection siRNA בתוך אותו הניסוי. באמצעות שינויים אלה ואחרים לפרוטוקול הסטנדרטי באופן עקבי להשיג השתקה יותר מ -70% מגן BRCA2 האנושי כמו להישפט על ידי immunoblotting ניתוח עם נוגדנים נגד BRCA2. בנוסף, denaturation של lysates התא ב 55 מעלות צלזיוס במקום C הקונבנציונלי 70-100 מעלות ואופטימיזציות טכניות אחרות של הליך immunoblotting לאפשר זיהוי חלבון BRCA2 שלם של אפילו ש"שen סכומים נמוכים מאוד של חומר מוצא זמינים או כאשר רמות ביטוי חלבון BRCA2 הן נמוכות מאוד. השתקה יעילה של BRCA2 בתאים אנושיים מציעה אסטרטגיה יקרה להפריע לפעילות של BRCA2 בתאים עם BRCA2 שלם, כוללים תאים סרטניים, לבחון מסלולים מולקולריים חדשים ותפקודים תאיים שעלולים להיות מושפע על ידי מוטציות BRCA2 פתוגניים בגידולים. העיבוד של פרוטוקול זה להשתקה וניתוח של חלבונים אחרים 'גדולים' כמו BRCA2 יעילים צריך להיות בר השגה בקלות.

Introduction

גן BRCA2 (רגישות לסרטן שד גן-2) מקודד לחלבון מדכא גידולים שממלא תפקיד מכריע בתיקון הפסקות פעמיים גדיל DNA על ידי המסדיר את התפקוד של אנזים recombinase ¹ Rad51. BRCA2 גם היה מעורב באפנון של שעתוק ובבקרת מחזור תא ^2. מוטציות בתאי מין בגן BRCA2 לגרום רגישות אוטוזומלית דומיננטית לסרטן שד ושחלות בנשים וסרטן הערמונית אצל גברים, כמו גם נטייה לסוגי סרטן אחרים ^3,4. עם זאת, למרות העלייה בסיכון בהתפתחות סרטן, מוטציות BRCA2 המדכאות או להפחית פונקצית BRCA2 עלול להפוך תאים סרטניים פגיעים יותר לתרופות כימותרפיות הגורמות לניזק לדנ"א ^5-7. סרטן סדיר להציג שיעור נמוך של מוטציות BRCA2 (<3%) למרות שרמות מופחתות של חלבון BRCA2 של אותרו בכמה סוגי הסרטן, טוען כי חלבון BRCA2עלול ללכת לאיבוד במהלך tumorigenesis בסרטן סדיר באמצעות מנגנונים שאינן מוטציה תלויה ^7,8. לכן, חשוב להבין באופן מלא פונקציות BRCA2 בהקשר של ביולוגיה של הסרטן, כמו גם בהגדרות ביולוגיות אחרות.

כלי רב עוצמה המשמש לזיהוי פונקציות רומן של גן בתאי יונקים הוא להשתיק את ביטויה. כדוגמא, ביטוי BRCA2 השתקה במגוון רחב של תאי האפיתל נורמלים הוביל לאחרונה לזיהוי של תפקוד רומן של BRCA2 כרגולטור של התנגדות anoikis, צעד חשוב ברכישה של תאים סרטניים יכולת פולשנית וגרורתי ^9. השתקת גנים יכולה להיות מושגת על ידי החדרת בתאים או RNA הקטן מפריע (si) או מולקולות RNA סיכה קצרה (SH) מיקוד הגן הספציפי. העוצמה הגבוהה של siRNA וקלות שימוש להפוך אותו לכלי המועדף להשתקת ניסויים שמטרתם תובנה חדשות תהליכים ביולוגיים קריטייםND לזהות מטרות טיפוליות חדשניות. עם זאת, מציאה יעילה של ביטוי גנים לא יכולה להיות ברת השגה בקלות לכל הגנים ויכולה להיות מאוד משתנה בהתאם לסוג התא. בגלל ירידה ברמות חלבון תאיות הוא הפנוטיפ הרלוונטי ביותר בחקירה, חשוב לכמת השתקת גנים על ידי immunoblotting ניתוח של מוצר הגן. עם כל כבוד זה, חלבון BRCA2 מציב אתגר נוסף: להיות חלבון גדול (כ 390 KDA), קשיים טכניים קיימים לאנליזה ביוכימית קונבנציונלית, כוללים immunoblotting.

אנו מדווחים כאן פרוטוקול מותאם להשתקה יעילה של BRCA2 בשורות תאי אפיתל אדם ולזיהוי מהיר ומוצלח חלבון BRCA2 מציאה ידי immunoblotting ניתוח.

Protocol

1. הכן את פתרונות siRNA

1. Resuspend 5 nmol של מקושקשת (Ctrl) ו -5 nmol של כדורים מיובשים BRCA2 siRNA במים RNase ללא 100 μl (ריכוז siRNA סופי: 50 מיקרומטר). זהו מניית siRNA וחייבים להיות מאוחסנים ב -20 ° C ב 10 aliquots μl.
2. קח aliquot של 10 μl ממניות siRNA ולהוסיף 40 μl מים RNase ללא להשיג הפתרון עובד 10 מיקרומטר siRNA. דילול זה חייב להיות מאוחסן ב -20 ° C עד לשימוש.
   הערה: הפתרון עובד siRNA לא צריך לעבור הקפאה / פשרה יותר מ 3 פעמים.

2. זריעה של שורות תאי אפיתל האדם

1. הסר את מדיום גידול משורות תאי אפיתל אדם גדלו כמו monolayers תא בצלחות תרבית רקמת חממה humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
2. לשטוף את התאים בצלחת פעם אחת עם RT PBS (10 מיליליטר של PBS לצלחת 100 מ"מ).
3. כדי לנתק את התאים מהצלחת,להוסיף 2 מיליליטר של טריפסין 0.25% / 0.53 פתרון mM EDTA ודגירה 3-5 דקות, תלוי בסוג התא.
4. לפני איסוף התאים מנותקים, לנטרל טריפסין על ידי הוספת 2 מיליליטר של מדיום גידול מלא המכיל 10% בסרום שור עוברי.
5. להעביר את תאי צינור 15 מיליליטר.
6. צנטריפוגה התאים ב320-330 XG במשך 3 דקות על 4 מעלות צלזיוס בהרוטור דלי מתנדנד.
7. Resuspend את כדורי תא ב5 מיליליטר של מדיום אנטיביוטיקה-חינם.
8. ספירת התאים תחת מיקרוסקופ בתא "שודד גופות או על ידי שימוש במערכת ספירה אוטומטית בהתאם להוראות היצרן.
9. זרעי התאים בצלחות 6-גם להיות מחוברים כ -80% לאחר 24 שעות (0.5-1 x10 ⁶ תאים ב 2 מיליליטר של מדיום לכל טוב). מספר תאים אופטימלי לזרע עשוי להשתנות בהתאם לשורות תאים הספציפיות וקצב הצמיחה.
   הערה: אל תוסיף אנטיביוטיקה במדיום בשלב זה בגלל אנטיביוטיקה שלילי להפריע ליעילות של transfeסיפורת. זה מאוד חשוב כי התאים במעברים נמוכים תרבות (<10) כדי להשיג יעילות גבוהה של transfection BRCA2 siRNA.

3. תאי Transfect עם siRNA

1. עשרים וארבע שעות לאחר ציפוי התאים, להמשיך בסיבוב הראשון של transfection.
   1. לדלל 6 μl של מגיב transfection שומנים מבוסס siRNA ספציפי ¹⁰ ב -130 μl של מדיום סרום מופחת.
   2. לדלל 3 μl של 10 מיקרומטר siRNA (30 pmol) ב -130 μl של מדיום סרום מופחת.
   3. מערבבים את siRNA המדולל עם מגיב transfection המדולל ודגירה של 5-10 דקות ב RT.
   4. במהלך הדגירה, להסיר את המדיום מן התאים ולהוסיף 2 מיליליטר של מדיום טרי מחומם מראש על 37 מעלות צלזיוס (ללא אנטיביוטיקה).
   5. הוסף 250 μl של המתחמים מגיב siRNA-transfection לתאים (סכום זה הוא לטוב אחד של צלחת 6-היטב).
   6. דגירה התאים בחממה humidified ב 3776; C עם 5% CO _2.
2. לאחר 24 שעות, להמשיך בסיבוב השני של transfection ידי חזרה על שלבי 3.1.1-3.1.5 עם השינוי הבא לצעד 3.1.2: לדלל 5 μl של 10 מיקרומטר siRNA (50 pmol) ב -130 μl של מדיום סרום מופחת.
   1. דגירה התאים במשך 1-2 ימים על 37 מעלות צלזיוס לפני הניתוח.
      הערה: שני סבבים של transfections ושימוש ביחס מגיב siRNA / transfection הגבוה בסיבוב השני הם חיוניים כדי לקבל יעילות גבוהה של השתקת BRCA2.

4. תאי Lyse לניתוח immunoblotting

1. הכן מאגר תמוגה טרי עם PBS (pH 7.4) המכיל 1% מאינם denaturing octylphenoxypolyethoxyethanol nonionic, חומרי הניקוי, pyrophosphate נתרן 5 מ"מ, orthovanadate נתרן 1 מ"מ, פלואוריד נתרן 10 מ"מ, פלואוריד phenylmethylsulfonyl 2 מ"מ, 10 מיקרוגרם / מיליליטר leupeptin, 10 מיקרוגרם / מיליליטר aprotinin. שמור את זה על קרח.
2. הסר את המדיום מן התאים וwאפרם פעם אחת עם PBS הקר (2 מיליליטר / טוב) בצלחת. כדי למנוע כל שריד PBS, להסיר אותו לחלוטין מהצלחת.
3. הוסף 200 μl של חיץ תמוגה היטב כל אחד.
   הערה: אם התאים צריכים לשמש גם למבחנים אחרים, trypsinize התאים כמתואר בשלב 2.1-2.6 וresuspend התאים במאגר / בינוני מתאימים בהתאם ליישום לשימוש.
4. בעדינות לסובב את הצלחת להפיץ באופן אחיד מאגר תמוגה ודגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C על הכתף.
5. לאסוף את lysate התא בצינור microcentrifuge על קרח באמצעות מגרד תא.
6. צנטריפוגה ב 17900 XG במשך 25 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולאסוף את supernatant בצינור חדש.
7. למדוד את ריכוז החלבון באמצעות assay חלבון זמין מסחרי על פי הוראות היצרן.

ניתוח immunoblotting 5. BRCA2

1. הכן את המאגר פועל על ידי דילול 50 מיליליטר של 20x טריס-אצטט SDS ב פועליםuffer (50 מ"מ tricine, 50 מ"מ טריס בסיס, 0.1% SDS, pH 8.24) עם 950 מיליליטר של מים מזוקקים.
2. הכן את המדגם באופן הבא: להוסיף 15 מיקרוגרם בסך הכל lysate תא, 5 μl של חיץ מדגם 4x מכיל סולפט dodecyl ליתיום ב- pH 8.4, 2 μl 10x מדגם סוכן צמצום (0.5 M DTT) של, ומאגר תמוגה לנפח סופי של 20 μl.
   הערה: פרוטוקול זה מאפשר זיהוי של BRCA2 בשורות תאים נורמלים גם בעת שימוש בכמות נמוכה יותר של חלבונים כולל (עד 5 מיקרוגרם).
3. לפגל דגימות ב 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   הערה: זה חיוני כדי להשתמש 55 מעלות צלזיוס. מאז חלבון BRCA2 הוא thermosensitive ^11, טמפרטורות denaturing גבוהות לגרום לאובדן של באורך מלא בשלמות (390 KDA) חלבון BRCA2 עקבי.
4. הקים את תא electrophoretic לפי הוראות היצרן.
5. טען את הדגימות ו -10 μl לסטנדרטים של חלבון משקל מולקולרי גבוה מראש צבעונית על ג'ל precasted (טריס-אצטט 3-8%) ולהפעיל ב 120 V לabמתוך 2 שעות ^12. לעצור את ריצת electrophoretic לפני הסמן הכחול kDa 55 משאיר את הג'ל precasted.
6. הכן את חיץ ההעברה עם 50 מיליליטר של 20x חיץ העברה, של מתנול 100% 100 מיליליטר ו -850 מיליליטר מים.
7. הפעל קרום PVDF (גודל נקבובית 0.45 מיקרומטר) על ידי השרייה במתנול 100% במשך 5 דקות, לשטוף עם מים מזוקקים ולאזן במאגר העברה לפחות במשך 5 דקות. משרים את ספוגים של מנגנון ההעברה בהעברת חיץ על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
8. כאשר electrophoretic הריצה נגמרה, להרכיב את הכריך בערימת ההעברה בהזמנה (מלמטה למעלה) הבאה: שלושה ספוגים רוויים במאגר העברה, גיליון נייר כיתה 3 מ"מ אחד רווי במאגר העברה, ג'ל, קרום PVDF הופעל, אחד 3 מ"מ גיליון נייר כיתה רווי במאגר העברה, שלושה ספוגים רוויים במאגר העברת ^13,14. הנח את המחסנית לתוך חלבוני המנגנון והעברה ב 350 מילי-אמפר לשעה 4 על 4 מעלות צלזיוס או 180 מילי-אמפר הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
   הערה: להיות BRCA2 חלבון גדול מאוד, זה הוא חיוני כדי להאריך את זמן העברה מהשעה 1 (כפי שהוצע על ידי היצרן ורוב פרוטוקולי העברה) 4 שעות או לילה על מנת להבטיח העברה של חלבוני משקל מולקולריים גבוהים מלאה. בנוסף, בשל הזמן ארוך העברה, זה הכרחי כדי לבצע את סופג בחדר קר ב 4 ° C כדי למזער התחממות יתר ולהקל פירוק כריך. מערכות העברת חצי יבשות הן לא טובות להעברת חלבונים גדולים.
9. לאחר העברה, לשטוף את הממברנה עם כפות, לחסום אותו במשך שעה 1 ב RT ב0.25% TBS-Tween (TBS-T) המכילה חלב ללא שומן 5% יבשים ובדיקת הלילה ב 4 ° C עם נוגדן הארנב polyclonal 30 μl אנטי-BRCA2 ( 200 מיקרוגרם / מיליליטר), בדילול מלא 9 מיליליטר TBS-T + 5% שומן חלב יבש [1: 300 (V / V) דילול].
10. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים (10 דקות כל אחד) עם כפות-T, אז דגירה המסנן עבור שעה 1 עם 1 μl של נוגדן נגד ארנב חזרת peroxidase מצומדות המשני מדולל ב 10 מיליליטר של TBS-T + 5% שומן חלב יבש. לאחר מכן, לשטוף את הממברנה שלוש פעמים (10 דקות כל אחד) עם כפות-T.
11. בצע immunodetection ידי ECL לחשוף חלבון BRCA2 באמצעות chemiluminescence המשופרת (ECL) מערבית סופג איתור מגיב, הבאים להוראות היצרן. דמיינו להקות immunochemiluminescent בסרטים ברזולוציה גבוהה ECL.
12. בצע immunodetection עם נוגדן לגן משק, כמו β-טובולין (55 KDA), באותו המסנן בקרת טעינה באמצעות נוגדנים חד שבטיים לβ-טובולין בדילול של 1: 1,000 (10 μl של נוגדן אנטי-טובולין ב 10 מיליליטר TBS-T + 5% חלב יבש ללא שומן) במשך שעה 1 ב RT. לשטוף דגירה נוגדנים משני כמתואר עבור BRCA2 (5.10-5.11), פרט לשימוש בחזרת אנטי עכבר peroxidase מצומדות במקום נוגדנים משני נגד ארנב.
13. לרכוש תמונה דיגיטלית של הסרטים הרשימו עם להקות immunochemiluminescent ולנתח את עוצמת הלהקה על ידי תוכנת ניתוח תמונה ייעודית (לדוגמא., ImageJ).

תוצאות

לפני שתמשיך עם assay ביולוגי / ביוכימי לבחון את ההשפעה של השתקת BRCA2 על פונקציות תא, הצעד הראשון הוא לאשר את הספציפיות של ההשתקה באמצעות siRNA מקושקשת (ללא מיקוד siRNA) זה לצד זה עם BRCA2 siRNA (איור 1 א ). חשוב לבצע סיבוב של transfection siRNA שני עם יחס גבוה siRNA / transfection כדי לקבל י?...

Discussion

בגלל מוטציות בתאי מין של עופרת גן BRCA2 לעלייה בסיכון למספר סוגי הסרטן, כוללים סרטן נשי וגברי השד, סרטן השחלות, סרטן הערמונית, סרטן לבלב, ולנומה ^3,4, מספר מחקרים נעשו על מנת להבין את התפקיד הביולוגי של חלבון BRCA2. רוב המחקרים האלה הם בעיקר מבוסס גנטיים בשל קשיים טכ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BRCA2 siRNA	Dharmacon	L-003462-00	SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA
Ctrl siRNA	Dharmacon	D-001810-10-05	ON-TARGETplus Non-targeting Pool
Lipofectamine RNAiMAX Reagent	Life Technologies	13778075	Transfection Reagent
OPTI-MEM I Reduced Serum Medium	Life Technologies	31985-070	Medium for transfection procedure
NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 mm Gel precast	Life Technologies	EA0378	Gel for protein electrophoresis
NuPAGE LDS Sample buffer	Life Technologies	NP0007	Reagent for protein electrophoresis
NuPAGE Sample Reducing agent (10x)	Life Technologies	NP0004	Reagent for protein electrophoresis
NuPAGE Antioxidant	Life Technologies	NP0005	Reagent for protein electrophoresis
HiMark Pre-stained protein standard	Life Technologies	LC5699	Prestained marker for gel electrophoresis
XCell SureLoc Mini-Cell  System	Life Technologies	EI0002	Equipment for protein electrophoresis/transfer
NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer	Life Technologies	LA0041	Reagent for Western blotting
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010	Reagent for Western blotting
NuPAGE Transfer Buffer	Life Technologies	NP0006-1	Reagent for Western blotting
BRCA2 H-300 rabbit polyclonal antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-8326	1:300 dilution
Beta-tubulin monoclonal antibody	Sigma Aldrich	T4026-100UL	1:1000 dilution
Skim Milk powder	Sigma Aldrich	70166	Reagent for Western blotting
Tween-20	Sigma Aldrich	P1379	Reagent for Western blotting
SuperSignal West Pico/Femto Chemiluminescent Substrate	Pierce Thermo Scientific	34080/34096	Chemiluminescence system
PNT1A cells	SIGMA Aldrich (for ECACC)	95012614	PNT1A human, normal prostate epithelium immortalized with SV40
Nthy cells	SIGMA Aldrich (for ECACC)	90011609	Nthy-ori 3-1 Cell Line human, thyroid follicular epithelial cells
Cell Proliferation Kit I (MTT)	Roche	11465007001	Kit for cell proliferation assays