Simultáneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Pruebas funcionales de dos retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Electrorretinograma

Resumen

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Resumen

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Introducción

Electrorretinograma (ERG) es una técnica bien establecida que puede utilizarse para registrar la actividad eléctrica de la retina provocado por la luz. La señal de ERG se genera principalmente por cambios de voltaje causadas por las corrientes radiales (a lo largo del eje de los fotorreceptores y células bipolares) que fluye en el espacio extracelular resistiva de la retina. La primera señal de ERG fue grabado en 1865 por Holmgren desde la superficie de un ojo de pez ^1. Einthoven y Jolly 1908 ² dividen la respuesta ERG a la aparición de la luz en tres ondas diferentes, llamado a-, b-, y c-ondas, que ahora se conoce para reflejar principalmente la actividad de los fotorreceptores, células bipolares EN, y el epitelio de pigmento células, respectivamente ^3-8. ERG se puede grabar desde los ojos de animales o humanos (in vivo) anestesiados, desde aislada preparación ojo ^9, a través de la retina intacta aislada (ex vivo) ^3,10-15 oa través de las capas de la retina específicas con microelectrodos (localERG) ^4,16. De estos, in vivo ERG es actualmente el método más utilizado para evaluar la función de la retina. Es una técnica no invasiva que se puede utilizar con fines de diagnóstico o para seguir la progresión de enfermedades de la retina en animales o pacientes. Sin embargo, en vivo grabaciones ERG producen una señal compleja con varios componentes superpuestos, a menudo contaminados por el ruido extraoculares fisiológico (por ejemplo, la respiración y la actividad cardíaca).

ERG local se puede utilizar para grabar la señal a través de capas específicas de la retina, pero es el más invasivo y tiene la relación más baja de señal a ruido (SNR) en comparación con las otras configuraciones de grabación de ERG. ERG local también es técnicamente exigente y requiere equipos costosos (por ejemplo, microscopio y micromanipuladores). Transretinal ERG de la intacto, aislado retina (ex vivo ERG) ofrece un compromiso entre in vivo y métodos locales ERG permitiendo estable y higgrabaciones h SNR de retinas intactas de animales o seres humanos ^17. Recientemente, este método ha sido utilizado con éxito para estudiar varilla y fotorreceptor cono función en retinas de mamíferos, primates y humanos ^18-20. Además, debido a la ausencia de epitelio pigmentario de la retina ex vivo, se retira el componente de la onda c positivo de la señal de ERG y un componente prominente PIII lento negativo se revela en las grabaciones ex vivo. El componente lento PIII se ha demostrado que proceden de la actividad de las células gliales de Müller en la retina ^21-23. Por lo tanto, ex vivo ERG método también podría ser usado para estudiar las células de Müller en la retina intacta. Varios estudios también han demostrado que los ex vivo grabaciones ERG se podrían utilizar para medir la concentración de agentes farmacológicos alrededor de la retina ²⁴ y probar la seguridad y eficacia de los fármacos ^25-27.

Comercial múltiple en sistemas in vivo están disponibles yutilizado en muchos laboratorios que no necesariamente tienen amplia experiencia electrofisiología. En contraste, los dispositivos ex vivo no han estado disponibles hasta hace poco ¹⁷ y como resultado sólo muy pocos laboratorios están tomando actualmente ventaja de esta técnica de gran alcance. Sería beneficioso para hacer grabaciones ex vivo ERG a disposición de más laboratorios con el fin de avanzar en nuestro conocimiento sobre la fisiología de la retina y la patología, y desarrollar nuevas terapias para enfermedades que causan ceguera. Se demuestra aquí una sencilla y asequible dispositivo ex vivo ERG ¹⁷ y mostrar cómo se puede utilizar en combinación con varios sistemas vivo ERG disponibles en el mercado para grabar en la señalización de varilla y el cono mediada (a- y b-ondas) y la función de las células de Müller (lento PIII) desde intactas las retinas de ratones de tipo salvaje.

Protocolo

Todos los protocolos experimentales fueron de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por la Comisión de Estudios de Animales institucional de la Universidad de Washington.

1. Configuración de la perfusión y de muestras

1. Preparar la solución para perfusión retina fresco en el día del experimento. Utilice agua destilada y desionizada. Utilice una de las tres soluciones siguientes.
   1. Prepare Bicarbonato que contiene "solución (1 L): 1 botella de Ames Ames medios de comunicación y 1,9 g de NaHCO _3,
   2. Preparar la solución de Locke (en mM): 112,5 NaCl, 3,6 KCl, 2,4 MgCl _2, 1,2 CaCl _2, 10,0 HEPES, 20,0 NaHCO _3, 3,0 Na succinato, 0,5 Na glutamato, 0,02 EDTA, y 10,0 glucosa, 0,1% de vitaminas MEM y amino ácidos
   3. Solución de Ringer tamponada con HEPES Preparar (en mM): NaCl 133,3, KCl 3,3, 2,0 _MgCl2, 1,0 CaCl _2, 10,0 glucosa, 0,01 EDTA, 12,0 HEPES, pHajustado a 7,5 con ~ 5,8 ml de NaOH 1 M, añadir 0,72 g / L de medio de cultivo Leibovitz L-15. Utilice 20 - 50 M DL-AP4 y 50 - 100 mM BaCl ₂ para aislar la respuesta de los fotorreceptores con cualquier medio de perfusión.
2. Preparar la solución para los electrodos ²⁸ (en mM): NaCl 140,0, KCl 3,6, 2,4 _MgCl2, 1,2 CaCl _2, 3, HEPES 0,01 EDTA y ajustar el pH a 7.4 a 7.5 con NaOH. Solución de electrodo se puede almacenar a temperatura ambiente durante varios meses.
3. Preparar y poner a prueba el soporte de la muestra.
   1. Pegue el papel de filtro negro / gris en la parte superior de las cúpulas de la parte inferior del soporte de la muestra (ver Figura 1 A). Spread de dos componentes 5 min pegamento epoxi cuidadosamente alrededor de los bordes de las tapas planas de las cúpulas. Si es necesario, hacerlo bajo microscopio de disección.
   2. Espere hasta que el pegamento es casi seco (unos 4 minutos) y pulse el papel de filtro en las cúpulas utilizando un elemento plano. Papel de filtro pegamento al menos un día antes del experimento. Lospapel de filtro se puede utilizar varias veces, pero debe ser reemplazado después de un mes de grabaciones. Utilice etanol al 70% para limpiar cuidadosamente las cúpulas de cualquier residuo de pegamento antes de instalar el papel de sustitución.
   3. Llenar los canales de electrodos con una solución de electrodo tratando de evitar las burbujas de aire y el tornillo electrodos de pellets cerrados con un adaptador roscado en los canales de los electrodos (ver figuras 1A y B). Conecte las piezas superior e inferior del soporte de la muestra con cuatro tornillos y llenar las líneas de perfusión con solución de electrodo.
   4. Medir la resistencia y la tensión entre los conductores de cada par de electrodos con un multímetro (Figura 1B). La resistencia debe ser inferior a 100 Ωk y la tensión por debajo de 10 mV si los canales son sin burbujas y los electrodos están en buenas condiciones.
4. Verter 400 a 700 ml de medio de perfusión en la botella de vidrio. Separar otros 300 ml a utilizar en la disección de las retinas y sla rompió en una nevera. Ajuste el tubo de perfusión en el bloque intercambiador de calor y coloque el bloque precalentado en la placa de calefacción (ver Figura 1D).
5. Incluya la botella con una tapa que tiene conexiones a CO ₂ / O ₂ gas (si se utiliza de Ames o Locke) y para la tubería de perfusión (ver Figura 1D). Precaliente la botella con los medios de comunicación a 37 ^o C y colocarlo en la placa de calentamiento o en la parte superior de la unidad de estimulación de la luz en el baño de agua a 37-39 ^{° C 17.}
   1. Primer de las líneas de perfusión llenándolos de medios de perfusión para iniciar el flujo por gravedad.
      1. En el sistema de LKC, colocar la botella en la parte superior de la unidad estimuladora ¹⁷ para proporcionar un flujo gravitacional significativo que se ajusta entonces por los reguladores de caudal sin ser afectado por el nivel de reducción de la solución de perfusión en la botella durante el experimento.
      2. En el sistema Ocuscience, coloque el perfusion botella dentro de la jaula de Faraday con el fin de minimizar el ruido y colocar líneas de salida largo de perfusión desde el portamuestras (véase el paso 2.8) muy por debajo del nivel del soporte de la muestra (y la botella de perfusión) para aumentar la unidad gravitatoria de la solución. Proteja estas líneas de salida y conectar el blindaje a tierra del amplificador para evitar el acoplamiento del ruido electromagnético a la señal de ERG.
6. Ajuste la perfusión de 3-5 ml / min mediante el uso de reguladores de caudal. Conecte 5% de CO _2/95% O ₂ gas de un cilindro con regulador adecuado y ajustar el caudal para garantizar burbujeo constante de los medios de comunicación en la botella a través de un difusor de aire.

Preparación 2. Muestra

1. Ensamble instrumentos de disección limpias y afiladas incluyendo micro tijeras con filo recto, uno o dos de 45 ^o pinzas, cuchillas de afeitar y una pieza rectangular de papel de filtro.
2. Vierta aproximadamente 200 ml de perfu fríaSion solución en una gran placa de Petri de modo que toda la parte inferior del soporte de muestra (incluyendo las cúpulas) se puede sumergir en la solución. Este paso es importante cuando el montaje de las retinas de las cúpulas (véase el paso 2.6). Aunque algunas soluciones están diseñadas para ser saturado con carbógeno (5% de _CO2 / 95% de O _2), esto no es esencial para los fines de disección y no se hizo en los experimentos descritos aquí.
3. Para un experimento típico, mantener a los animales en 12/12 horas ciclo de oscuridad / luz y la oscuridad-adaptarlos por 6 - 12 horas antes de las grabaciones. La eutanasia a los animales por inhalación de CO ₂ seguido por dislocación cervical bajo tenue luz roja y hacer todos los siguientes procedimientos previstos en luz roja o infrarrojos dim (utilizar por ejemplo, el filtro rojo delante de la fuente de luz del microscopio).
   1. Tire de los ojos mediante el uso de pinzas y los puso en los medios de comunicación. Coloque un ojo a la vez en un pequeño pedazo de papel (por ejemplo, un poco de papel de filtro regular) y hacer comoiluminado aproximadamente en el nivel de ora serrata mientras sostiene el ojo con unas pinzas (esto se hace fuera de la solución aquí).
4. Corte a lo largo de la ora serrata (o más cerca del ecuador del ojo) con micro tijeras y retire la córnea y el cristalino. Coloque el ocular en los medios de frío en la gran placa de Petri y repita el mismo procedimiento con el otro ojo.
5. Cortar una pequeña incisión de la parte superior de la copa para el ojo hacia el nervio óptico manteniendo las tijeras entre la retina y la esclerótica con el fin de mantener la retina tan intacto como sea posible. Grip la esclerótica de ambos lados de la incisión mediante el uso de dos pinzas y tire de las pinzas de distancia el uno del otro para separar la retina.
   1. Cortar el nervio óptico y tratar de aislar a la retina con una mínima cantidad de contacto físico con la superficie distal. RPE será principalmente separar automáticamente de la retina durante el proceso de disección. Es más importante para evitar la perturbación mecánica de la retina que para realizar ladisección rápidamente, generalmente retinas se puede incubar al menos 30 min en la solución sin efectos significativos sobre las propiedades de respuesta.
6. Montar las retinas de las cúpulas del portamuestras (Figura 1C). Sumergir la parte inferior del portamuestras en la placa de Petri con las retinas disecadas. Deslizar la retina, lado fotorreceptor (la superficie convexa de la retina aislada) hacia arriba, por encima de la cúpula y levantar el soporte de la muestra de modo que la retina se fija en el papel de filtro. Repita el procedimiento para el otro retina.
7. Secar la placa de soporte con cuidado para evitar la diafonía eléctrica entre las retinas así como el ruido y la señal de derivación. Portamuestras tiene juntas tóricas alrededor de la parte inferior cúpulas para evitar derrame de solución entre la parte inferior y superior del soporte, así como para ayudar a la separación galvánica de los fotorreceptores y células ganglionares lados de las retinas individuales. Coloque la parte superior del soporte con los cuatro tornillos (véase la Figura 1B) y llenar los canales de perfusión con solución de perfusión utilizando una jeringa y una aguja.
8. Transferir el portamuestras junto al bloque intercambiador de calor y conectar las líneas de entrada y salida de perfusión en el soporte de la muestra (Figura 1D). Conectar los electrodos al amplificador ERG (electrodos superiores conectan al suelo / menos pasador en el amplificador) y adjuntar la unidad estimulador / control en el soporte de la muestra mediante el uso de un adaptador o deslice la almohadilla eléctrica en la unidad estimulador dependiendo de la in vivo se utiliza el sistema ERG.

3. Grabaciones

1. Configure los ajustes del amplificador y de estímulo mediante el uso de software del sistema en vivo. Ajuste la frecuencia de adquisición a un valor entre 1 y 10 kHz y de paso bajo filtrando a 300 Hz. No utilizar el filtrado de paso alto. Utilice 60 Hz (o 50 Hz en Europa) muesca filtro si es necesario.
2. La línea de base de registro y sin estimulación de la luz y el ingenioh tenue estimulación (por ejemplo., luz verde de -35 dB o 0,3 mCd sm ^-2) para probar la buena conexión eléctrica entre los electrodos y muestra de retina. Espere 10 a 20 min antes de iniciar la recogida de datos de manera que la temperatura y la función de la retina llegan a un estado estable.
   1. Elija los parámetros de estímulo de acuerdo con cualquier experimento específico y comenzar la recolección de datos. Por ejemplo, utilice la luz verde de -40 hasta 0 dB o de 0,1 hasta 1000 mCd sm ^-2 para una familia respuesta escotópica. Utilice cerca de 2 a 3 log-unidades más brillantes destellos en grabaciones fotópicas donde las barras tienen que ser suprimida por la luz de fondo (3-30 Cdm ^-2) o un flash de la sonda (aproximadamente 1,3 Cd sm ^-2 = 1 dB, ver Figura 3).
   2. Sin embargo, recuerde que los valores de intensidad de luz exactas podrían ser algo dependiente de la calibración del sistema y de las condiciones experimentales. Como regla general, las intensidades de escala hacia abajo por 5 a 10 veces en comparación con in vivo grabaciones cuando se utiliza luz verde ^17. Una cubierta de negro con aberturas por encima de las retinas (incluidos en el sistema de adaptador comercial) se puede utilizar para reducir la dispersión de luz en el soporte de la muestra y facilitar la estimulación homogénea e igualitaria de ambas retinas por la esfera Ganzfeld del comercial en vivo sistemas.
      NOTA: Para grabaciones de retina adaptada a la oscuridad, las intensidades de destellos de prueba utilizados en un experimento típico blanqueador sólo una fracción insignificante del pigmento de modo que la falta de regeneración RPE-impulsado no es un problema. Además, se ha demostrado previamente que la regeneración pigmento cono todavía puede tener lugar en la retina aislado a través del ciclo celular Müller visual ^20.
3. Como experimentos duran típicamente de 30 min hasta varias horas, controlar la deriva de la línea de base, nivel de ruido y la estabilidad de respuesta durante el experimento como cambios en estos podrían indicar problemas técnicos.
   NOTA: El aumento o disminución de ruidoamplitudes de respuesta d pueden indicar burbujas de aire en los canales de perfusión o electrodos, demasiado baja o alta temperatura, solución de fugas / derrames o desplazamiento de la retina.

4. Limpieza

1. Separe el soporte de la muestra de las líneas de perfusión, abrirla y vaciar las retinas del papel de filtro. Retire los electrodos y enjuague con agua destilada (no utilizar etanol). Limpiar el soporte de la muestra (incluyendo los canales de perfusión) con etanol y / o agua destilada. Tubo de perfusión Flush cuidadosamente etanol con> 70%.
2. Enjuague la botella de perfusión con agua destilada (no usar detergentes). El etanol puede ser también utilizado para limpiar la botella.

Resultados

Se registraron las respuestas de flash de tipo salvaje adaptada a la oscuridad (WT) C57BL / 6 retinas de ratones siguiendo los protocolos experimentales descritos anteriormente e ilustrados en la Figura 1 mediante el uso de diferentes soluciones de perfusión estándar (Figura 2). Las formas de onda y la cinética de respuesta, así como la sensibilidad de los fotorreceptores de varilla parecían similares en Ames y los medios de Locke (Figura 2A y B). ...

Discusión

Estamos aquí demostrar los pasos críticos para la obtención de alta calidad ex grabaciones ERG vivo simultáneamente desde dos retinas de ratones aislados mediante el uso de componentes en vivo del sistema ERG, junto con un adaptador ex vivo ERG. En este estudio se perfundidos ambas retinas del animal con la misma solución (ya sea Ames ', Locke o de Ringer), pero también es posible para perfundir cada retina con una solución diferente, por ejemplo, para fines ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
In vivo ERG system	OcuScience	HMsERG	www.ocuscience.us/id77.html
In vivo ERG system	LKC Technologies	UTAS-E 3000	www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html
Ex vivo adapter	OcuScience	Ex VIVO ERG adapter	www.ocuscience.us/id107.html
Dissection microscope	North Central Instruments	Leica M80	May use any brand
IR emitter	Opto Diode Corp.	OD-50L	www.optodiode.com
Prowler Night Vision Scopes	B.E. Meyers Electro Optics	D4300-I	Military grade product.
Red filter	Rosco Laboratories	Roscolux #27 Medium Red	May be used instead of IR system
Red head light	OcuScience	ERGX011	www.ocuscience.us/catalog/i29.html
Microscissors	WPI, Inc.	500086	www.wpiinc.com/
Dumont tweezers #5	WPI, Inc.	14101
Razor blades	Electron Microscopy Sciences	72000	www.emsdiasum.com
Scale	Metler Toledo	AB54-S/FACT	May use any brand
pH meter and electrode	Beckman Coulter	pHI 350	May use any brand
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	May use any brand
KCl	Sigma-Aldrich	60129	May use any brand
MgCl2	Sigma-Aldrich	63020	1.0 M solution
CaCl2	Sigma-Aldrich	21114	1.0 M solution
EDTA	Sigma-Aldrich	431788	May use any brand
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	May use any brand
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6297	May use any brand
Ames medium	Sigma-Aldrich	A1420	May use any brand
BaCl2	Sigma-Aldrich	B0750	May use any brand
DL-AP4	Tocris Bioscience	101	May use any brand
Succinic acid disodium salt	Sigma-Aldrich	224731	May use any brand
L-Glutamic acid	Sigma-Aldrich	G2834	May use any brand
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	May use any brand
Leibovitz culture medium L-15	Sigma-Aldrich	L4386	May use any brand
MEM vitamins	Sigma-Aldrich	M6895
MEM amino acids	Sigma-Aldrich	M5550
Carbogen	Airgas	UN3156	5% CO2