Création d&#39;une importance clinique<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mock Chirurgie de la cataracte modèle pour étudier épithéliale Wound Repair dans un microenvironnement maternelle

Résumé

Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.

Résumé

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells’ native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens¹. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.

Introduction

La chirurgie de la cataracte cliniquement pertinente, maquette, modèle de cicatrisation des plaies ex vivo épithéliale décrit ici a été développé pour fournir un outil pour étudier les mécanismes qui régulent la réparation des tissus épithéliaux en réponse à une blessure. Principales caractéristiques qui visaient pour la création de ce modèle comprenaient 1) offrant des conditions qui reproduites étroitement la réponse in vivo pour blessant dans un cadre de culture, 2) la facilité de moduler les éléments de régulation de la réparation, et 3) capacité à l'image du processus de réparation, dans sa totalité, en temps réel. Le défi était donc de créer un modèle de culture dans lequel il a été possible d'étudier et manipuler, épithéliale réparation de blessure dans microenvironnement natif des cellules. La disponibilité de ce modèle plaie réparation ouvre de nouvelles possibilités pour identifier les signaux de signalisation endogènes de la matrice des protéines, des cytokines et des chimiokines qui régissent le processus de réparation. En outre, le modèle est idéal pour examiner comment unn épithélium est capable de se déplacer comme une feuille collective réépithélialisation de la plaie ^2,3, et pour la détermination de la lignée de cellules mésenchymateuses de tête au niveau du bord de la plaie qui fonctionne dans la direction de la migration de l'épithélium collective ⁴ blessé. Ce modèle fournit également une plate-forme permettant d'identifier des thérapeutiques qui pourraient favoriser la cicatrisation efficace et prévenir la blessure aberrante réparation ^5.

Il existe déjà un certain nombre de modèles disponibles plaie réparation, à la fois dans la culture et in vivo, qui ont fourni la plupart de ce qui est connu sur le processus de réparation de la plaie aujourd'hui. Dans les modèles de blessures animaux, tels que la cornée et la peau ^{6-12 13-17,} il ya la possibilité d'étudier la réponse du tissu à blessant dans le contexte de tous les médiateurs de réparation qui pourraient être impliqués dans le processus, y compris les contributions de la vasculaire et le système nerveux. Cependant, il ya des limites à la manipulation de l 'expérienceconditions mentales in vivo, et il est pas encore possible de mener des études d'imagerie de la réponse de réparation in vivo, de façon continue au fil du temps. En revanche, la plupart des modèles de culture in vitro plaie réparation, telles que la plaie de zéro, peuvent être facilement manipulés et suivis dans le temps, mais manquent le contexte de l'environnement de l'étude de la cicatrisation des plaies dans les tissus in vivo. Bien ex vivo modèles offrent l'avantage d'étudier le processus blessures de réparation continue dans le temps dans le cadre du microenvironnement des cellules associée à la capacité de moduler les régulateurs moléculaires de réparation à tout point de temps dans le processus, il ya quelques modèles qui correspondent à ceux-ci paramètres.

Ici, on décrit un procédé hautement reproductible pour générer ex vivo de cicatrisation epitheliale cultures qui reproduisent la réponse d'un tissu épithélial à une blessure physiologique. Utilisation de la lentille d'embryon de poulet comme source de tissus, un ex vivo mock chirurgie de la cataracte est effectuée. La lentille est un tissu idéal à utiliser pour ces études car il est auto-contenue dans une capsule de la membrane basale épaisse, avasculaire, pas innervé, et libre de toute stroma associé ^18,19. Dans la maladie humaine, la chirurgie de la cataracte traite une perte de vision due à l'opacification de la lentille, et implique l'élimination de la masse de cellules de la fibre de verre, qui comprend la plus grande partie de la lentille. A la suite de la chirurgie de la cataracte vision est restaurée par l'insertion d'une lentille intraoculaire artificielle. La procédure de chirurgie de la cataracte, par élimination des cellules de la fibre, induit une réponse de lésion de l'épithélium de la lentille adjacente, qui répond en ré-épithélialisation de la zone postérieure de la capsule du cristallin qui a été occupée par les cellules de la fibre. En chirurgie de la cataracte, comme dans la plupart des réponses plaie de réparation, il se produit parfois un résultat aberrant fibrotique à la réponse de cicatrisation de la plaie, associée à l'apparition de myofibroblastes, qui, dans la lentille postérieure est connu comme Capsule opacification ^20-22. Pour générer le modèle de cicatrisation de la plaie de la chirurgie de la cataracte, une procédure de chirurgie de la cataracte est imité dans les lentilles retirés de l'œil d'embryon de poulet pour produire une blessure physiologique. Enlèvement de microchirurgie de fibres de verre résultats des cellules dans une zone de la plaie circulaire très cohérent entouré par les cellules epitheliales du cristallin. Cette population de cellules reste fermement attachée à la capsule de la lentille membrane basale et est blessé par la procédure chirurgicale. Les cellules épithéliales migrent sur ​​la zone dénudée de la membrane basale endogène de guérir la plaie, dirigé par une population de cellules mésenchymateuses vimentine riche connus dans le processus de réparation en tant que cellules de ¹ chef. Avec ce modèle, la réponse d'un épithélium de blessure peut être facilement visualisé et suivie avec le temps dans le cadre de la micro-environnement des cellules. Les cellules sont facilement accessibles à des modifications de l'expression ou l'activation de molécules susceptibles de jouer un rôle dans la cicatrisation des plaies. Une puissante fonctionnalité de eest le modèle est la capacité à isoler et à étudier les changements spécifiques à la migration dans le cadre de la cicatrisation des plaies. La possibilité de préparer un grand nombre de plaies appariés ex vivo pour la guérison de cultures âgées études est un autre avantage de ce modèle. Ainsi, ce système de modèle fournit une occasion unique de démêler les mécanismes de la cicatrisation des plaies et de la thérapeutique de test pour leur effet sur le processus de cicatrisation des plaies. L'ex vivo maquette modèle de chirurgie de la cataracte est prévu d'avoir une large applicabilité, fournissant une ressource essentielle pour les mécanismes de réparation des lésions de l'étude.

Protocole

Le protocole suivant est conforme aux institutionnels en soins des animaux et l'utilisation des lignes directrices du Comité de l'Université Thomas Jefferson et à la Déclaration ARVO pour l'utilisation d'animaux dans Vision Research.

1. Configuration et préparation des Objectifs de la Culture ex vivo des plaies

1. Passer trois plats 100 mm de Pétri dans, une hotte à flux laminaire stérile. Remplir deux des boîtes de Pétri à moitié avec du tampon Tris / dextrose (tampon TD; 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 0,7 mM de Na ₂ PO _4, 5 mM de D-glucose, 8,25 mM de base Tris, pH à 7,4 avec HCl) à la température ambiante , laissant le troisième vide. Des milieux de culture pré-chaud (Media 199 additionné de 1% de L-glutamine et 1% de pénicilline / streptomycine) à 37 ^o C.
   Remarque: La blessure norme guérison milieux de culture est sans sérum, comme cela se produit in vivo; toutefois, les cultures de réparation de plaie peuvent être cultivées avec succès dans des conditions définies de médias qui comprennent le sérum ou d'autres facteurs.
2. Retirer fertile d embryonnaireay 15 White Leghorn poussin oeuf de l'incubateur (tenue à 37,7 ° C avec doux balancement)
3. Placez l'oeuf sélectionné dans la hotte à flux laminaire et à l'extérieur de la coque propre avec 70% d'éthanol à partir d'une bouteille de lavage. Effectuer toutes les procédures ci-dessous dans des conditions aseptiques dans la hotte à flux laminaire, en utilisant des solutions et des instruments stériles.
4. Crack oeufs et placer le contenu dans la boîte de 100 mm de Pétri vide. Décapitez embryon en utilisant une pince standard et des ciseaux fins. Placez la tête d'embryon de poulet dans une boîte de Pétri contenant un tampon de TD et jetez le reste de l'embryon. Eventuellement garder les têtes d'embryon de poulet dans un tampon TD pour une courte période de temps, pas plus de 15 min.
5. Placez la tête d'embryon de poulet sur un couvercle de boîte de Pétri. En utilisant des pinces de haute précision, retirez l'objectif avec son humeur vitrée de l'œil fixé dans la séquence suivante. Pincez l'arrière de l'œil avec la pince pour créer une petite ouverture dans le fond de l'œil.
6. Ensuite, saisir l'humeur vitrée wvec pinces et tirez doucement sur le corps vitré avec un mouvement de roulis, le vitré avec l'objectif fixé seront délogés de l'œil. Fixer la lentille / vitré dans la boîte de Pétri contenant un tampon restante de TD. Laisser les lentilles de rester dans un tampon TD pour pas plus de 30 min.
7. Déplacer la lentille dans une nouvelle boîte de Pétri de couvercle sous un microscope à dissection. De ce point sur toutes les actions nécessaires sous un microscope de dissection. Avec des pinces de haute précision brosser soigneusement toute corps ciliaire (cellules pigmentées) qui ont été délogés avec la lentille en utilisant le bord de la pince, en prenant garde de ne pas endommager les tissus de la lentille.
   Remarque: Le retrait du corps ciliaire garantit que les types de cellules qui ne sont pas endogènes à la lentille ne sont pas inclus dans la culture plaie de réparation.
8. Séparer la lentille à partir de l'humeur vitrée avec des pinces de haute précision par pincement le corps vitré à partir de sa liaison avec la capsule postérieure du cristallin.
9. Utilisation de haute précision Pince transférer la lentille dans une petite gouttede tampon TD (environ 200 ul) dans une boîte de culture tissulaire de 35 mm.

2. Réalisation de chirurgie de la cataracte Mock

1. Orienter la lentille dans la goutte de tampon TD dans la boîte de 35 mm avec la face antérieure de la lentille vers le haut.
   Remarque: La antérieure de la lentille est facilement identifié par la présence d'un anneau dense dans le tissu qui prend note de la frontière entre la partie antérieure et région équatoriale de l'épithélium de la lentille. En revanche, il existe une absence de marquage sur la partie postérieure de la capsule du cristallin à laquelle les cellules de fibres de verre sont fixés.
2. L'utilisation de deux pinces de haute précision font une petite incision (environ 850μm) dans le centre de la capsule antérieure du cristallin, la membrane basale épaisse qui entoure le tissu de lentille, et son épithélium de lentille antérieure associée, en saisissant le tissu avec une pince dans chaque main et tirant doucement dans des directions opposées.
3. Retirer la masse cellulaire de la fibre, ce qui constitue l'essentiel du tissu de lentille, dislodging il de ses attaches à l'épithélium de la lentille et entourant capsule du cristallin par hydro-élution (une approche utilisée dans la chirurgie de la cataracte classique, calqué sur la figure 1A).
4. Remplir une seringue de 1 ml avec une pointe d'aiguille de 27,5 G avec 300 pi de tampon TD. Insérer la pointe de l'aiguille dans l'incision pratiquée dans la capsule antérieure du cristallin, et à mi-chemin dans l'objectif.
5. Appuyer doucement la seringue injecter le tampon de TD dans la masse cellulaire de la fibre de verre. Injecter entre 50 et 200 pi TD, et jamais plus de 300 pi. Respecter la masse cellulaire de la fibre se desserrer de l'épithélium et capsule du cristallin.
6. En utilisant des pinces de haute précision, retirer la masse cellulaire des fibres desserré de la lentille à travers le site de l'incision antérieure.
   Remarque: Cette procédure laisse la lentille de la capsule postérieure de la membrane basale à laquelle les cellules des fibres avaient été attachés dénudée de cellules, et un épithélium de lentille blessé juste à côté de ce site.

3. Preparing Lens blessés pour Culture ex vivo

1. Aplatir le sac capsulaire du cristallin qui résulte de l'opération de la cataracte décrit ci-dessus sur la boîte de culture, jusqu'à côté de la cellule, en faisant cinq découpes dans la face antérieure du sac capsulaire.
2. Couper perpendiculaire au site de l'incision initiale par rapport à l'équateur de la lentille. Aplatir les résultants cinq «volets» de capsule du cristallin par un épithélium attachée sur le côté plat de la culture de la capsule vers le bas, la cellule vers le haut. Notez la lentille ex vivo blessés aujourd'hui devrait prendre sur une étoile ou une forme en fleur (voir la figure 1B).
3. Pour sécuriser la capsule à l'antenne, appuyez doucement vers le bas avec la pince à chaque point de l'étoile. Cela fera une petite empreinte sur les cinq conseils les plus à l'extérieur de l'expiant et aboutir à la fixation soutenue à l'antenne.
   Remarque: Il est possible d'endommager la capsule lors de cette procédure et il est donc important d'assurer la capsule à l'antenne au plus près les conseils de la flaps que possible, ainsi que de faire le moins de points de fixation que possible (généralement deux, maximum de trois par lambeau).
4. Retirez le tampon de TD à partir du plat 35mm et le remplacer par 1,5 ml de milieu préchauffées. Couvrir le plat 35mm avec son couvercle et le placer dans l'incubateur (37 ° C, 5% de CO _2).

4. Séparation de la Zone Central Migration (CMZ), où Re-épithélialisation de la zone de blessés de la Capsule Postérieure se produit, à partir de la pièce jointe d'origine Zone (OAZ) de cellules épithéliales d'objectif, pour l'analyse quantitative.

Remarque: Les cellules commencent à se déplacer dans la région CMZ immédiatement en réponse à une blessure. Par jour dans la culture suffisamment de cellules migrent à travers le CMZ pour l'analyse moléculaire et biochimique, après la séparation de la CMZ et OAZ par micro-dissection ^23. Ce protocole implique l'élimination d'un volet (OAZ) à la fois à partir de la zone blessée de la capsule.

1. Observer un demarcation, clairement visible sous le microscope de dissection, entre le OAZ et CMZ (voir Figure 2A). En utilisant deux pinces de haute précision, saisir avec les deux pinces sur le bord de la ligne OAZ / CMZ, un juste à côté de l'autre, de chaque côté de la ligne (voir Figure 2A, B, flèche).
2. En utilisant une main / une pince sur le côté CMZ continuent à tenir sur la culture blessés, tandis que de l'autre main / pince, tirez doucement le long de la ligne OAZ OAZ / CMZ. Le CMZ sépare facilement de la OAZ long de cette ligne. Continuez le long de cette ligne tout autour de la culture jusqu'à ce que les deux régions sont complètement séparés.
3. Étudier les Oaz et CMZ fractions séparées pour l'analyse moléculaire telles que ²⁴ ou biochimique analyse de l'ARN-Seq tels que Western blot ou co-immunoprécipitation ^23,25.

Résultats

Ex Vivo modèle créé pour étudier le processus de cicatrisation des plaies dans microenvironnement natif des cellules

Pour étudier les mécanismes impliqués dans la régulation de la cicatrisation d'un épithélium sein microenvironnement natif des cellules, un ex vivo maquette modèle de chirurgie de la cataracte cliniquement pertinente a été créé. Ce modèle est créé à partir de tissus de verre qui offre de nombreux avantages en raison de ses propriétés ...

Discussion

Here is described a technique for preparing a culture model of wound repair that involves performing an ex vivo cataract surgery on chick embryo lenses after their removal from the eye. The lens epithelium responds to this clinically relevant wounding with a repair process that closely mimics that which occurs in vivo, and shares features with wound repair in other epithelial tissues^2,4. While the protocol is straightforward and simple to follow, performing mock cataract surgery with embryoni...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	S271-3	Use at 140 mM in TD Buffer
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	P217-500	Use at 5 mM in TD Buffer
Sodium Phosphate (Na2HPO4)	Sigma	S0876	Use at 0.7 mM in TD Buffer
D-glucose (Dextrose)	Fisher Scientific	D16-500	Use at 0.5 mM in TD Buffer
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-1	Use at 8.25 mM in TD Buffer
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144-500	Use to pH TD buffer to 7.4
Media 199	GIBCO	11150-059
L-glutamine	Corning/CellGro	25-005-CI	Use at 1% in Media199
Penicillin/streptomycin	Corning/CellGro	30-002-CI	Use at 1% in Media199
100 mm petri dishes	Fisher Scientific	FB0875711Z
Stericup Filter Unit	Millipore	SCGPU01RE	Use to filter sterilize Media
Dumont #5 forceps (need 2)	Fine Science Tools	11251-20
35 mm Cell Culture Dish	Corning	430165
27 G 1 ml SlipTip with precision glide needle	BD	309623
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-11
Standard Forceps	Fine Science Tools	91100-12
Other Items Needed: General dissection instruments,  fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37.7°C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting microscope