Simultané<em&gt; Ex vivo</em&gt; Tests fonctionnels de deux rétines par<em&gt; In vivo</em&gt; Système Électrorétinogramme

Résumé

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Résumé

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Introduction

Électrorétinogramme (ERG) est une technique bien établie qui peut être utilisé pour enregistrer l'activité électrique de la rétine provoquée par la lumière. Le signal est généré ERG principalement par les variations de tension provoquées par les courants radiaux (selon l'axe des photorécepteurs et les cellules bipolaires) circulant dans l'espace extracellulaire résistif de la rétine. Le premier signal ERG a été enregistrée en 1865 par Holmgren de la surface d'un œil de poisson ^1. Einthoven et Jolly 1908 ² divisés la réponse ERG à l'apparition de la lumière en trois vagues différentes, appelé A, B, et C-ondes, qui sont maintenant connu pour refléter principalement l'activité des photorécepteurs, les cellules bipolaires ON, et l'épithélium pigmentaire cellules, respectivement ^8.3. ERG peut être enregistrée dans les yeux des animaux anesthésiés ou humains (in vivo), de la préparation des yeux isolé ^9, à travers la rétine isolée intacte (ex vivo) ^3,10-15 ou à travers les couches de la rétine spécifiques avec des microélectrodes (localERG) ^4,16. Parmi ceux-ci, in vivo ERG est actuellement la méthode la plus largement utilisée pour évaluer la fonction rétinienne. Il est une technique non invasive qui peut être utilisé à des fins diagnostiques ou pour suivre la progression de maladies de la rétine chez les animaux ou patients. Cependant, in vivo enregistrements ERG produisent un signal compliqué avec plusieurs composants qui se chevauchent, souvent contaminés par le bruit extraoculaire physiologique (par exemple, la respiration et l'activité cardiaque).

ERG local peut être utilisé pour enregistrer le signal à travers des couches spécifiques de la rétine, mais il est le plus invasive et présente le plus faible rapport signal-sur-bruit (SNR) par rapport aux autres configurations d'enregistrement ERG. ERG local est aussi techniquement exigeante et nécessite un équipement coûteux (par exemple, un microscope et micromanipulateurs). Transretinal ERG de la intacte, la rétine isolée (ex vivo ERG) offre un compromis entre les méthodes in vivo et ERG locales permettant stable et higenregistrements h SNR de rétines intactes d'animaux ou les humains ^17. Récemment, cette méthode a été utilisée avec succès pour étudier la fonction des bâtonnets et des cônes photorécepteurs dans les rétines de mammifères, les primates et les droits de ^18-20. En outre, en raison de l'absence de l'épithélium pigmentaire de la rétine ex vivo, la composante c-onde positive du signal ERG est retiré et un composant PIII lente négative importante est révélée dans les enregistrements ex vivo. La composante lente PIII a été démontré que provenir de l'activité des cellules gliales de Müller dans la rétine ^21-23. Ainsi, ex vivo ERG procédé pourrait également être utilisé pour étudier les cellules de Müller dans la rétine intacte. Plusieurs études ont également montré que les ex vivo enregistrements ERG pourraient être utilisés pour mesurer la concentration d'agents pharmacologiques autour de la rétine ²⁴ et de tester l'innocuité et l'efficacité des médicaments ^25-27.

Multiple commercial dans des systèmes in vivo sont disponibles etutilisée dans de nombreux laboratoires qui ne disposent pas nécessairement vaste expérience en électrophysiologie. En revanche, ex vivo dispositifs ont pas été disponible jusqu'à récemment ¹⁷ et par conséquent que très peu de laboratoires sont en cours avantage de cette technique puissante. Il serait bénéfique de faire des enregistrements ex vivo ERG disponible pour plusieurs laboratoires afin de faire progresser nos connaissances sur la physiologie et la pathologie de la rétine, et de développer de nouvelles thérapies pour les maladies cécitantes. Nous démontrons ici un dispositif simple et abordable ex vivo ERG ¹⁷ et montrons comment il peut être utilisé en combinaison avec plusieurs systèmes vivo ERG disponibles dans le commerce pour enregistrer dans la signalisation de bâtonnet et le cône médiation (A et B-ondes) et la fonction de les cellules de Müller (ralentir PIII) de rétines de souris de type sauvage intacte.

Protocole

Tous les protocoles expérimentaux étaient en conformité avec le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvés par le Comité institutionnel Animal Studies à l'Université de Washington.

1. Configuration de perfusion et porte-échantillon

1. Préparer la solution pour perfusion rétine frais sur le jour de l'expérience. Utilisez de l'eau distillée et déminéralisée. Utilisez l'une des trois solutions suivantes.
   1. Préparez-contenant Bicarbonate de la solution (1 L): 1 bouteille de Ames Ames des médias et de 1,9 g de NaHCO _3,
   2. Préparer la solution de Locke (en mM): 112,5 NaCl, 3,6 KCl, 2,4 _MgCl2, 1,2 _CaCl2, 10,0 HEPES, 20,0 NaHCO _3, 3,0 Na succinate, 0,5 Na glutamate, 0,02 EDTA, et 10,0 glucose, 0,1% de vitamines MEM et amino acides
   3. Préparer une solution de Ringer tamponnée par HEPES (en mM): NaCl 133,3, KCl 3,3, MgCl ₂ 2,0, CaCl ₂ 1,0, 10,0 glucose, 0,01 EDTA, 12,0 HEPES, pHajusté à 7,5 avec de ~ 5,8 ml de NaOH 1 M, ajouter 0,72 g / L du milieu de culture Leibovitz L-15. Utilisez 20-50 uM DL-AP4 et 50 - 100 uM BaCl ₂ pour isoler la réponse du photorécepteur avec tout support de perfusion.
2. Préparer la solution pour les électrodes ²⁸ (en mM): NaCl 140,0, KCl 3,6, MgCl ₂ 2,4, CaCl ₂ 1,2, 3, HEPES 0,01 EDTA et ajuster le pH à 7/4 à 7/5 avec du NaOH. Electrode de solution peut être stockée à température ambiante pendant plusieurs mois.
3. Préparer et tester le porte-échantillon.
   1. Collez papier filtre noir / gris sur le dessus des dômes de la partie inférieure du porte-échantillon (voir la figure 1A). Étaler à deux composants 5 min de la colle époxy soigneusement autour des bords des sommets plats des dômes. Si nécessaire, le faire en vertu de la dissection microscope.
   2. Attendez jusqu'à ce que la colle est presque à sec (environ 4 min) et appuyez sur le papier filtre sur les dômes en utilisant un objet plat. Colle de papier filtre, au moins un jour avant l'expérience. Lepapier filtre peut être utilisé plusieurs fois, mais doit être remplacé après un mois d'enregistrements. Utilisez 70% d'éthanol pour nettoyer soigneusement dômes de tout résidu de colle avant d'installer le papier de remplacement.
   3. Remplissez les canaux d'électrode avec une solution d'électrode en essayant d'éviter les bulles d'air et vissez électrodes de pellets clos avec un adaptateur fileté dans les canaux d'électrodes (voir les figures 1A et B). Connecter les pièces supérieure et inférieure du porte-échantillon avec quatre vis et remplir les lignes de perfusion avec une solution de l'électrode.
   4. Mesure de la résistance et de la tension entre les conducteurs de chaque paire d'électrodes à l'aide d'un multimètre (figure 1B). La résistance doit être inférieure à 100 #k et la tension en dessous de 10 mV si les canaux sont sans bulles et les électrodes sont dans de bonnes conditions.
4. Verser 400 à 700 ml de milieu de perfusion dans la bouteille en verre. Encore 300 ml séparée à utiliser dans la dissection des rétines et sdéchira dans un réfrigérateur. Réglez la tubulure de perfusion dans le bloc de l'échangeur de chaleur et placez le bloc préchauffé sur la plaque de chauffage (voir figure 1D).
5. Joindre la bouteille avec un bouchon qui a des connexions de CO ₂ / O ₂ gazeux (si Ames »ou Locke est utilisé) et pour tubulure de perfusion (voir figure 1D). Préchauffer la bouteille avec les médias à 37 ^o C et le placer sur la plaque chauffante ou sur le dessus de l'unité de stimulation lumineuse dans un bain d'eau réglé à 37-39 ^o C ^17.
   1. Premier Les lignes de perfusion par remplissage des médias de perfusion pour initier l'écoulement par gravité.
      1. Dans le système LKC, placer la bouteille sur le dessus de l'unité de stimulateur ¹⁷ pour fournir un écoulement gravitationnel significatif qui est ensuite ajustée par les régulateurs de débit sans être affectée par le niveau d'abaissement de la solution de perfusion dans le flacon pendant l'expérience.
      2. Dans le système Ocuscience, placez le pbouteille de erfusion l'intérieur de la cage de Faraday afin de minimiser le bruit et les placer à long perfusion lignes de sortie de la porte-échantillon (voir l'étape 2.8) bien en dessous du niveau du support de spécimen (et une bouteille de perfusion) pour augmenter entraînement gravitationnelle de la solution. Protégez ces lignes de sortie et connecter le blindage à la terre de l'amplificateur pour éviter le couplage du bruit électromagnétique au signal ERG.
6. Ajustez la perfusion de 3 - 5 ml / min en utilisant les régulateurs de débit. Connectez 5% de CO _2/95% O ₂ du gaz d'un cylindre avec régulateur approprié et ajuster le débit pour assurer bouillonnement constant des médias dans la bouteille par une pierre à air.

Préparation de l'échantillon 2.

1. Assemblez instruments de dissection propres et nettes, y compris microciseaux lame droite, un ou deux 45 ^o pince à épiler, une lame de rasoir et une pièce rectangulaire de papier filtre.
2. Pour environ 200 ml de froid perfusion de solution dans une grande boîte de Petri de sorte que toute la partie inférieure du porte-échantillon (y compris les dômes) peut être immergé dans la solution. Cette étape devient important lors du montage des rétines sur les dômes (voir l'étape 2.6). Bien que certaines solutions sont conçues pour être saturée avec du carbogène (5% de _CO2 / 95% d'O _2), ce ne soit pas essentiel aux fins de dissection et n'a pas été fait dans les expériences décrites ici.
3. Pour une expérience typique, garder les animaux dans les 12/12 heures cycle d'obscurité / lumière et l'obscurité, de les adapter pour les 6 - 12 heures avant les enregistrements. Euthanasier l'animal par inhalation de CO ₂ suivie par dislocation cervicale sous faible lumière rouge et de faire toutes les procédures suivantes sous la lumière rouge ou IR dim (utiliser par exemple, filtre rouge en face de la source de lumière du microscope).
   1. Tirez les yeux en utilisant une pince à épiler et les mettre dans les médias. Placez un œil à la fois sur un petit morceau de papier (par exemple, du papier régulier du filtre) et de faire enallumé environ sur le niveau de ora serrata tout en maintenant l'œil avec des pincettes (cela se fait en dehors de la solution ici).
4. Coupez le long de l'ora serrata (ou plus près de l'équateur de l'œil) avec microciseaux et retirez la cornée et le cristallin. Placez la tasse d'oeil dans les médias froid dans la grande boîte de Pétri et répétez la même procédure avec l'autre œil.
5. Couper une petite incision du haut de l'œilleton vers le nerf optique en gardant les ciseaux entre la rétine et la sclérotique afin de garder la rétine aussi intact que possible. Tenue de la sclère des deux côtés de l'incision à l'aide de deux pinces à épiler et tirer la pince à une distance l'une de l'autre pour détacher la rétine.
   1. Couper le nerf optique et essayer d'isoler la rétine avec un montant minimum de contact physique à la surface distale. RPE sera principalement détacher automatiquement à partir de la rétine au cours du processus de dissection. Il est plus important d'éviter la perturbation mécanique de la rétine que pour effectuer ladissection rapidement, généralement rétines peut être incubée au moins 30 min dans la solution sans effets significatifs sur les propriétés de réponse.
6. Monter les rétines sur les dômes de support de l'échantillon (figure 1C). Immerger la partie inférieure du porte-échantillon dans la boîte de Pétri avec les rétines disséqués. Faites glisser la rétine, côté photorécepteur (la surface convexe de la rétine isolée) vers le haut, au-dessus du dôme et soulever le porte-échantillon de telle sorte que la rétine se fixe sur le papier filtre. Répétez la procédure pour l'autre rétine.
7. Séchez soigneusement la plaque de support pour empêcher la diaphonie électrique entre les rétines ainsi que le bruit et le signal manœuvre. Porte-échantillons a joints toriques autour des dômes de partie inférieure pour empêcher solution déversement entre la parties inférieure et supérieure du titulaire ainsi que pour aider à l'isolation électrique des photorécepteurs et des cellules ganglionnaires de la rétine côtés individuels. Fixez la partie supérieure de la porte avec les quatre vis (voir la figure 1B) et remplir les canaux de perfusion avec une solution de perfusion en utilisant une seringue et une aiguille.
8. Transférer le porte-échantillon à côté du bloc de l'échangeur de chaleur et de connecter les entrée et sortie perfusion lignes au support de spécimen (figure 1D). Raccorder les électrodes à l'amplificateur ERG (électrodes supérieures relient à la terre / moins broche dans l'amplificateur) et fixer l'unité stimulateur / contrôle sur le porte-échantillon en utilisant un adaptateur ou faites glisser le coussin chauffant dans l'unité de stimulateur selon le in vivo ERG système est utilisé.

3. Enregistrements

1. Configurer les paramètres de l'amplificateur et de relance en utilisant le logiciel du système in vivo. Réglez la fréquence d'acquisition d'une valeur comprise entre 1 et 10 kHz et filtrage passe-bas à 300 Hz. Ne pas utiliser le filtrage passe-haut. Utilisez 60 Hz (ou 50 Hz en Europe) Notch Filter si nécessaire.
2. Fiche de référence sans la stimulation lumineuse et d'esprith stimulation dim (ex., le feu vert de -35 dB ou 0,3 mCd sm ^-2) pour tester bonne connexion électrique entre les électrodes et l'échantillon rétine. Attendez de 10 - 20 min avant de commencer la collecte de données de telle sorte que la température et la fonction rétinienne atteignent un état stable.
   1. Choisissez les paramètres de stimulation selon l'une expérience spécifique et commencer la collecte des données. Par exemple, utiliser le feu vert de -40 à 0 dB ou de 0,1 à 1,000 mCd sm ^-2 pour une famille de réponse scotopique. Utilisez environ 2 à 3 log-unités lumineux clignote en enregistrements photopiques où tiges doivent être réprimées par la lumière de fond (3-30 Cdm ^-2) ou un flash de la sonde (environ 1,3 Cd sm ^-2 = 1 dB, voir Figure 3).
   2. Cependant, rappelez-vous que les valeurs d'intensité lumineuse exactes pourraient être quelque peu dépendant de votre étalonnage du système et les conditions expérimentales. En règle générale, les intensités d'échelle en baisse de 5 à 10 fois par rapport à in vivo enregistrements lors de l'utilisation de lumière verte ^17. Une housse noire avec des ouvertures au-dessus des rétines (inclus dans le système d'adaptateur commerciale) peut être utilisé pour réduire la dispersion de la lumière dans le support d'échantillon et de faciliter la stimulation homogène et égale des deux rétines par la sphère de la publicité in vivo systèmes de Ganzfeld.
      NOTE: Pour les enregistrements de la rétine adaptée à l'obscurité, les intensités des bouffées de test utilisées dans un agent de blanchiment expérience typique seulement une fraction négligeable du pigment de sorte que l'absence de régénération conduit RPE-est pas un problème. En outre, il a été montré précédemment que cône pigment régénération peut encore avoir lieu dans la rétine isolée par l'intermédiaire de la cellule Müller cycle visuel ^20.
3. Comme expériences durent habituellement de 30 minutes à plusieurs heures, de surveiller la dérive de référence, le niveau de bruit et la stabilité de réponse lors de l'expérience que les changements de ceux-ci pourraient indiquer des problèmes techniques.
   NOTE: Augmentation du bruit ou de la diminutionamplitudes d de réponse peuvent indiquer des bulles d'air dans les canaux de perfusion ou électrodes, température trop basse ou haute, solution de fuite / déversement ou de déplacement de la rétine.

4. Nettoyage

1. Détachez le porte-échantillon à partir des lignes de perfusion, l'ouvrir et vider les rétines du papier filtre. Retirez les électrodes et les rincer avec de l'eau distillée (ne pas utiliser de l'éthanol). Nettoyer le porte-échantillon (y compris les canaux de perfusion) avec de l'éthanol et / ou de l'eau distillée. Rincer soigneusement tubulure de perfusion avec> 70% d'éthanol.
2. Rincer la bouteille de perfusion avec de l'eau distillée (ne pas utiliser de détergents). L'éthanol peut également être utilisé pour nettoyer la bouteille.

Résultats

Nous avons enregistré les réponses flash de type sauvage adaptés à l'obscurité (WT) C57BL / 6 rétines de souris en suivant les protocoles expérimentaux décrits ci-dessus et illustrés dans la Figure 1 en utilisant différentes solutions de perfusion classiques (Figure 2). Les formes d'ondes et de la cinétique de réponse ainsi que la sensibilité des photorécepteurs à bâtonnets semblent similaires à Ames »et les médias de Locke (Figure 2A et

Discussion

Nous démontrons ici les étapes critiques pour l'obtention de haute qualité ex vivo enregistrements ERG simultanément à partir de deux rétines de souris isolées en utilisant des composants in vivo du système ERG avec un ex vivo ERG adaptateur. Dans cette étude, nous avons perfusé les deux rétines de l'animal avec la même solution (soit Ames ', Ringer Locke ou) mais il est également possible de perfuser chaque rétine avec une solution différente, par exemple,...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
In vivo ERG system	OcuScience	HMsERG	www.ocuscience.us/id77.html
In vivo ERG system	LKC Technologies	UTAS-E 3000	www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html
Ex vivo adapter	OcuScience	Ex VIVO ERG adapter	www.ocuscience.us/id107.html
Dissection microscope	North Central Instruments	Leica M80	May use any brand
IR emitter	Opto Diode Corp.	OD-50L	www.optodiode.com
Prowler Night Vision Scopes	B.E. Meyers Electro Optics	D4300-I	Military grade product.
Red filter	Rosco Laboratories	Roscolux #27 Medium Red	May be used instead of IR system
Red head light	OcuScience	ERGX011	www.ocuscience.us/catalog/i29.html
Microscissors	WPI, Inc.	500086	www.wpiinc.com/
Dumont tweezers #5	WPI, Inc.	14101
Razor blades	Electron Microscopy Sciences	72000	www.emsdiasum.com
Scale	Metler Toledo	AB54-S/FACT	May use any brand
pH meter and electrode	Beckman Coulter	pHI 350	May use any brand
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	May use any brand
KCl	Sigma-Aldrich	60129	May use any brand
MgCl2	Sigma-Aldrich	63020	1.0 M solution
CaCl2	Sigma-Aldrich	21114	1.0 M solution
EDTA	Sigma-Aldrich	431788	May use any brand
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	May use any brand
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6297	May use any brand
Ames medium	Sigma-Aldrich	A1420	May use any brand
BaCl2	Sigma-Aldrich	B0750	May use any brand
DL-AP4	Tocris Bioscience	101	May use any brand
Succinic acid disodium salt	Sigma-Aldrich	224731	May use any brand
L-Glutamic acid	Sigma-Aldrich	G2834	May use any brand
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	May use any brand
Leibovitz culture medium L-15	Sigma-Aldrich	L4386	May use any brand
MEM vitamins	Sigma-Aldrich	M6895
MEM amino acids	Sigma-Aldrich	M5550
Carbogen	Airgas	UN3156	5% CO2