متزامنة<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; اختبار وظيفي اثنين من شبكية العين من قبل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; نظام مخطط كهربية

Summary

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Abstract

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Introduction

مخطط كهربية (أرج) هي تقنية راسخة والتي يمكن استخدامها لتسجيل النشاط الكهربائي للشبكية العين الناجم عن الضوء. يتم إنشاء إشارة أرج أساسا من تغيرات الجهد الناجم عن التيارات شعاعي (على طول محور مبصرات وخلايا ثنائية القطب) المتدفقة في الفضاء خارج الخلية مقاوم للشبكية. وسجلت أول إشارة أرج في عام 1865 من قبل هولمغرين من سطح العين الأسماك ^1. آينتهوفن وجولي 1908 ² تقسيم استجابة ERG إلى ظهور الضوء إلى ثلاث موجات مختلفة، ودعا أ، ب، ج-الأمواج، والتي هي معروفة الآن لتعكس أساسا على نشاط خلايا مستقبلة للضوء، ON خلايا ثنائية القطب، والظهارة الصبغية الخلايا على التوالي ^3-8. أرج يمكن تسجيلها من عيون الحيوانات تخدير أو البشر (في الجسم الحي)، من إعداد معزولة العين ^9، عبر شبكية العين سليمة المعزولة (خارج الجسم الحي) ^3،10-15 أو عبر طبقات الشبكية محددة مع الميكروية (المحليةأرج) ^4،16. هذه، في الجسم الحي أرج حاليا الوسيلة الأكثر استخداما على نطاق واسع لتقييم وظيفة الشبكية. وهو أسلوب موسع التي يمكن استخدامها لأغراض التشخيص أو لمتابعة تطور أمراض شبكية العين في الحيوانات أو المرضى. ومع ذلك، في الجسم الحي تسجيلات أرج تنتج إشارة معقدة مع العديد من المكونات متداخلة، غالبا ما تكون ملوثة بسبب الضوضاء خارج العين الفسيولوجية (على سبيل المثال، في التنفس ونشاط القلب).

أرج المحلية يمكن استخدامها لتسجيل إشارة عبر طبقات محددة من شبكية العين ولكنه هو الأكثر الغازية ويحتوي على نسبة أدنى إشارة إلى الضوضاء (SNR) بالمقارنة مع تكوينات أخرى تسجيل أرج. أرج المحلي هو أيضا يتطلب تقنية عالية وتتطلب معدات مكلفة (على سبيل المثال، المجهر وmicromanipulators). Transretinal أرج من سليمة، وشبكية العين معزولة (خارج الحي أرج) تقدم حلا وسطا بين في الجسم الحي وطرق أرج المحلية السماح مستقرة والمهزومةالتسجيلات ح SNR من شبكية العين سليمة من الحيوانات أو البشر ^17. في الآونة الأخيرة، وقد استخدمت هذه الطريقة بنجاح لدراسة قضيب والمخروط مبصرة وظيفة في الثدييات، الرئيسيات والإنسان شبكية العين ^18-20. بالإضافة إلى ذلك، نظرا لعدم وجود الظهارة الصبغية في شبكية العين خارج الحي، تتم إزالة عنصر ج الموجة الإيجابية للإشارة أرج وكشف سلبي بطيئة مكون PIII بارز في خارج الحي التسجيلات. وقد تبين المكون PIII بطيء أن تنشأ من نشاط الخلايا الدبقية مولر في شبكية العين ^21-23. وبالتالي، يمكن أن تستخدم أيضا خارج الحي طريقة أرج لدراسة الخلايا مولر في الشبكية سليمة. وقد أظهرت العديد من الدراسات يمكن أن تستخدم أيضا أن خارج الجسم الحي تسجيلات أرج لقياس تركيز كلاء الدوائية في جميع أنحاء شبكية العين ²⁴ واختبار سلامة وفعالية الأدوية ^25-27.

هم تجارية متعددة في أنظمة الجسم الحي المتاحة وتستخدم في العديد من المختبرات التي ليس لها بالضرورة خلفية الكهربية واسعة النطاق. في المقابل، والأجهزة فيفو السابقين لم تكن متاحة حتى وقت قريب ¹⁷ ونتيجة لذلك إلا عدد قليل جدا من المختبرات تجري حاليا الاستفادة من هذه التقنية قوية. وسيكون من المفيد لجعل التسجيلات خارج الحي أرج متاحة لمزيد من المختبرات من أجل المضي قدما معرفتنا علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض شبكية العين، وإلى تطوير علاجات جديدة للأمراض المسببة للعمى. علينا أن نظهر هنا جهاز بسيط وبأسعار معقولة خارج الحي أرج ¹⁷ وإظهار كيف يمكن أن تستخدم في تركيبة مع عدة متاحة تجاريا في أنظمة الجسم الحي أرج لتسجيل إشارات rod- وبوساطة مخروط (أ ب موجات) وظيفة خلايا مولر (بطيء PIII) من سليمة من النوع البري شبكية العين الماوس.

Protocol

وكانت جميع البروتوكولات التجريبية وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وتمت الموافقة من قبل لجنة الدراسات الحيوانية المؤسسية في جامعة واشنطن.

1. إعداد الإرواء وعينة حامل

1. إعداد حل لشبكية العين نضح جديدة في يوم التجربة. استخدام الماء المقطر ومنزوع الأيونات. استخدام أحد الحلول الثلاثة التالية.
   1. إعداد بيكربونات التي تحتوي على "حل (1 L): 1 زجاجة من أميس 'أميس وسائل الإعلام و 1.9 غرام من NaHCO _3،
   2. يعد حل لوك (مم): 112.5 كلوريد الصوديوم، و 3.6 بوكل، 2.4 MgCl _2، 1.2 CaCl _2، 10.0 HEPES، 20.0 NaHCO _3، 3.0 نا سوسينات، و 0.5 نا الصوديوم، 0.02 EDTA، و 10.0 الجلوكوز، 0.1٪ الفيتامينات MEM والأمينية الأحماض
   3. إعداد HEPES مخزنة حل قارع الأجراس (مم): 133.3 كلوريد الصوديوم، 3.3 بوكل، 2.0 MgCl _2، 1.0 CaCl _2، 10.0 الجلوكوز، 0.01 EDTA، 12.0 HEPES، ودرجة الحموضةتعديل إلى 7.5 مع ~ 5.8 مل من 1 M هيدروكسيد الصوديوم، إضافة 0،72 ز / L يبوفيتش مستنبت L-15. استخدام 20-50 ميكرومتر DL-AP4 و50-100 ميكرومتر بووتون ₂ لعزل استجابة مستقبلة للضوء مع أي وسيلة إعلامية الارواء.
2. يعد حل لأقطاب ²⁸ (مم): 140.0 كلوريد الصوديوم، و 3.6 بوكل، 2.4 MgCl _2، 1.2 CaCl _2، 3 HEPES، 0.01 EDTA وضبط درجة الحموضة إلى 7،4-7،5 مع هيدروكسيد الصوديوم. ويمكن تخزين الحل الكهربائي في RT لعدة أشهر.
3. إعداد واختبار حامل العينة.
   1. الغراء أسود / رمادي رقة الترشيح على رأس القباب من الجزء السفلي صاحب العينة (انظر الشكل 1A). نشر مركبين 5 دقائق الايبوكسي الغراء بعناية حول حواف قمم مسطحة من القباب. إذا لزم الأمر، أن تفعل ذلك تحت المجهر تشريح.
   2. انتظر حتى يجف الغراء تقريبا (حوالي 4 دقائق) واضغط على ورق الترشيح على القباب باستخدام عنصر ثابت. ورق الترشيح الغراء قبل التجربة بيوم واحد على الأقل. الورقة فلتر قابل للاستخدام عدة مرات ولكن يجب أن يتم استبدالها بعد شهر من التسجيلات. استخدام الايثانول 70٪ لتنظيف القباب بعناية من أي بقايا الغراء قبل تثبيت ورقة الاستبدال.
   3. ملء قنوات القطب مع الحل القطب محاولة لتجنب أي فقاعات الهواء والمسمار الأقطاب بيليه المغلقة مع محول مترابطة في قنوات القطب (أنظر الشكلين 1A و B). توصيل القطع العلوية والسفلية من صاحب العينة مع أربعة مسامير وملء خطوط نضح مع حل الكهربائي.
   4. قياس المقاومة والجهد بين الخيوط من كل زوج الكهربائي باستخدام المتعدد (الشكل 1B). يجب أن تكون مقاومة أقل من 100 Ωk والجهد أقل من 10 فولت اذا القنوات هي خالية من فقاعة والأقطاب هم في ظروف جيدة.
4. صب 400-700 مل من وسائل الاعلام نضح في زجاجة. تفصل 300 مل أخرى لاستخدامها في تشريح شبكية العين والصورةمزق بها في الثلاجة. تعيين أنابيب نضح في كتلة مبادل حراري ووضع كتلة محمى على لوحة التدفئة (انظر الشكل 1D).
5. ضع زجاجة مع غطاء أن لديه اتصالات في شركة ₂ / O ₂ الغاز (إذا تم استخدام أميس "أو لوك) ونضح أنابيب (انظر الشكل 1D). تسخين زجاجة مع وسائل الإعلام إلى 37 ^درجة مئوية ووضعه على لوحة التدفئة أو على رأس وحدة التحفيز الخفيفة في حمام مائي لتعيين 37-39 ^درجة مئوية ^(17).
   1. رئيس الخطوط نضح عن طريق ملء لهم مع وسائل الاعلام نضح لبدء تدفق يحركها الجاذبية.
      1. في نظام LKC، ضع زجاجة على رأس وحدة مشجعا ¹⁷ إلى توفير تدفق الجاذبية الكبير الذي يتم بعد ذلك تعديل من قبل المنظمين معدل تدفق دون أن تتأثر مستوى خفض الحل نضح في زجاجة أثناء التجربة.
      2. في نظام Ocuscience، ضع صزجاجة erfusion داخل قفص فاراداي للحد من الضوضاء ووضع خطوط الانتاج نضح طويل من صاحب العينة (راجع الخطوة 2.8) أقل بكثير من مستوى لصاحب العينة (وزجاجة رذاذ) إلى زيادة الدافع الجاذبية من الحل. حماية هذه الخطوط الانتاج وربط الدرع إلى أرض الواقع مكبر للصوت لمنع اقتران الضجيج الكهرومغناطيسي للإشارة أرج.
6. ضبط نضح إلى 3-5 مل / دقيقة باستخدام المنظمين معدل التدفق. ربط 5٪ CO _2/95٪ O ₂ الغاز من اسطوانة مع منظم السليم وضبط معدل تدفق لضمان محتدما مستمر من وسائل الإعلام في زجاجة من خلال حجر الهواء.

إعداد 2. عينة

1. تجميع أدوات تشريح نظيفة وحادة بما في ذلك microscissors البيضاء على التوالي، واحد أو اثنين 45 ^س ملاقط، شفرة حلاقة وقطعة مستطيلة من ورق الترشيح.
2. صب حوالي 200 مل من perfu الباردحل سيون في طبق بتري كبير بحيث يمكن أن تكون مغمورة في الجزء السفلي كله لصاحب العينة (بما في ذلك القباب) في الحل. تصبح هذه الخطوة الهامة عند تركيب شبكية العين على القباب (راجع الخطوة 2.6). على الرغم من أن تصميم بعض الحلول التي يمكن مشبعة كربوجين (5٪ CO _2/95٪ O _2)، وهذا ليس من الضروري لأغراض تشريح ولم يحدث في التجارب وصفها هنا.
3. لتجربة نموذجية، والحفاظ على الحيوانات في 12/12 ساعة مظلمة دورة / الضوء والظلام-تكييفها ل6-12 ساعة قبل التسجيلات. الموت ببطء الحيوانية CO ₂ الاستنشاق تليها خلع عنق الرحم تحت ضوء أحمر خافت والقيام بكل الإجراءات التالية تحت الحمراء خافت أو ضوء الأشعة تحت الحمراء (استخدم على سبيل المثال، مرشح أحمر أمام مصدر ضوء المجهر).
   1. سحب العينين من خلال استخدام ملاقط ووضعها في وسائل الإعلام. وضع العين في وقت واحد على قطعة صغيرة من الورق (على سبيل المثال، بعض ورق الترشيح العادية) وكما جعلمضاءة تقريبا على مستوى أورا مشرشر حين الضغط على العين مع ملاقط (يتم ذلك خارج من الحل هنا).
4. قطع على طول مشرشر أورا (أو أقرب إلى خط الاستواء من العين) مع microscissors وإزالة القرنية والعدسة. ضع الكأس العين في وسائل الإعلام البارد في طبق بتري كبير وكرر نفس الإجراء مع العين الأخرى.
5. قطع شق صغير من أعلى الكوب العين نحو العصب البصري عن طريق الحفاظ على مقص بين شبكية العين والصلبة من اجل الحفاظ على شبكية العين كما سليمة قدر الإمكان. قبضة الصلبة من كلا الجانبين من شق طريق استخدام اثنين من ملاقط وسحب ملاقط بعيدا عن بعضها البعض لفصل شبكية العين.
   1. قطع العصب البصري ومحاولة لعزل شبكية العين مع الحد الأدنى من الاتصال الجسدي إلى السطح البعيدة. سوف RPE فصل في الغالب تلقائيا من شبكية العين أثناء عملية التشريح. هو أكثر أهمية لتجنب اضطراب الميكانيكي للشبكية العين من لأداءتشريح بسرعة، وعادة شبكية العين يمكن تحضين 30 دقيقة على الأقل في حل من دون آثار كبيرة على خصائص الاستجابة.
6. تركيب شبكية العين على القباب لصاحب العينة (الشكل 1C). تزج الجزء السفلي من صاحب العينة في طبق بيتري مع شبكية العين تشريح. حرك الشبكية، جنبا مبصرة (السطح المحدب للشبكية العين معزولة) صعودا، فوق القبة ورفع صاحب العينة بحيث تعلق شبكية العين على ورقة الترشيح. كرر الإجراء لشبكية العين الأخرى.
7. تجف لوحة حامل بعناية لمنع تداخل الإشارات الكهربائية بين شبكية العين وكذلك الضوضاء وإشارة تحويلة. حامل العينة ديه O حلقات حول القباب الجزء السفلي لمنع تسرب حل بين الجزء السفلي وأجزاء العليا للحامل وكذلك للمساعدة في العزل الكهربائي من الجانبين مستقبلة للضوء والخلايا العقدية للشبكية العين الفردية. نعلق الجزء العلوي من حامل مع المسامير الأربعة (انظر الشكل 1B) وملء القنوات نضح مع حل نضح باستخدام حقنة وإبرة.
8. نقل صاحب العينة المقبل للحرارة كتلة المبادلات وربط المدخلات والمخرجات نضح خطوط لصاحب العينة (1D الشكل). توصيل الأقطاب الكهربائية إلى مكبر للصوت أرج (أعلى أقطاب الاتصال على الأرض / ناقص دبوس في مكبر للصوت) ونعلق وحدة مشجعا / السيطرة على حامل العينة باستخدام محول أو الانزلاق وسادة التدفئة في وحدة التحفيز والتشجيع واعتمادا على أي في الجسم الحي ويستخدم نظام أرج.

3. تسجيلات

1. تكوين إعدادات مكبر للصوت والتحفيز باستخدام برنامج نظام في الجسم الحي. ضبط وتيرة اكتساب إلى قيمة تتراوح بين 1 و 10 كيلو هرتز والمنخفضة تمرير تصفية إلى 300 هرتز. لا تستخدم عالية تمرير التصفية. استخدام 60 هرتز (أو 50 هرتز في أوروبا) الشق فلتر إذا لزم الأمر.
2. سجل خط الأساس دون التحفيز الخفيفة والطرافةح التحفيز خافت (على سبيل المثال، الضوء الأخضر من -35 ديسيبل أو 0.3 MCD SM ^-2) لاختبار الربط الكهربائي جيد بين الأقطاب وعينة شبكية العين. الانتظار 10-20 دقيقة قبل البدء في جمع البيانات بحيث درجة حرارة الشبكية وظيفة وصول إلى حالة مستقرة.
   1. اختيار المعلمات التحفيز وفقا لأية تجربة محددة والبدء في جمع البيانات. على سبيل المثال، استخدم الضوء الأخضر من -40 إلى 0 ديسيبل أو من 0.1 إلى 1000 MCD SM ^-2 لأسرة استجابة ظلامية. استخدام حوالي 2 إلى 3 وحدات سجل أكثر إشراقا ومضات في التسجيلات فوتوبيك حيث لها قضبان ليتم قمعها من قبل ضوء الخلفية (3-30 آلية التنمية النظيفة ^-2) أو التحقيق فلاش (حوالي 1.3 سم الكادميوم ^-2 = 1 ديسيبل، انظر الشكل 3).
   2. ومع ذلك، تذكر أن القيم شدة الضوء الدقيق قد يعتمد إلى حد ما على معايرة النظام الخاص بك والظروف التجريبية. وكقاعدة عامة من الإبهام، وشدة على نطاق وبنسبة 5-10 أضعاف مقارنة في الجسم الحي التسجيلات عند استخدام الضوء الأخضر ^17. A غطاء أسود مع فتحات فوق شبكية العين (المدرجة في نظام محول التجاري) يمكن استخدامها للحد من تشتت الضوء في حامل العينة وتسهيل التحفيز متجانس وعلى قدم المساواة على حد سواء شبكية العين من قبل فريق Ganzfeld المجال للالتجارية في الجسم الحي النظم.
      ملاحظة: للحصول على تسجيلات من شبكية العين الظلام تكييفها، وشدة ومضات الاختبار المستخدمة في التبييض تجربة نموذجية سوى جزء ضئيل من صبغة ذلك أن عدم وجود يحركها RPE تجديد ليست قضية. وبالإضافة إلى ذلك، فقد ثبت سابقا أن مخروط الصباغ تجديد لا تزال تجري في شبكية العين معزولة عن طريق خلية مولر دورة البصرية ^20.
3. كما التجارب تستمر عادة من 30 دقيقة تصل إلى عدة ساعات، ومراقبة الانجراف خط الأساس، ومستوى الضجيج والاستقرار استجابة أثناء التجربة على أنها تغييرات في هذه قد يشير إلى مشاكل فنية.
   ملاحظة: زيادة الضوضاء أو نقصانقد يشير سعة د استجابة فقاعات الهواء في القنوات نضح أو الكهربائي، ودرجة حرارة منخفضة جدا أو مرتفعة، حل تسرب / تسرب أو تشريد شبكية العين.

4. تنظيف

1. فصل حامل عينة من خطوط نضح، فتحه ومسح شبكية العين من ورقة الترشيح. إزالة الأقطاب وشطف لهم بالماء المقطر (لا تستخدم الإيثانول). تنظيف حامل العينة (بما في ذلك قنوات نضح) مع الإيثانول و / أو الماء المقطر. تدفق نضح أنابيب بعناية مع> 70٪ من الإيثانول.
2. شطف الزجاجة نضح بالماء المقطر (لا تستخدم المنظفات). الإيثانول يمكن أن تستخدم أيضا لتنظيف زجاجة.

النتائج

سجلنا الردود فلاش من الظلام تكييفها البرية من نوع (WT) C57BL / 6 شبكية العين الماوس عن طريق اتباع البروتوكولات التجريبية المذكورة أعلاه وموضح في الشكل 1 باستخدام مختلف الحلول نضح القياسية (الشكل 2). ويبدو أن الطول الموجي استجابة وحركية وكذلك حساسية المست?...

Discussion

علينا أن نظهر هنا الخطوات الحاسمة للحصول على جودة عالية السابقين التسجيلات الحية أرج في وقت واحد من اثنين من شبكية العين الماوس المعزولة باستخدام المكونات في الجسم الحي نظام أرج جنبا إلى جنب مع فيفو السابقين أرج محول. في هذه الدراسة نحن perfused لك...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
In vivo ERG system	OcuScience	HMsERG	www.ocuscience.us/id77.html
In vivo ERG system	LKC Technologies	UTAS-E 3000	www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html
Ex vivo adapter	OcuScience	Ex VIVO ERG adapter	www.ocuscience.us/id107.html
Dissection microscope	North Central Instruments	Leica M80	May use any brand
IR emitter	Opto Diode Corp.	OD-50L	www.optodiode.com
Prowler Night Vision Scopes	B.E. Meyers Electro Optics	D4300-I	Military grade product.
Red filter	Rosco Laboratories	Roscolux #27 Medium Red	May be used instead of IR system
Red head light	OcuScience	ERGX011	www.ocuscience.us/catalog/i29.html
Microscissors	WPI, Inc.	500086	www.wpiinc.com/
Dumont tweezers #5	WPI, Inc.	14101
Razor blades	Electron Microscopy Sciences	72000	www.emsdiasum.com
Scale	Metler Toledo	AB54-S/FACT	May use any brand
pH meter and electrode	Beckman Coulter	pHI 350	May use any brand
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	May use any brand
KCl	Sigma-Aldrich	60129	May use any brand
MgCl2	Sigma-Aldrich	63020	1.0 M solution
CaCl2	Sigma-Aldrich	21114	1.0 M solution
EDTA	Sigma-Aldrich	431788	May use any brand
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	May use any brand
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6297	May use any brand
Ames medium	Sigma-Aldrich	A1420	May use any brand
BaCl2	Sigma-Aldrich	B0750	May use any brand
DL-AP4	Tocris Bioscience	101	May use any brand
Succinic acid disodium salt	Sigma-Aldrich	224731	May use any brand
L-Glutamic acid	Sigma-Aldrich	G2834	May use any brand
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	May use any brand
Leibovitz culture medium L-15	Sigma-Aldrich	L4386	May use any brand
MEM vitamins	Sigma-Aldrich	M6895
MEM amino acids	Sigma-Aldrich	M5550
Carbogen	Airgas	UN3156	5% CO2