إنشاء ذات الصلة سريريا<em&gt; السابقين فيفو</em&gt; موك الساد نموذج جراحة للتحقيق الظهارية إصلاح الجرح في المكروية الأم

Summary

Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.

Abstract

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells’ native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens¹. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.

Introduction

و، جراحة الساد وهمية ذات الصلة سريريا، وقد وضعت خارج الحي الظهارية نموذج التئام الجروح الموصوفة هنا إلى توفير أداة للتحقيق في الآليات التي تنظم إصلاح الأنسجة الظهارية في استجابة لإصابة. السمات الرئيسية التي كانت تهدف لفي خلق هذا النموذج وشملت 1) توفير الظروف التي تتكرر بشكل وثيق الاستجابة في الجسم الحي لاصابة في إعداد ثقافة، 2) سهولة تحوير العناصر التنظيمية للإصلاح، و3) القدرة على صورة عملية الإصلاح، في مجملها، في الوقت الحقيقي. التحدي، لذلك، كان لخلق نموذج الثقافة التي كان من الممكن للدراسة، والتلاعب، وإصلاح الجرح الظهارية في المكروية في الخلايا الأم. توافر هذا النموذج الجرح إصلاح يفتح إمكانيات جديدة لتحديد العظة الإشارات الداخلية من مصفوفة البروتينات، السيتوكينات وكيموكينات التي تنظم عملية الإصلاح. وبالإضافة إلى ذلك، فإن نموذج مثالي لدراسة كيف يمكن لن ظهارة قادرة على التحرك في ورقة جماعية لإعادة يغطي بالنسيج الظهاري-منطقة الجرح ^2،3، وتحديد نسب الخلايا زعيم الوسيطة على حافة الجرح التي تعمل في توجيه الهجرة الجماعية للظهارة أصيب ^4. يوفر هذا النموذج أيضا منبرا التي لتحديد العلاجات التي يمكن أن تعزز فعالية التئام الجروح ومنع ترميم الجروح الشاذة ^5.

وهناك بالفعل عدد من النماذج المتاحة الجرح إصلاح، سواء في الثقافة والحية، التي وفرت معظم ما هو معروف عن عملية ترميم الجروح اليوم. في نماذج إصابة الحيوانية، مثل القرنية ^{6-12 و13-17} الجلد، وهناك فرصة لدراسة استجابة الأنسجة لاصابة في سياق جميع الوسطاء الإصلاح التي يمكن أن تشارك في هذه العملية، بما في ذلك المساهمات من الأوعية الدموية والجهاز العصبي. ومع ذلك، هناك قيود على التلاعب من experiالظروف النفسية في الجسم الحي، وأنه ليس من الممكن بعد إجراء دراسات التصوير الاستجابة إصلاح في الجسم الحي، بشكل مستمر مع مرور الوقت. في المقابل، فإن معظم نماذج الثقافة في المختبر الجرح إصلاح، مثل الجرح الصفر، ويمكن التلاعب بها بسهولة، وتابعت مع مرور الوقت ولكنها تفتقر إلى الإطار البيئي دراسة التئام الجروح في الأنسجة في الجسم الحي. في حين أن النماذج خارج الجسم الحي توفر ميزة دراسة عملية إصلاح الضرر بشكل مستمر مع مرور الزمن في سياق المكروية في الخلايا إلى جانب القدرة على تعديل المنظمين الجزيئية للإصلاح في أي نقطة زمنية في هذه العملية، وهناك عدد قليل من النماذج التي تناسب هذه المعلمات.

هنا يتم وصف هذا الإجراء لتوليد تكرار للغاية خارج الحي الظهارية التئام الجروح الثقافات التي تتكاثر ردا على الأنسجة الظهارية لوجرح الفسيولوجية. باستخدام عدسة الفرخ الجنين كمصدر الأنسجة، وبحكم فيفو وزارة التجارةيتم إجراء جراحة الساد ك. العدسة هي الأنسجة مثالية لاستخدامها في هذه الدراسات أنه على مسافة سميكة كبسولة الغشاء القاعدي مكتفية ذاتيا، اوعائي، وليس معصب، وخالية من أي سدى المرتبطة ^18،19. في الأمراض التي تصيب البشر، وتتناول جراحة الساد فقدان البصر بسبب عتامة العدسة، وينطوي على إزالة كتلة الخلية الألياف العدسة، التي تضم الجزء الأكبر من العدسة. يتم استعادة التالية الساد رؤية عملية جراحية خلال إدخال عدسة داخل العين الاصطناعية. إجراء جراحة الساد، من خلال إزالة الخلايا الألياف، يحرض استجابة إصابة في الظهارة عدسة المجاورة، التي تستجيب عن طريق إعادة الاندمال بتشكل النسيج الظهاري للمنطقة الخلفية للكبسولة العدسة التي كانت محتلة من قبل خلايا الألياف. في جراحة الساد، كما هو الحال في معظم الردود ترميم الجروح، ويحدث هناك في بعض الأحيان نتيجة تليفي الشاذة للاستجابة التئام الجروح، ويرتبط مع ظهور myofibroblasts، والتي في عدسة يعرف الخلفي Capsuلو عتامة ^20-22. لتوليد جراحة الساد نموذج التئام الجروح، وتحاكي إجراء جراحة الساد في العدسات إزالتها من عين الفرخ الجنين لإنتاج إصابة الفسيولوجية. إزالة المجهرية من ألياف العدسة خلايا النتائج في منطقة الجرح دائري متسقة للغاية تحيط بها الخلايا الظهارية عدسة. لا تزال تعلق هذه الفئة من السكان خلية بحزم عدسة الطابق السفلي كبسولة غشاء وأصيبوا من جراء العملية الجراحية. الخلايا الظهارية تهاجر إلى منطقة الجرداء من الغشاء القاعدي الذاتية للشفاء الجرح، بقيادة عدد سكانها خلايا vimentin الغنية الوسيطة المعروفة في عملية الإصلاح كخلايا الزعيم ^1. مع هذا النموذج استجابة لظهارة للإصابة يمكن تصور بسهولة وجاءت مع الوقت في سياق المكروية الخلايا. الخلايا يمكن الوصول إليها بسهولة لإدخال تعديلات على التعبير أو تفعيل جزيئات المتوقع أن تلعب دورا في ترميم الجروح. وهناك ميزة قوية من الهو النموذج هو القدرة على عزل ودراسة التغيرات الهجرة محددة في إطار التئام الجروح. القدرة على إعداد عدد كبير من الذين تتراوح أعمارهم بين خارج الجسم الحي التئام الجروح الثقافات مطابقة للدراسات هو ميزة أخرى لهذا النموذج. وبالتالي، فإن هذا النظام النموذجي فرصة فريدة لندف بصرف النظر آليات إصلاح الجرح والعلاجات اختبار تأثيرها على عملية التئام الجروح. ومن المتوقع أن يكون تطبيق واسع نموذج جراحة الساد وهمية خارج الحي، وتوفير الموارد الحرجة لدراسة آليات إصلاح الضرر.

Protocol

بروتوكول التالية يتوافق مع المبادئ التوجيهية المؤسسية رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام جامعة توماس جيفرسون ومع بيان ARVO لاستخدام الحيوانات في البحوث الرؤية.

1. إعداد والتحضير للعدسات للثقافة فيفو السابقين الجرح

1. وضع ثلاث 100 أطباق بتري ملم في العقيمة، غطاء تدفق الصفحي. ملء اثنين من أطباق بتري في منتصف الطريق مع العازلة تريس / سكر العنب (العازلة TD، 140 ملي كلوريد الصوديوم، 5 مم بوكل، 0.7 ملي نا ₂ PO _4، 5 ملي مد الجلوكوز، 8.25 ملي تريس قاعدة، ودرجة الحموضة إلى 7.4 مع حمض الهيدروكلوريك) في RT ، وترك فارغا الثالث. وسائل الإعلام ثقافة ما قبل الدافئ (وسائل الإعلام تستكمل مع 199، 1٪ L-الجلوتامين و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين) إلى 37 ^{درجة مئوية.}
   ملاحظة: الجرح معيار الشفاء سائل الإعلام والثقافة وخالية من الدم، كما يحدث في الجسم الحي. ومع ذلك، يمكن أن تنمو الثقافات الجرح إصلاح بنجاح في ظروف محددة وسائل الاعلام التي تشمل المصل أو عوامل أخرى.
2. إزالة د الجنينية خصبةعبد المنعم يوسف 15 أبيض ليفورنو البيض فرخ من الحاضنة (التي عقدت في 37.7 درجة مئوية مع هزاز لطيف)
3. وضع البيض المحدد في غطاء تدفق الصفحي وخارج نظيف من قذيفة مع الايثانول 70٪ من زجاجة غسل. إجراء كافة الإجراءات أدناه تحت ظروف معقمة في غطاء تدفق الصفحي، وذلك باستخدام الحلول والأدوات المعقمة.
4. الكراك البيض ومكان المحتويات في فارغة 100 مم طبق بتري. قطع رأس الجنين باستخدام ملقط القياسية ومقص غرامة. وضع رئيس أجنة الدجاج في طبق بتري تحتوي العازلة TD والتخلص السليم من ما تبقى من الجنين. اختياريا حفاظ على رؤساء الفرخ الجنين في المخزن TD لفترة قصيرة من الزمن، لم يعد من 15 دقيقة.
5. وضع رئيس الفرخ الجنين على غطاء طبق بتري. باستخدام ملقط عالية الدقة، وإزالة العدسة المرفقة مع النكتة لها الزجاجي من العين في التسلسل التالي. قرصة الجزء الخلفي من العين مع ملقط لإنشاء فتحة صغيرة في الجزء الخلفي من العين.
6. ثم، فهم النكتة الزجاجي ثإيث ملقط والساحبة بلطف على الجسم الزجاجي مع تحريك المتداول، سيتم طردهم الزجاجي مع عدسة المرفقة من العين. مكان عدسة / زجاجي في ما تبقى من طبق بتري تحتوي العازلة TD. السماح للعدسات أن تبقى في المخزن TD مدة لا تزيد عن 30 دقيقة.
7. تحريك العدسة لجديد غطاء طبق بتري تحت المجهر تشريح. من هذه النقطة على تنفيذ جميع الخطوات تحت المجهر تشريح. مع ملقط عالية الدقة فرشاة بعناية بعيدا أي الجسم الهدبي (الخلايا الصباغية) التي تم فكها مع العدسة باستخدام حافة ملقط، مع الحذر على عدم الإضرار الأنسجة العدسة.
   ملاحظة: إزالة الجسم الهدبي تضمن أنواع الخلايا التي ليست الذاتية للعدسة ليست مدرجة في الثقافة إصلاح الجرح.
8. فصل العدسة من النكتة الزجاجي مع ملقط عالية الدقة عن طريق معسر قبالة الجسم الزجاجي من ارتباطه مع كبسولة عدسة الخلفي.
9. باستخدام عالية الدقة ملقط نقل العدسة إلى قطرة صغيرةمن TD العازلة (حوالي 200 ميكرولتر) في صحن زراعة الأنسجة 35MM.

2. إجراء جراحة الساد موك

1. توجيه عدسة في قطرة من العازلة TD في 35 ملم الطبق مع الجانب الأمامي للعدسة مواجهة.
   ملاحظة: يتم تحديد الأمامي للعدسة بسهولة من خلال وجود حلقة كثيفة في الأنسجة التي تحيط الحدود بين الأمامية والمنطقة الاستوائية من ظهارة العدسة. في المقابل، هناك غياب علامات على الخلفي من كبسولة العدسة التي ترد خلايا ألياف العدسة.
2. باستخدام اثنين من ملقط عالية الدقة تجعل شق صغير (حوالي 850μm) في وسط الكبسولة الأمامية عدسة، والغشاء القاعدي الكثيف الذي يحيط نسيج العدسة، وما يرتبط بها من ظهارة العدسة الأمامي لها، من خلال استيعاب الأنسجة مع واحد ملقط في كل جهة، و التجاذبات بلطف في اتجاهات متعارضة.
3. إزالة كتلة الخلية الألياف، والتي تشكل الجزء الأكبر من النسيج العدسة، dislodجينج أنه من مرفقاتها إلى ظهارة العدسة والمحيطة عدسة الكبسولة التي كتبها المائية شطف (النهج المستخدمة في جراحة الساد الكلاسيكية، على غرار في الشكل 1A).
4. ملء حقنة 1 مل مع طرف إبرة 27.5 G مع 300 ميكرولتر من العازلة TD. إدراج رأس الإبرة في شق المحرز في عدسة الكبسولة الأمامية، وحوالي منتصف الطريق إلى العدسة.
5. خفض بلطف حقنة حقن عازلة TD في كتلة الخلايا الألياف العدسة. ضخ ما بين 50 و 200 TD ميكرولتر، وأبدا أكثر من 300 ميكرولتر. مراقبة الكتلة الخلوية الألياف تخفيف نفسها من الظهارة وعدسة الكبسولة.
6. باستخدام ملقط عالية الدقة، وإزالة خففت كتلة الخلايا الألياف من العدسة من خلال موقع شق الأمامي.
   ملاحظة: يترك هذا الإجراء العدسة الخلفي كبسولة الغشاء القاعدي الذي خلايا الألياف قد تعلق المعراة من الخلايا، وظهارة العدسة بجروح فقط المجاورة لهذا الموقع.

3. Preparinز العدسة الجرحى لفيفو السابقين الثقافة

1. تسطيح حقيبة المحفظة العدسة التي تنتج من جراحة الساد المذكورة أعلاه على طبق ثقافة، جنبا خلية يصل، بجعل خمسة تخفيضات في الجانب الأمامي من الحقيبة المحفظة.
2. قطع عمودي على موقع شق الأصلي وصولا إلى خط الاستواء من العدسة. تسطيح الناتجة خمسة "اللوحات" من عدسة كبسولة مع ظهارة تعلق على الجانب ثقافة طبق كبسولة أسفل، الجانب الخلية يصل. لاحظ عدسة الجرحى خارج الحي الآن يجب أن تأخذ على نجمة أو شكل flowerlike (انظر الشكل 1B).
3. لتأمين الكبسولة إلى الطبق، اضغط برفق إلى أسفل مع ملقط في كل نقطة من النجم. وهذا سيجعل المسافة البادئة صغيرة في النصائح الخمس الأكثر الخارجية للالنباتى ويؤدي إلى التعلق المستدام إلى الطبق.
   ملاحظة: من الممكن أن يدمر الكبسولة أثناء هذا الإجراء، ولذا فمن المهم تأمين الكبسولة إلى الطبق أقرب إلى نصائح من فلوريداملاحظة وقت ممكن، وكذلك لجعل أقل قدر من النقاط تأمين ممكن (عادة اثنين، بحد أقصى ثلاثة في رفرف).
4. إزالة المنطقة العازلة TD من الطبق 35MM واستبدالها 1.5 مل من وسائل الاعلام قبل تحسنت. تغطية صحن 35MM مع غطاء ووضعه في الحاضنة (37 ° C، 5٪ CO _2).

4. فصل المنطقة الهجرة الوسطى (CMZ)، حيث إعادة الاندمال بتشكل النسيج الظهاري في المنطقة الجرحى من الخلفي كبسولة يحدث، من مرفق الأصل المنطقة (OAZ) من الخلايا الظهارية عدسة، على التحليل الكمي.

ملاحظة: هذه الخلايا تبدأ في التحرك إلى المنطقة CMZ على الفور ردا على إصابة. قبل يوم واحد في الثقافة ما يكفي من الخلايا يهاجرون عبر CMZ للتحليل الجزيئية والكيمياء الحيوية، وبعد الانفصال من CMZ وOAZ كتبها micro-تشريح ^23. هذا البروتوكول ينطوي على إزالة واحد رفرف (OAZ) في وقت من منطقة الجرحى من الكبسولة.

1. مراقبة وديمارالموجبة، واضحة للعيان تحت المجهر تشريح، بين OAZ وCMZ (انظر الشكل 2A). باستخدام اثنين من ملقط عالية الدقة، فهم مع كل من ملقط على حافة خط OAZ / CMZ، واحد فقط المتاخمة للالبعض، على جانبي الخط (انظر الشكل 2A، B، السهم).
2. باستخدام يد واحدة / واحد ملقط على الجانب CMZ تواصل التمسك ثقافة الجرحى، في حين باليد الأخرى / ملقط، وسحب بلطف OAZ على طول الخط OAZ / CMZ. وCMZ يفصل بسهولة من OAZ على طول هذا الخط. مواصلة السير على هذا الخط في جميع أنحاء ثقافة بأكملها حتى يتم فصل المنطقتين تماما.
3. دراسة فصل OAZ وCMZ الكسور للتحليل الجزيئي مثل ²⁴ أو البيوكيميائية تحليل الحمض النووي الريبي يليها مثل لطخة غربية أو زملاء مناعي ^23،25.

النتائج

فيفو السابقين نموذج أنشئت لدراسة عملية التئام الجروح في المكروية في الخلايا الأم

للتحقيق في الآليات التي تشارك في تنظيم التئام الجروح لظهارة داخل المكروية في الخلايا الأم، تم إنشاء نموذج جراحة الساد ذات الصلة سريريا خار?...

Discussion

Here is described a technique for preparing a culture model of wound repair that involves performing an ex vivo cataract surgery on chick embryo lenses after their removal from the eye. The lens epithelium responds to this clinically relevant wounding with a repair process that closely mimics that which occurs in vivo, and shares features with wound repair in other epithelial tissues^2,4. While the protocol is straightforward and simple to follow, performing mock cataract surgery with embryoni...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	S271-3	Use at 140 mM in TD Buffer
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	P217-500	Use at 5 mM in TD Buffer
Sodium Phosphate (Na2HPO4)	Sigma	S0876	Use at 0.7 mM in TD Buffer
D-glucose (Dextrose)	Fisher Scientific	D16-500	Use at 0.5 mM in TD Buffer
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-1	Use at 8.25 mM in TD Buffer
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144-500	Use to pH TD buffer to 7.4
Media 199	GIBCO	11150-059
L-glutamine	Corning/CellGro	25-005-CI	Use at 1% in Media199
Penicillin/streptomycin	Corning/CellGro	30-002-CI	Use at 1% in Media199
100 mm petri dishes	Fisher Scientific	FB0875711Z
Stericup Filter Unit	Millipore	SCGPU01RE	Use to filter sterilize Media
Dumont #5 forceps (need 2)	Fine Science Tools	11251-20
35 mm Cell Culture Dish	Corning	430165
27 G 1 ml SlipTip with precision glide needle	BD	309623
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-11
Standard Forceps	Fine Science Tools	91100-12
Other Items Needed: General dissection instruments,  fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37.7°C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting microscope