Подавление<em&gt; BRCA2</em&gt; Для идентификации новых BRCA2-биологические функции регулируются в культивируемых клетках человека

Резюме

Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented.

Аннотация

Подавление в BRCA2 белка-супрессора опухоли и ее детектирования обычными биохимических анализов представляют собой большую техническую проблему из-за большого размера человеческого белка BRCA2 (приблизительно 390 кДа). Мы сообщаем модификации стандартных киРНК трансфекции и иммуноблоттинга протоколов, чтобы заставить замолчать человека BRCA2 и выявления эндогенной BRCA2 белок, соответственно, в клеточных линиях человека эпителиальных. Основные шаги включают в себя высокую миРНК соотношение реагентов трансфекции и два последующих раундов миРНК трансфекции в пределах того же эксперимента. Используя эти и другие модификации стандартного протокола мы последовательно достичь более 70% молчание гена BRCA2 человека, о чем судили с помощью иммуноблоттинга анализ с анти-антителами BRCA2. Кроме того, денатурации клеточных лизатов при 55 ° С вместо обычных 70-100 ° С и других технических оптимизации процедуры иммуноблоттинга позволяют обнаружение интактного белка BRCA2 даже WHан очень низких количеств исходного материала доступны, или когда уровни экспрессии белка BRCA2 очень низки. Эффективное глушение BRCA2 в клетках человека предлагает ценную стратегию, чтобы разрушить функцию BRCA2 в клетках с интактным BRCA2, в том числе опухолевых клеток, для изучения новых молекулярных путей и клеточные функции, которые могут быть затронуты патогенных мутаций BRCA2 в опухоли. Адаптация этого протокола для эффективного молчания и анализа других «больших» белков, таких как BRCA2 должны быть легко достижимы.

Введение

BRCA2 (рак молочной железы ген восприимчивости-2) ген кодирует белок-супрессор опухоли, который играет решающую роль в восстановлении ДНК двухцепочечной разрывы путем регулирования функцию рекомбиназы фермента Rad51 ^1. BRCA2 также вовлечен в модулирование транскрипции и в контроле клеточного цикла ^2. Зародышевой линии мутации в гене BRCA2 вызывают аутосомно-доминантный восприимчивость к рака груди и яичников у женщин и рака простаты у мужчин, а также предрасположенность к другим типам рака ^3,4. Тем не менее, несмотря на повышенный риск развития рака в BRCA2 мутации, которые подавляют или уменьшить функцию BRCA2 может оказать раковые клетки более уязвимыми для химиотерапевтических агентов, которые вызывают повреждение ДНК ^5-7. Отдельные виды рака обладают низкой скорости BRCA2 мутации (<3%), хотя более низкие уровни белка BRCA2 были обнаружены в некоторых видах рака, предполагая, что BRCA2 белокмогут быть потеряны во время онкогенеза в спорадических рака через не-мутационный-зависимых механизмов ^7,8. Таким образом, важно, чтобы полностью понять функции BRCA2 в контексте биологии рака, а также в других биологических параметрах.

Мощный инструмент, используемый для идентификации новых функций гена в клетках млекопитающих является, чтобы заглушить ее экспрессию. В качестве примера, глушителей BRCA2 выражение в различных нормальных эпителиальных клеток недавно привели к идентификации нового функцией BRCA2 как регулятора сопротивления anoikis, важный шаг в процессе приобретения раковых клеток инвазивного и метастатического способности ^9. Молчание генов может быть достигнуто путем введения в клетки либо мала вмешательства (SI) РНК или короткое шпильки (SH) молекулы РНК, нацеленные на конкретный ген. Высокая активность миРНК и простота в использовании делают его преимущественное инструмент для глушителей эксперименты, направленные на получение новых идей в критических биологических процессовго по идентификации новых терапевтических мишеней. Тем не менее, эффективность нокдаун экспрессии генов может быть легко достижимо для всех генов и может быть сильно варьирует в зависимости от типа клеток. Потому что снижение внутриклеточного уровня белка является наиболее актуальны фенотип под следствием, он имеет решающее значение для количественной оценки гена молчание иммуноблоттингом анализ генного продукта. С этой связи, белок BRCA2 представляет собой еще одну проблему: быть большой белок (примерно 390 кДа), технические трудности существуют для обычного биохимического анализа, в том числе иммуноблоттинга.

Мы сообщаем здесь протокол, оптимизированный для эффективного глушителей BRCA2 в клеточных линиях человека эпителиальных и для быстрого и успешного обнаружения BRCA2 белка нокдаун иммуноблоттингом анализ.

протокол

1. Готовят растворы миРНК

1. Ресуспендируют 5 нмоль зашифрованным (Ctrl) и 5 нмоль BRCA2 миРНК высушенных гранул в 100 мкл РНКазы воды (конечная концентрация миРНК: 50 мкм). Это запас миРНК и должны храниться при -20 ° C в 10 мкл аликвоты.
2. Возьмем аликвоту 10 мкл из запаса миРНК и добавить 40 мкл РНКазы свободной воды, чтобы получить рабочий раствор 10 мкМ миРНК. Это разбавление необходимо хранить при температуре -20 ° С до использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: рабочий раствор миРНК не должны подвергаться замораживанию / размораживания более чем в 3 раза.

2. Посев человека эпителиальных клеточных линиях

1. Удалить ростовой среды из эпителиальных клеточных линий человека растущих в клеточных монослоев в тканевых культуральных планшетах в увлажненном инкубаторе при 37 ° С, 5% СО _2.
2. Промыть клетки в тарелке с раз RT PBS (10 мл PBS для 100 мм пластины).
3. Для отделения клеток от пластины,добавляют 2 мл 0,25% трипсина / 0,53 мМ раствора ЭДТА и инкубировать 3-5 мин в зависимости от типа клеток.
4. Перед сбором отдельные клетки, нейтрализации трипсина добавлением 2 мл полной среды для роста, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки.
5. Передача клеток в 15 мл пробирку.
6. Центрифуга клеток при 320-330 мкг в течение 3 мин при 4 ° С в роторе Бакет.
7. Ресуспендируют клеточный пеллет в 5 мл антибиотиков среде без.
8. Граф клеток под микроскопом в камере Бюркера или с помощью автоматизированной системы подсчета в соответствии с инструкциями изготовителя.
9. Семенной клеток в 6-луночных планшетах, что около 80% сплошности, после 24 часов (0,5-1 x10 ⁶ клеток в 2 мл среды для каждой лунки). Оптимальное количество клеток, чтобы быть посеяны может изменяться в зависимости от конкретных клеточных линий и скорости роста.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавляйте антибиотики в среде в данный момент, потому что антибиотики негативно влиять на эффективность transfeие. Очень важно, что клетки при низких проходов культуры (<10) для достижения высокой эффективности трансфекции миРНК BRCA2.

3. трансфекции клеток с миРНК

1. Двадцать четыре часа после посева клеток, переходите с первого раунда трансфекции.
   1. Развести 6 мкл липидного основе ¹⁰ siРНК, специфичную реагента для трансфекции в 130 мкл восстановленного среде сыворотки.
   2. Развести 3 мкл 10 мкМ миРНК (30 пмоль) в 130 мкл восстановленного среде сыворотки.
   3. Смешайте разбавленный миРНК разбавленным трансфекции реагента и инкубировать в течение 5-10 мин при комнатной температуре.
   4. Во время инкубации, удалить носитель из клеток и добавить 2 мл свежей среды, предварительно нагретой при 37 ° С (без антибиотиков).
   5. Добавить 250 мкл миРНК-реагента для трансфекции комплексов к клеткам (эта сумма для одной лунке 6-луночного планшета с).
   6. Инкубируйте клетки в увлажненном инкубаторе при 3776; С с 5% СО _2.
2. После 24 часов, приступить втором туре трансфекции, повторяя шаги 3.1.1-3.1.5 со следующей модификацией для шага 3.1.2: разбавить 5 мкл 10 мкМ миРНК (50 пмоль) в 130 мкл восстановленного среды в сыворотке крови.
   1. Инкубируйте клетки в течение 1-2 дней при 37 ° С перед анализом.
      Примечание: Два раунда трансфекции и использование соотношении реагентов высокой миРНК / трансфекции во втором туре необходимы, чтобы получить высокую эффективность BRCA2 молчания.

4. Lyse клетки для анализа иммуноблоттинга

1. Приготовьте свежий лизирующего буфера с PBS (рН 7,4), содержащего 1% неионных, неденатурирующем моющего октилфеноксиполиэтоксиэтанол, 5 мМ пирофосфата натри, 1 мМ ортованадат натрия, 10 мМ фторид натрия, 2 мМ фенилметилсульфонилфторида, 10 мкг / мл лейпептина, 10 мкг / мл апротинина. Держите его на льду.
2. Удалить среду из клеток и Wпепел их один раз холодным PBS (2 мл / лунку) в пластине. Для предотвращения уноса PBS, полностью удалить его из пластины.
3. Добавить 200 мкл буфера для лизиса в каждую лунку.
   Примечание: Если клетки должны быть использованы и для других анализов, Trypsinize клетки, как описано в шаге 2.1-2.6 и ресуспендирования клеток в соответствующем буфере / среде в соответствии с применением, которые будут использоваться.
4. Осторожно повернуть пластину, чтобы равномерно распределить лизирующего буфера и инкубируют в течение 15 мин при 4 ° С на ротатора.
5. Собирают клеточный лизат в микроцентрифужных трубки на льду с помощью мобильного скребок.
6. Центрифуга при 17900 х г в течение 25 мин при 4 ° С и собирают супернатант в новую пробирку.
7. Измерьте концентрацию белка, используя имеющийся в продаже анализа белка в соответствии с инструкциями изготовителя.

5. BRCA2 анализ иммуноблотинг

1. Подготовьте работает буфер разбавления 50 мл 20x Трис-ацетат SDS работает бuffer (50 мМ Трицин, 50 мМ Трис-основание, 0,1% SDS, рН 8,24) с 950 мл дистиллированной воды.
2. Подготовка образца следующим образом: добавить 15 мкг общего клеточного лизата, 5 мкл 4х буфера для образцов, содержащих сульфат лития додецил при рН 8,4, 2 мкл 10Х образца восстановителем (0,5 М DTT) и буфера для лизиса до конечного объема 20 мкл.
   Примечание: Этот протокол позволяет обнаруживать BRCA2 в нормальных клеточных линиях также при использовании меньшего количества суммарных белков (до 5 мкг).
3. Денатурации образцов при 55 ° С в течение 10 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно, чтобы использовать 55 ° C. Так BRCA2 белок термочувствительный ^11, выше денатурации температура приводит к последовательной потере неповрежденной полной длины (390 кДа) BRCA2 белка.
4. Установите камеру электрофоретическую в соответствии с инструкциями изготовителя.
5. Загрузите образцы и 10 мкл с высокой молекулярной массой предварительно окрашенных белкового стандарта на precasted геля (Трис-ацетат 3-8%) и работать на 120 В для ABиз 2 ч ^12. Остановите электрофоретическую пробег, прежде чем 55 кДа синий маркер оставляет precasted гель.
6. Подготовка буфера передачи 50 мл 20x буфера передачи, 100 мл 100% метанола и 850 мл воды.
7. Активация PVDF мембрану (размер пор 0,45 мкм) путем замачивания в 100% метаноле в течение 5 мин, промыть дистиллированной водой и уравновешивают в буфере передачи, по меньшей мере в течение 5 мин. Замачивание губки передачи аппарата в буфере передачи при 4 ° С до использования.
8. При электрофоретического запустить закончилась, собрать бутерброд в стеке передачи в следующем порядке (снизу вверх): три губки, насыщенные в передаче буфера, один сорт 3 мм лист бумаги насыщен передачи буфера, геля, активированного PVDF мембрану, один 3ММ оценка лист бумаги насыщен передачи буфера, три губки насыщен передачи буфера ^13,14. Поместите стопку в устройство и передача белков при 350 мА в течение 4 ч при 4 ° С или при 180 мА в течение ночи при 4 ° С.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Существо BRCA2 очень большой белок, важно, чтобы продлить время передачи от 1 часа (как было предложено производителем и большинство протоколов передачи) до 4 часов или на ночь, чтобы обеспечить полную передачу белков высокой молекулярной массой. Кроме того, из-за длительного времени передачи, важно, чтобы выполнить блоттинга в холодной комнате при 4 ° С, чтобы свести к минимуму перегрев и облегчить сэндвич разборки. Полусухие системы передачи не хорошо для передачи больших белков.
9. После передачи, мыть мембрану с TBS, блокируют его в течение 1 часа при комнатной температуре в TBS-Tween 0,25% (TBS-T), содержащей 5% обезжиренное сухое молоко и зонд в течение ночи при 4 ° С с 30 мкл анти-BRCA2 поликлональное антитело кролика ( 200 мкг / мл), разводили в 9 мл ТБС-Т + 5% обезжиренное сухое молоко [1: 300 (объем / объем) разбавления].
10. Промыть мембраны три раза (10 мин каждый) с TBS-T, затем инкубируют фильтр в течение 1 часа с 1 мкл конъюгированного с пероксидазой хрена анти-кроличьего вторичного антитела разбавленных в 10 мл TBS-T + 5% обезжиренное сухое молоко. После этого промойте мембрану три раза (10 минут каждый) с TBS-T.
11. Выполните иммунологического по ECL выявить BRCA2 белок с помощью усиленной хемилюминесценции (ECL) Вестерн-блоттинга обнаружения реагента, следуя инструкциям изготовителя. Представьте immunochemiluminescent полосы на высокой разрешающей ECL фильмов.
12. Выполнение иммунологического с антителом для гена домашнего хозяйства, как β-тубулина (55 кДа), в тот же фильтр в качестве контроля загрузки с помощью моноклонального антитела к β-тубулина разбавленный в соотношении 1: 1000 (10 мкл анти-тубулина антителами в 10 мл ТБС-Т + 5% обезжиренное сухое молоко) в течение 1 ч при комнатной температуре. Промыть и инкубируют вторичное антитело, как описано в BRCA2 (5.10-5.11), для использования конъюгированного с пероксидазой хрена анти-мыши вместо анти-кроличьего вторичного антитела, за исключением.
13. Приобретите цифровое изображение фильмов впечатлен immunochemiluminescent полос и анализа интенсивности полосы программного обеспечения для анализа изображений выделенный (например,., ImageJ).

Результаты

Прежде чем приступить к биологической / биохимической анализе для изучения влияния BRCA2 молчания на клеточных функций, первым шагом является подтверждение специфичности молчания, используя зашифрованный миРНК (ненацеливании миРНК) бок о бок с BRCA2 миРНК (рис 1A ). Важно выпол...

Обсуждение

Потому что зародышевые мутации гена BRCA2 приводят к увеличению риска некоторых видов рака, в том числе женского и мужского рака молочной железы, рака яичников, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, меланомы и ^3,4, ряд исследований были предприняты, чтобы понять...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
BRCA2 siRNA	Dharmacon	L-003462-00	SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA
Ctrl siRNA	Dharmacon	D-001810-10-05	ON-TARGETplus Non-targeting Pool
Lipofectamine RNAiMAX Reagent	Life Technologies	13778075	Transfection Reagent
OPTI-MEM I Reduced Serum Medium	Life Technologies	31985-070	Medium for transfection procedure
NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 mm Gel precast	Life Technologies	EA0378	Gel for protein electrophoresis
NuPAGE LDS Sample buffer	Life Technologies	NP0007	Reagent for protein electrophoresis
NuPAGE Sample Reducing agent (10x)	Life Technologies	NP0004	Reagent for protein electrophoresis
NuPAGE Antioxidant	Life Technologies	NP0005	Reagent for protein electrophoresis
HiMark Pre-stained protein standard	Life Technologies	LC5699	Prestained marker for gel electrophoresis
XCell SureLoc Mini-Cell  System	Life Technologies	EI0002	Equipment for protein electrophoresis/transfer
NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer	Life Technologies	LA0041	Reagent for Western blotting
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010	Reagent for Western blotting
NuPAGE Transfer Buffer	Life Technologies	NP0006-1	Reagent for Western blotting
BRCA2 H-300 rabbit polyclonal antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-8326	1:300 dilution
Beta-tubulin monoclonal antibody	Sigma Aldrich	T4026-100UL	1:1000 dilution
Skim Milk powder	Sigma Aldrich	70166	Reagent for Western blotting
Tween-20	Sigma Aldrich	P1379	Reagent for Western blotting
SuperSignal West Pico/Femto Chemiluminescent Substrate	Pierce Thermo Scientific	34080/34096	Chemiluminescence system
PNT1A cells	SIGMA Aldrich (for ECACC)	95012614	PNT1A human, normal prostate epithelium immortalized with SV40
Nthy cells	SIGMA Aldrich (for ECACC)	90011609	Nthy-ori 3-1 Cell Line human, thyroid follicular epithelial cells
Cell Proliferation Kit I (MTT)	Roche	11465007001	Kit for cell proliferation assays