동시<em&gt; 생체</em두 망막의&gt; 기능 테스트로<em&gt; 생체</em&gt; 전위도 시스템

요약

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

초록

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

서문

전위도 (ERG)은 빛에 의해 트리거 망막의 전기 활동을 기록 할 수있는 잘 확립 된 기법이다. ERG 신호는 망막의 세포 외 공간 저항에 흐르는 전류에 의한 방사 전압 변화 (감광체 바이폴라 셀의 축 방향)에 의해 주로 생성된다. 제 ERG 신호 은점 ^(1)의 표면으로부터 그렌에 의해 1865 년에 기록되었다. Einthoven 유쾌한 1908 ² B-, A-라는 세 가지 파도에 빛의 발병 ERG 응답, 및 C 파 지금 쌍극 세포, 감광체 주로 활동을 반영하는 것으로 알려져 있으며, 색소 상피를 분리 세포, 각각 ^3-8. 에르그 지역 (미소 전극과 (생체) 고립 그대로 망막에 걸쳐, 고립 된 눈 준비 ^(9)에서, 마취 동물 또는 (생체 내) 인간의 눈에서 ^3,10-15 또는에서 특정 망막 층을 기록 할 수 있습니다ERG) ^4,16. 이들 중에서, 생체 ERG 현재 망막 기능을 평가하기 위해 가장 널리 사용되는 방법이다. 또한 진단 목적으로 이용 될 수 있거나 또는 동물이나 환자의 망막 질환의 진행을 따라 비 침습적 방법이다. 그러나 생체 내 에르그 녹음은 종종 안구 생리 소음 (예, 호흡과 심장 활동)에 의해 오염, 여러 중복 구성 요소와 복잡한 신호를 생성한다.

로컬 ERG는 망막의 특정 층에 걸쳐 신호를 기록하기 위해 사용될 수 있지만, 가장 침습적이고 다른 ERG 기록 구성과 비교하여 낮은 신호대 잡음비 (SNR)를 갖는다. 지역 망막 전위도 기술적으로 요구하고 고가의 장비 (예를 들어, 현미경과 미세 조작기)가 필요합니다. 그대로 고립 된 망막에서 Transretinal ERG (생체 ERG)는 안정적이고 HIG을 허용 생체 내 및 지역 에르그 방법 사이의 타협을 제공합니다동물이나 인간 ^(17)의 손상 망막에서 시간 SNR 녹음. 최근에,이 방법은 포유 동물, 영장류 및 인간 망막 ^18-20에 막대와 콘 감광체 기능을 연구하기 위해 성공적으로 사용되어왔다. 또한, 인해 생체 망막 색소 상피 세포의 부재로, ERG 신호의 포지티브 형 C 파 성분을 제거하고 눈에 띄는 네거티브 느린 PIII 성분은 생체 녹화 드러난다. 느린 PIII 성분은 망막 ^21-23에서 뮐러 아교 세포의 활성에서 발생하는 것으로 나타났다. 따라서, 생체 외 ERG 방법도 그대로 망막 뮐러 세포를 연구하기 위해 사용될 수있다. 여러 연구는 또한 생체 ERG 레코딩은 망막 ⁽²⁴⁾ 주위되는 약물의 농도를 측정하고, 약 ^{25 ~ 27의} 안전성과 효능을 테스트하는 데 사용될 수 보여 주었다.

생체 시스템의 여러 상업이 가능하며,반드시 광범위한 전기 생리학 배경이없는 많은 실험실에서 사용. 대조적으로, 체외 장치 ^(17)는 최근까지 극소수 실험실은이 강력한 기술을 활용되는 결과로서 사용할 수 없었다. 그것은 망막의 생리와 병리에 대한 우리의 지식을 향상하고, 질병을 눈부신에 대한 새로운 치료법을 개발하기 위해 더 많은 실험실에 생체 에르그 녹음을 사용할 수 있도록하는 것이 도움이 될 것입니다. 우리는 여기에 간단하고 저렴한 생체 ERG 장치 ^(17)을 설명하고는 일단이 상기 조작 패널 및 원뿔 - 매개 신호를 기록하는 몇몇 시판 생체 ERG 시스템과 조합하여 사용될 수있는 방법을 보여준다 (A- 및 B- 파)와 함수 그대로 야생형 마우스 망막에서 뮐러 세포 (PIII을 느리게).

프로토콜

모든 실험 프로토콜은 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 따라했고, 워싱턴 대학의 기관 동물 연구위원회에 의해 승인되었다.

1. 관류 및 시편 홀더 설정

1. 실험의 날에 신선한 망막 관류에 대한 솔루션을 준비합니다. 증류수 및 탈 이온수를 사용합니다. 다음 세 가지 방법 중 하나를 사용합니다.
   1. _{미디어와의} NaHCO3 1.9 G : '에임스 1 병 (1ℓ) 솔루션'을 에임스를 중탄산염이 함유 준비
   2. (MM)에 로크의 솔루션 준비 : 112.5 염화나트륨, 3.6의 KCl, 2.4의 MgCl _2, 1.2 _CaCl2를, 10.0 HEPES를, 20.0 _NaHCO3를, 3.0 나 숙시 네이트, 0.5 나 조미료, 0.02 EDTA, 10.0 포도당, 0.1 % MEM 비타민과 아미노산 산
   3. (MM)에 준비 HEPES 완충 벨소리 솔루션 : 133.3 염화나트륨, 3.3의 KCl, 2.0의 MgCl _2, 1.0 _CaCl2를, 10.0 포도당, 0.01 EDTA, 12.0 HEPES, pH를1 M의 NaOH 5.8 ml의 ~ 7.5로 조정, 0.72 G / L Leibovitz 문화 매체 L-15을 추가합니다. 어떤 관류 매체를 사용하여 광 수용체 응답을 분리하는 100 μm의 BaCl ₂ - 50 μm의 DL-AP4 50 - 20를 사용합니다.
2. (MM)에 전극 ^(28)에 대한 솔루션을 준비 : 140.0 염화나트륨, 3.6의 KCl, _CaCl2를, 3 HEPES, 0.01 EDTA 2.4의 MgCl _2, 1.2 및 7.4에 pH를 조정 - NaOH로 7.5. 전극 액은 수개월 동안 실온에서 저장 될 수있다.
3. 준비하고 시편 홀더를 테스트합니다.
   1. 시험편 홀더의 바닥 부의 돔 위에 블랙 / 회색 여과지를 붙인다 (도 1A 참조). 돔 플랫 탑의 가장자리 주위 신중 이성 분 5 분 에폭시 접착제를 확산. 필요한 경우, 해부 현미경으로 그것을 할.
   2. 접착제가 거의 건조 (약 4 분)이 될 때까지 기다렸다가 평면 항목을 사용하여 돔에 여과지를 누릅니다. 접착제 종이 필터 실험 전에 적어도 하루.여과지를 여러 번 사용할 수 있지만, 레코딩 개월 후에 교체되어야한다. 대체 용지를 설치하기 전에 접착제 잔류 물에서 조심스럽게 지붕을 청소하는 70 % 에탄올을 사용합니다.
   3. 전극 액은 공기 방울을 방지하고 전극 채널로 나사산 어댑터로 둘러싸인 펠렛 전극 (도 1A 및 B 참조)하려고 나사가 구비 된 전극 채널을 채운다. 네 개의 나사와 시편 홀더의 상단과 하단 부분을 연결하고 전극 용액으로 관류 라인을 입력합니다.
   4. 멀티 미터 (그림 1B)를 사용하여 각 전극 쌍의 리드 사이의 저항과 전압을 측정합니다. 저항 100 Ωk 10 MV 아래의 전압 채널 거품 무료이며 전극이 좋은 상태에있는 경우 이하이어야한다.
4. 유리 병에 관류 매체의 700 mL의 - 400 붓는다. 또 다른 300 ㎖의 망막 및 S 해부에 사용되는 별도냉장고에서 그것을 찢었다. 열교환 블록 관류 튜브를 설정하고 가열판에 예열 된 블록을 배치 (도 1d 참조).
5. (그림 1D 참조) (에임스 '또는 로크를 사용하는 경우) 연결이 ₂ / O ₂ 가스를 공동가 캡 병 및 관류 튜빙을 묶습니다. 37 ^{O C의} 미디어와 병을 예열 및 가열 플레이트 또는 37으로 설정 물을 욕조에 빛 자극 장치의 상단에 배치 - 39 ^O를 C ^(17).
   1. 국무 중력 중심의 흐름을 시작 관류 미디어를 작성하여 관류 라인.
      1. LKC 시스템에서, 다음 실험 기간 동안 병에 관류 용액의 저하 수준에 의해 영향을받지 않고, 유량 조절기에 의해 조절되는 중요한 중력 유동을 제공하도록 자극 부 ^(17)의 위쪽에 용기를 배치했다.
      2. Ocuscience 시스템에서, P를 배치시편 홀더 긴 관류 출력 라인 노이즈를 최소화하고 배치하기 위해 패러데이 케이지 안에 erfusion 병 용액의 중력 구동을 증가시키는 잘 시험편 홀더 (관류 병)의 레벨 이하 (단계 2.8 참조). 이러한 출력 라인을 방패 ERG 신호에 전자 노이즈의 커플 링을 방지하도록 상기 증폭기의 접지에 실드를 연결한다.
6. 유량 조절기를 사용하여 / 분을 5 ml - 3 관류를 조정합니다. 적절한 규제와 실린더에서 5 % CO ₂ / 95 % O ₂ 가스를 연결하고 공기 돌을 통해 병에 미디어의 꾸준한 버블을 보장하기 위해 유량을 조절합니다.

2. 샘플 준비

1. 직선 블레이 딩 microscissors, 하나 또는 두 개의 45 ^O 핀셋, 면도날 및 필터 종이의 사각형 조각을 포함하여 깨끗하고 날카로운 해부 악기를 조립합니다.
2. 감기 perfu의 약 200 ml에 붓고큰 페트리 접시에 시온 용액 (돔 포함) 시험편 홀더의 전체 바닥 부분 용액에 침지 될 수 있도록. 돔의 망막을 장착 할 때이 단계가 중요하게된다 (단계 2.6 참조). 일부 솔루션 carbogen (5 % CO _{95분의 2} %의 O _2)로 포화되도록 설계되어 있지만, 이는 해부 상업적 필수적이지 여기 기재된 실험을 수행하지 않았다.
3. 녹음하기 전에 12 시간 - 전형적인 실험, 어두운 / 라이트 사이클과 6을 어두운 - 적응 12/12 시간에 동물을 유지. (현미경 광원 앞에 예를 들어, 빨간색 필터를 사용) 희미한 붉은 빛 아래 자궁 전위 다음 _{이산화탄소} 흡입 동물을 안락사 및 어두운 빨간색 또는 적외선 조명 아래 모든 다음 절차를 수행합니다.
   1. 핀셋을 사용하여 눈을 잡아 당겨 미디어에 넣어. 페이퍼 (예를 들어, 일부 정규 여과지)의 작은 조각에 한번에 하나의 눈으로 만들어 놓고핀셋 눈 (이 여기에 솔루션의 외부에서 수행되는) 잡고 오라 세라의 수준에 약 조명.
4. 오라 세라 따라 절단 (또는 가까운 눈의 적도에) microscissors와 각막과 렌즈를 제거합니다. 큰 페트리 접시에 차가운 미디어에서 아이 컵을 놓고 다른 눈으로 동일한 절차를 반복합니다.
5. 가능한 손상으로 망막을 유지하기 위해 망막과 공막 사이에 위를 유지하여 시신경 향해 아이 컵의 상단에서 작은 절개를 잘라. 그립 개의 핀셋을 사용하여 망막 분리를 위해 서로 떨어져 핀셋 당겨 의해 절개 양측으로부터 공막.
   1. 시신경을 잘라 말단 표면에 물리적 인 접촉의 최소 금액으로 망막을 분리하려고합니다. RPE 주로 박리 과정에서 자동 망막 분리한다. 그것은을 수행하는 것보다 망막의 기계적 교란을 피하기 위해 더 중요해부 빠르게 망막은 일반적으로 응답 특성에 심각한 영향없이 용액 중에서 적어도 30 분 동안 항온 처리 할 수​​있다.
6. 시편 홀더 (그림 1C)의 돔에 망막를 탑재합니다. 해부 망막으로 페트리 접시에 시료 홀더의 바닥 부 담가. 돔 상기 망막 위쪽 감광체 측 (절연 망막의 볼록면)을 밀어 망막 여과지에 부착되도록 시험편 홀더를 해제. 다른 망막에 대해이 절차를 반복합니다.
7. 전기 망막 사이의 크로스 토크뿐만 아니라 노이즈와 신호 입환을 방지하기 위해주의 깊게 홀더 플레이트를 건조. 시험편 홀더는 홀더의 하부 및 상부 부분 사이의 액 유출을 방지 할뿐만 아니라 개별 망막의 감광체 및 신경절 세포 양쪽의 전기적 분리를 돕기 위해 바닥 부 돔 주위에 O 링을 갖는다. (네 개의 나사와 홀더의 상단 부분을 연결도 1b 참조), 주사기와 바늘을 이용하여 관류 용액으로 관류 채널을 채운다.
8. 열교환 블록 옆 시험편 홀더를 전송하고 시험편 홀더 (도 1D)에 대한 입력 및 출력 관류 라인을 연결한다. (상부 전극 증폭기 접지 / 마이너스 핀에 연결) ERG 증폭기에 전극을 연결하는 어댑터를 사용하여 표본 홀더에 자극기 / 제어 유닛을 부착하거나 따라 자극 부에 가열 패드를 밀어 생체 내에서 그 위에 에르그 시스템이 사용됩니다.

3. 녹음

1. 생체 시스템의 소프트웨어를 사용하여 앰프와 자극 설정을 구성합니다. 300 Hz로 필터링 1 ~ 10 kHz와 로우 패스 사이의 값으로 인수 주파수를 설정합니다. 하이 패스 필터링을 사용하지 마십시오. 60 Hz에서 (또는 유럽에서 50 Hz에서) 필요한 경우 필터를 홈을 사용합니다.
2. 빛 자극과 재치없이 기록 기준시간 희미한 자극 (예., -35 dB의 0.3 MCD의 SM ^-2의 녹색 빛) 전극과 망막 샘플 사이 좋은 전기적 연결을 테스트합니다. 망막 온도 함수 안정된 상태에 도달하도록 데이터 수집을 시작하기 전에 20 분 - 10 기다린.
   1. 특정 실험에 따라 자극 파라미터를 선택하고 데이터 수집을 시작합니다. 예를 들면, 0dB까지 0.1 1,000까지 MCD의 SM에서 -40에서 녹색 빛을 사용 ^-2 암순응 응답 가족을 위해. 봉 배경 빛에 의해 억제 할 필요가 포토 픽 녹음에 약 2 밝은 로그 단위 3 깜박 사용 (3-30 CDM ^-2) 또는 프로브 플래시 ^(-2 = 1dB 약 1.3 카드뮴 SM을, 그림 3 참조).
   2. 그러나 정확한 빛의 강도 값이 시스템 교정 및 실험 조건에 다소 의존 할 수 있음을 기억하십시오. 경험적으로,도 5에 의해 다운 스케일 강도 - 10 배는 생체에 비해 녹음 녹색 빛 ^(17)를 사용하여. (상업적 어댑터 시스템에 포함) 망막 위의 개구를 가진 블랙 커버 시험편 홀더에 광 산란을 감소시키고 시스템이 생체 내에서 상용의 Ganzfeld 구함으로써 두 망막의 균일하고 동일한 자극을 용이하게하는데 사용될 수있다.
      참고 : 어두운 적응 망막에서 녹음 들어, 일반적인 실험 표백제 안료의 무시할 부분에 사용되는 테스트 깜박의 강도가되도록 망막 색소 상피 중심의 재생의 부족은 문제가되지 않습니다. 또한, 이전에 콘 안료 재생 여전히 뮐러 세포주기 ^(20)를 통하여 시각적 절연 망막에서 일어날 수 있음을 보여왔다.
3. 실험은 몇 시간에 30 분부터 일반적으로 마지막으로 이러한 변화는 기술적 인 문제를 나타낼 수로, 실험 기간 동안베이스 라인 드리프트, 소음 및 응답의 안정성을 모니터링 할 수 있습니다.
   참고 : 노이즈 증가 또는 감소D 응답 진폭은 공기 관류 또는 전극 채널 거품, 너무 낮거나 높은 온도, 용액 누출 / 유출 또는 망막의 변위를 표시 할 수있다.

4. 청소

1. , 관류 라인으로부터 시험편 홀더를 분리하여 열고 여과지로부터 망막 플러시. 전극을 제거하고 증류수 (에탄올을 사용하지 않는)로 씻어. 에탄올 및 / 또는 증류수 (관류 채널 포함) 시편 홀더를 청소합니다. 조심스럽게 세척 관류 관 70>와 % 에탄올.
2. 증류수 (세제를 사용하지 마십시오)와 관류 병을 씻어. 에탄올과 같은 병을 세척하기 위해 사용될 수있다.

결과

우리는 암순응 야생형에서 플래시 응답을 기록 실험 프로토콜 표준 관류 다른 해결책 (도 2)를 사용하여 상술 한도 1에 도시를 수행하여 (WT) C57BL / 6 마우스의 망막. 응답 파형과 반응 속도뿐만 아니라로드 광 수용체의 민감도는 에임스 '와 로크의 미디어 (그림 2A와 B)에서 유사 나타났다. 한편, HEPES 완충 링거액 (NO 중탄산염 또는 5 % CO _{95분의 2} %의 O <...

토론

우리는 여기서 생체 ERG 어댑터와 함께 생체 ERG 시스템 구성 요소를 사용하여 두 개의 격리 된 마우스의 망막 동시에 고품질 생체 ERG 녹화를 얻기위한 중요한 단계를 보여준다. 본 연구에서 우리는 동일한 용액 (어느 에임스 ', 로크 또는 링거)과 동물 모두에서 망막 관류하지만 약물 테스트를 위해 상이한 솔루션 등 각 망막 관류하는 것도 가능하다. 고품질...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
In vivo ERG system	OcuScience	HMsERG	www.ocuscience.us/id77.html
In vivo ERG system	LKC Technologies	UTAS-E 3000	www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html
Ex vivo adapter	OcuScience	Ex VIVO ERG adapter	www.ocuscience.us/id107.html
Dissection microscope	North Central Instruments	Leica M80	May use any brand
IR emitter	Opto Diode Corp.	OD-50L	www.optodiode.com
Prowler Night Vision Scopes	B.E. Meyers Electro Optics	D4300-I	Military grade product.
Red filter	Rosco Laboratories	Roscolux #27 Medium Red	May be used instead of IR system
Red head light	OcuScience	ERGX011	www.ocuscience.us/catalog/i29.html
Microscissors	WPI, Inc.	500086	www.wpiinc.com/
Dumont tweezers #5	WPI, Inc.	14101
Razor blades	Electron Microscopy Sciences	72000	www.emsdiasum.com
Scale	Metler Toledo	AB54-S/FACT	May use any brand
pH meter and electrode	Beckman Coulter	pHI 350	May use any brand
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	May use any brand
KCl	Sigma-Aldrich	60129	May use any brand
MgCl2	Sigma-Aldrich	63020	1.0 M solution
CaCl2	Sigma-Aldrich	21114	1.0 M solution
EDTA	Sigma-Aldrich	431788	May use any brand
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	May use any brand
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6297	May use any brand
Ames medium	Sigma-Aldrich	A1420	May use any brand
BaCl2	Sigma-Aldrich	B0750	May use any brand
DL-AP4	Tocris Bioscience	101	May use any brand
Succinic acid disodium salt	Sigma-Aldrich	224731	May use any brand
L-Glutamic acid	Sigma-Aldrich	G2834	May use any brand
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	May use any brand
Leibovitz culture medium L-15	Sigma-Aldrich	L4386	May use any brand
MEM vitamins	Sigma-Aldrich	M6895
MEM amino acids	Sigma-Aldrich	M5550
Carbogen	Airgas	UN3156	5% CO2