Simultaneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Test funzionale di due retine per<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Elettroretinogramma

Riepilogo

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Abstract

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Introduzione

Elettroretinogramma (ERG) è una tecnica ben consolidata che può essere utilizzato per registrare l'attività elettrica della retina innescata dalla luce. Il segnale ERG è generato principalmente dalle variazioni di tensione causate da correnti radiali (lungo l'asse dei fotorecettori e cellule bipolari) scorre nello spazio extracellulare resistivo della retina. Il primo segnale ERG è stato registrato nel 1865 dal Holmgren dalla superficie di un occhio di pesce ^1. Einthoven e Jolly 1908 ² diviso la risposta ERG all'insorgenza di luce in tre differenti onde, denominato a-, b-, e c-onde, che sono ormai noti per riflettere principalmente l'attività dei fotorecettori, cellule bipolari ON, e dell'epitelio pigmentato cellule, rispettivamente ^3-8. ERG può essere registrato dagli occhi di animali o esseri umani (in vivo) anestetizzati, dalla preparazione isolato occhio ^9, attraverso isolato retina intatto (ex vivo) ^3,10-15 o attraverso strati della retina specifici con i microelettrodi (localeERG) ^4,16. Di questi, in vivo ERG è attualmente il metodo più usato per valutare la funzione della retina. Si tratta di una tecnica non invasiva che può essere usato per scopi diagnostici o per seguire la progressione di malattie retiniche negli animali o pazienti. Tuttavia, in vivo registrazioni ERG producono un segnale complicato con diversi componenti sovrapposti, spesso contaminato da rumore extraocular fisiologico (ad esempio, la respirazione e l'attività cardiaca).

ERG locale può essere utilizzato per registrare il segnale attraverso strati specifici della retina ma è il più invasivo e ha il segnale-rumore più basso (SNR) rispetto alle altre configurazioni di registrazione ERG. ERG locale è anche tecnicamente impegnativo e richiede costose attrezzature (ad esempio, microscopio e micromanipolatori). Transretinal ERG dal intatto, isolato retina (ex vivo ERG) offre un compromesso tra in vivo e metodi ERG locali permettendo stabile e high SNR registrazioni da retine intatte di animali o esseri umani ^17. Recentemente, questo metodo è stato utilizzato con successo per studiare l'asta e cono fotorecettori funzione in mammiferi, primati e umani retine ^18-20. In aggiunta, a causa dell'assenza di dell'epitelio pigmentato in ex vivo retina, il componente c-onda positiva del segnale ERG viene rimosso e un componente importante negativo lento PIII è rivelato nelle ex vivo registrazioni. Il componente lenta PIII è stato dimostrato che provengono dalla attività delle cellule glia Müller nella retina ^21-23. Così, ex vivo metodo ERG potrebbe essere utilizzato anche per studiare le cellule Müller nella retina intatto. Diversi studi hanno anche dimostrato che ex vivo registrazioni ERG potrebbero essere utilizzati per misurare la concentrazione di agenti farmacologici in giro per la retina ²⁴ e testare la sicurezza e l'efficacia dei farmaci ^25-27.

Commerciale multipla sistemi in vivo sono disponibili eutilizzato in molti laboratori che non hanno necessariamente vasta elettrofisiologia sfondo. Al contrario, ex vivo dispositivi non sono stati disponibili fino a poco ¹⁷ e come risultato solo pochi laboratori sono attualmente in corso vantaggio di questa tecnica potente. Sarebbe utile per effettuare registrazioni ex vivo ERG disponibile per più laboratori per far avanzare le nostre conoscenze sulla fisiologia della retina e la patologia, e di sviluppare nuove terapie per le malattie accecante. Dimostriamo qui un dispositivo semplice ed economico ex vivo ERG ¹⁷ e mostriamo come può essere utilizzato in combinazione con diversi sistemi disponibili in commercio in vivo ERG per registrare la segnalazione Rod- e cono-mediata (a- e b-onde) e la funzione di cellule Müller (lenta PIII) da intatte retine di topo wild-type.

Protocollo

Tutti i protocolli sperimentali sono stati in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio e sono stati approvati dal Comitato istituzionale Animal Studies presso la Washington University.

1. Impostazione perfusione e Campione di laboratorio

1. Preparare la soluzione per perfusione retina fresco il giorno dell'esperimento. Utilizzare acqua distillata e deionizzata. Utilizzare una delle seguenti tre soluzioni.
   1. Preparare Bicarbonato contenenti 'soluzione (1 L): 1 bottiglia di Ames' Ames media e 1,9 g di NaHCO _3,
   2. Preparare la soluzione di Locke (in mM): 112.5 NaCl, 3.6 KCl, 2,4 MgCl _2, 1.2 CaCl _2, 10.0 HEPES, 20.0 NaHCO _3, 3.0 Na succinato, 0,5 Na glutammato, 0,02 EDTA, e 10,0 di glucosio, 0,1% vitamine MEM e ammino Acidi
   3. Preparare soluzione tamponata HEPES Ringer (in mM): NaCl 133,3, KCl 3,3, 2,0 MgCl _2, 1.0 CaCl _2, 10.0 glucosio, 0,01 EDTA, 12.0 HEPES, pHregolato a 7,5 con ~ 5,8 ml di 1 M NaOH, aggiungere 0,72 g / L Leibovitz mezzo di coltura L-15. Usare 20 - 50 mM DL-AP4 e 50 - 100 pM BaCl ₂ per isolare la risposta fotorecettore con qualsiasi mezzo di perfusione.
2. Preparare la soluzione per elettrodi ²⁸ (in mM): NaCl 140,0, KCl 3.6, 2.4 MgCl _2, 1.2 CaCl _2, 3, HEPES 0,01 EDTA e aggiustare il pH a 7,4-7,5 con NaOH. Soluzione elettrodo può essere conservata a temperatura ambiente per diversi mesi.
3. Preparare e testare il supporto del campione.
   1. Incollare il nero / carta grigia filtro in cima alle cupole della parte inferiore del titolare del campione (vedi Figura 1A). Distribuire accuratamente bicomponente 5 min colla epossidica intorno ai bordi delle cime piane delle cupole. Se necessario, farlo al microscopio dissezione.
   2. Attendere che la colla è quasi asciutto (circa 4 min) e premere la carta filtro cupole utilizzando un elemento piatta. Carta da filtro colla almeno un giorno prima dell'esperimento. Ilcarta da filtro può essere utilizzato più volte, ma deve essere sostituito dopo un mese di registrazioni. Usa il 70% di etanolo per pulire accuratamente cupole da eventuali residui di colla prima di installare la carta sostitutiva.
   3. Riempire i canali degli elettrodi con soluzione elettrodo cercando di evitare le bolle d'aria e vite elettrodi pellet chiusa con un adattatore filettato nei canali elettrodi (vedi figure 1 A e B). Collegare i superiore e inferiore pezzi del supporto del campione con quattro viti e riempire le linee di perfusione con soluzione elettrodi.
   4. Misurare la resistenza e la tensione tra i conduttori di ciascuna coppia di elettrodi con un multimetro (Figura 1B). La resistenza deve essere inferiore a 100 Ωk e la tensione sotto 10 mV se i canali sono senza bolle e gli elettrodi sono in buone condizioni.
4. Versare 400-700 ml di supporti perfusione nella bottiglia. Indipendente altri 300 ml da utilizzare nella dissezione di retine e sstrappò in un frigorifero. Impostare il tubo di perfusione nel blocco scambiatore di calore e posizionare il blocco preriscaldato sulla piastra di riscaldamento (vedi Figura 1D).
5. Racchiudere la bottiglia con un tappo che ha collegamenti di CO ₂ / O ₂ gas (se si usa Ames 'o Locke) e per le tubazioni perfusione (Figura 1D). Preriscaldare la bottiglia con il supporto a 37 ^o C e posizionarlo sulla piastra di riscaldamento o sulla parte superiore dell'unità stimolazione luminosa in bagnomaria a 37-39 ^{° C 17.}
   1. Prime linee di perfusione di riempimento d'supporti perfusione di avviare il flusso di gravità-driven.
      1. Nel sistema LKC, posizionare la bottiglia sulla parte superiore dell'unità stimolatore ¹⁷ per fornire un flusso gravitazionale significativo che viene poi regolata da regolatori di portata senza essere influenzato dal livello di riduzione della soluzione di perfusione nella bottiglia durante l'esperimento.
      2. Nel sistema di Ocuscience, posizionare il pbottiglia erfusion all'interno della gabbia di Faraday per minimizzare il rumore e posizionare linee di uscita lungo perfusione del portacampioni (vedi passo 2.8) ben al di sotto del livello del portacampioni (e bottiglia perfusione) per aumentare l'azionamento gravitazionale della soluzione. Schermare le linee di uscita e collegare lo schermo a terra dell'amplificatore per evitare l'accoppiamento del rumore elettromagnetico al segnale ERG.
6. Regolare la perfusione di 3 - 5 ml / min utilizzando regolatori di portata. Collegare 5% di CO _2/95% O ₂ gas da una bombola con una corretta regolazione e regolare la portata per garantire gorgoglio costante dei mezzi di comunicazione nella bottiglia attraverso una pietra d'aria.

Preparazione 2. campione

1. Montare gli strumenti di dissezione pulite e nitide compreso microscissors straight-lame, uno o due 45 ^o pinzette, lama di rasoio e un pezzo rettangolare di carta da filtro.
2. Versare circa 200 ml di perfu freddosoluzione sione in un grande piatto Petri in modo che tutta la parte inferiore del supporto del campione (comprese le cupole) può essere immerso nella soluzione. Questo passaggio diventa importante quando si monta la retina sui cupole (vedi punto 2.6). Sebbene alcune soluzioni sono progettate per essere saturo di CarboGen (5% CO _2/95% O _2), questo non è essenziale ai fini di dissezione e non è stato fatto negli esperimenti qui descritti.
3. Per un tipico esperimento, tenere gli animali in 12/12 ore scuro ciclo / luce e buio si adattano per 6-12 ore prima delle registrazioni. Euthanize l'animale da CO ₂ inalazione seguita da dislocazione cervicale sotto fioca luce rossa e fare tutte le seguenti procedure previste fioca luce rossa o IR (usare, ad esempio, il filtro rosso davanti alla sorgente luminosa del microscopio).
   1. Estrarre gli occhi con l'ausilio di una pinzetta e metterli nei media. Inserire un occhio per volta su un piccolo pezzo di carta (ad esempio, carta da filtro regolare) e fare comeilluminato approssimativamente il livello di ora serrata tenendo l'occhio con una pinzetta (questo è fatto di fuori della soluzione qui).
4. Tagliare lungo la serrata (o più vicino all'equatore dell'occhio) con microscissors e rimuovere la cornea e la lente. Posizionare l'oculare nei media freddo nella grande capsula di Petri e ripetere la stessa procedura con l'altro occhio.
5. Tagliare una piccola incisione dall'alto della tazza occhio verso il nervo ottico, mantenendo la forbice tra la retina e sclera per mantenere la retina intatto possibile. Grip sclera da entrambi i lati dell'incisione utilizzando due pinzette e tirare le pinzette distanti per staccare la retina.
   1. Tagliare il nervo ottico e tentare di isolare la retina con una quantità minima di contatto fisico alla superficie distale. RPE sarà principalmente staccare automaticamente dalla retina durante il processo di dissezione. È più importante evitare disturbo meccanico della retina che per eseguire ladissezione rapidamente, generalmente retine può essere incubato almeno 30 min in soluzione senza effetti significativi sulle proprietà di risposta.
6. Montare le retine sulle cupole del supporto del campione (Figura 1C). Immergere la parte inferiore del supporto del campione nella scatola di Petri con la retina sezionato. Scorrere la retina, fotorecettori lato (la superficie convessa della retina isolata) verso l'alto, sopra la cupola e sollevare il supporto del campione in modo che la retina attacca sulla carta da filtro. Ripetere la procedura per l'altro retina.
7. Asciugare con cura la piastra porta per evitare interferenze elettriche tra la retina, così come il rumore e il segnale shunt. Portacampione anelli O-ring intorno cupole parte inferiore per impedire soluzione fuoriuscita tra il fondo e le parti superiori del titolare, nonché per aiutare l'isolamento elettrico dei fotorecettori e cellule gangliari lati dei singoli retine. Fissare la parte superiore del supporto con le quattro viti (Figura 1B) e riempire i canali di perfusione con soluzione di perfusione utilizzando una siringa e un ago.
8. Trasferire il titolare del campione accanto al blocco scambiatore di calore e collegare le linee di ingresso e di uscita di perfusione al titolare del campione (Figura 1D). Collegare gli elettrodi all'amplificatore ERG (top elettrodi collegano alla terra / meno pin nel amplificatore) e collegare l'unità stimolatore / di controllo sul supporto del campione utilizzando un adattatore o far scorrere la piastra elettrica nell'unità stimolatore a seconda di quale in vivo Sistema ERG è utilizzato.

3. Registrazioni

1. Configurare le impostazioni dell'amplificatore e di stimolo utilizzando il software del sistema in vivo. Impostare la frequenza di acquisizione di un valore compreso tra 1 e 10 kHz e filtrazione passabasso a 300 Hz. Non utilizzare il filtro passa-alto. Utilizzare 60 Hz (o 50 Hz in Europa) segnare il filtro, se necessario.
2. Record di base senza stimolazione luminosa e lo spiritoh stimolazione dim (ad es., la luce verde di -35 dB o 0.3 mCd sm ^-2) per testare per buon collegamento elettrico tra gli elettrodi e il campione retina. Attendere 10 - 20 min prima di iniziare la raccolta di dati in modo che la temperatura e la funzione retinica raggiungere uno stato stabile.
   1. Scegli i parametri di stimolo secondo qualsiasi esperimento specifico e avviare la raccolta dei dati. Ad esempio, utilizzare la luce verde da -40 a 0 dB o da 0,1 fino a 1.000 mCd sm ^-2 per una famiglia risposta scotopic. Usa circa 2 a 3 log-unità più luminoso lampeggia registrazioni fotopiche dove aste devono essere soppressi dalla luce di fondo (3-30 Cdm ^-2) o un'unità flash sonda (circa 1,3 Cd sm ^-2 = 1 dB, vedi figura 3).
   2. Tuttavia, ricordare che gli esatti valori di intensità della luce potrebbe essere un po 'dipende dal sistema di calibrazione e condizioni sperimentali. Come regola generale, le intensità di scala in calo di 5 - 10 volte rispetto a in vivo registrazioni quando si utilizza la luce verde ^17. Un coperchio nero con aperture sopra la retina (inclusi nel sistema adattatore commerciale) può essere utilizzato per ridurre la dispersione della luce nel portacampioni e facilitare omogenea e stimolo uguale dei due retine dalla sfera Ganzfeld dei sistemi commerciali in vivo.
      NOTA: Per le registrazioni di retina adattata al buio, le intensità dei lampi di prova utilizzati in un tipico esperimento di candeggina solo una frazione trascurabile del pigmento in modo che la mancanza di rigenerazione RPE-driven non è un problema. Inoltre, è stato precedentemente dimostrato che la rigenerazione pigmento cono può ancora avvenire nella retina isolata mediante la cella Müller ciclo visivo ^20.
3. Come esperimenti durano in genere da 30 minuti fino a diverse ore, monitorare la deriva della linea di base, il livello di rumore e la stabilità di risposta durante l'esperimento come movimenti di questi potrebbero indicare problemi tecnici.
   NOTA: L'aumento o la diminuzione del rumoreampiezze d risposta possono indicare bolle d'aria nei canali di perfusione o elettrodi, troppo bassa o alta temperatura, la soluzione di perdita / fuoriuscita o spostamento della retina.

4. Pulizia

1. Staccare il supporto del campione dalle linee di perfusione, aprirlo e lavare la retina dalla carta da filtro. Rimuovere gli elettrodi e sciacquare con acqua distillata (non utilizzare etanolo). Pulire il supporto del campione (compresi i canali di perfusione) con etanolo e / o di acqua distillata. Tubazione perfusione Lavare accuratamente con> 70% di etanolo.
2. Sciacquare la bottiglia di perfusione con acqua distillata (non utilizzare detergenti). L'etanolo può essere utilizzata anche per pulire la bottiglia.

Risultati

Abbiamo registrato risposte flash di tipo selvaggio adattata al buio (WT) C57BL / 6 retine topo seguendo i protocolli sperimentali sopra descritte ed illustrate in figura 1 utilizzando diverse soluzioni standard di perfusione (Figura 2). Le forme d'onda di risposta e la cinetica e sensibilità bastoncelli apparsi simili in Ames 'e mezzi di Locke (Figura 2A e B). D'altra parte, in soluzione di Ringer HEPES-buffered (senza bicarbonato o 5% CO ...

Discussione

Dimostriamo qui i passaggi critici per l'ottenimento di alta qualità ex registrazioni vivo ERG contemporaneamente da due retine isolate del mouse utilizzando componenti in vivo del sistema ERG insieme ad un ex vivo adattatore ERG. In questo studio abbiamo perfusione entrambe le retine da animali con la stessa soluzione (sia Ames ', Locke o Ringer), ma è anche possibile perfusione ogni retina con una soluzione diversa per esempio, a scopo di test di droga. I pa...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
In vivo ERG system	OcuScience	HMsERG	www.ocuscience.us/id77.html
In vivo ERG system	LKC Technologies	UTAS-E 3000	www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html
Ex vivo adapter	OcuScience	Ex VIVO ERG adapter	www.ocuscience.us/id107.html
Dissection microscope	North Central Instruments	Leica M80	May use any brand
IR emitter	Opto Diode Corp.	OD-50L	www.optodiode.com
Prowler Night Vision Scopes	B.E. Meyers Electro Optics	D4300-I	Military grade product.
Red filter	Rosco Laboratories	Roscolux #27 Medium Red	May be used instead of IR system
Red head light	OcuScience	ERGX011	www.ocuscience.us/catalog/i29.html
Microscissors	WPI, Inc.	500086	www.wpiinc.com/
Dumont tweezers #5	WPI, Inc.	14101
Razor blades	Electron Microscopy Sciences	72000	www.emsdiasum.com
Scale	Metler Toledo	AB54-S/FACT	May use any brand
pH meter and electrode	Beckman Coulter	pHI 350	May use any brand
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	May use any brand
KCl	Sigma-Aldrich	60129	May use any brand
MgCl2	Sigma-Aldrich	63020	1.0 M solution
CaCl2	Sigma-Aldrich	21114	1.0 M solution
EDTA	Sigma-Aldrich	431788	May use any brand
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	May use any brand
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6297	May use any brand
Ames medium	Sigma-Aldrich	A1420	May use any brand
BaCl2	Sigma-Aldrich	B0750	May use any brand
DL-AP4	Tocris Bioscience	101	May use any brand
Succinic acid disodium salt	Sigma-Aldrich	224731	May use any brand
L-Glutamic acid	Sigma-Aldrich	G2834	May use any brand
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	May use any brand
Leibovitz culture medium L-15	Sigma-Aldrich	L4386	May use any brand
MEM vitamins	Sigma-Aldrich	M6895
MEM amino acids	Sigma-Aldrich	M5550
Carbogen	Airgas	UN3156	5% CO2