Создание клинически значимых<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Мок хирургии катаракты модель для исследования Эпителиальный заживления раны в родной микроокружения

Резюме

Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.

Аннотация

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells’ native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens¹. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.

Введение

Клинически значимых, макет хирургии катаракты, экс естественных эпителиальных ранозаживляющее модель, описанная здесь была разработана, чтобы предоставить инструмент для исследования механизмов, которые регулируют ремонт эпителиальных тканей в ответ на повреждение. Основные функции, которые были направлены на создание в этой модели включены 1) обеспечение условий, которые тесно повторены ответ в естественных условиях на ранив в условиях культуры, 2) простота модуляции регуляторные элементы ремонта, и 3) способность к изображению процесс ремонта, в полном объеме, в режиме реального времени. Таким образом, задача в том, чтобы создать модель культуры, в которой можно было учиться, и манипулировать, эпителиальных ремонт раны в родном микросреды клеток. Наличие этой раны ремонта модели открывает новые возможности для идентификации эндогенных реплики сигнализации от матричных белков, цитокинов и хемокинов, которые регулируют процесс восстановления. Кроме того, модель идеально подходит для изучения того, какп эпителий способен двигаться как коллективная листа повторно epithelialize рану площадь ^2,3, а для определения происхождение лидера мезенхимальных клеток в края раны, что функционировать в управлении коллективной миграции потерпевшей эпителия ^4. Эта модель также предоставляет платформу, с которой, чтобы определить терапевтические средства, которые могли бы способствовать эффективному заживлению ран и предотвращению аномальным раны ремонт ^5.

Есть уже ряд доступных моделей раны ремонт, и в культуре, и в естественных условиях, которые предоставили большую часть того, что известно о процессе заживления раны сегодня. В моделях на животных травмы, такие как роговицы и кожи ^{6-12 13-17,} есть возможность изучать реакцию ткани ранив в контексте всех ремонтных посредников, которые могли бы быть вовлечены в процесс, в том числе взносов сосудистая и нервная система. Тем не менее, существуют ограничения на манипуляции экспериментовпсихические состояния в естественных условиях, и это пока не представляется возможным провести исследования изображений отклика ремонт в естественных условиях, непрерывно в течение времени. В противоположность этому, большинство в пробирке с раной ремонт модели культуры, такие как царапины раны, можно легко манипулировать, и последующим течением времени, но не хватает на окружающую контексте изучения заживления ран в ткани в естественных условиях. В то время как исключая виво модели имеют преимущество в изучении процесса ремонта повреждений непрерывно в течение времени в контексте микроокружения клеток в сочетании со способностью модулировать регуляторов молекулярной ремонта в любой момент времени в процессе, есть несколько моделей, которые соответствуют этим Параметры.

Здесь описан порядок генерировать высоко воспроизводимое Экс Vivo эпителиальных ранозаживляющее культур, которые воспроизводят ответ эпителиального ткани в к физиологической ранения. Использование куриных эмбрионов объектив в качестве источника ткани, экс естественных MOCК хирургии катаракты проводится. Объектив идеально подходит ткань использовать для этих исследований, так как он является самодостаточным в толстой базальной мембраны капсулы, асептический, не иннервируются, и без каких-либо связанного стромы ^18,19. В болезни человека, хирургия катаракты обращается к потере зрения из-за помутнение хрусталика, и включает в себя удаление клеточной массы линзы волокна, который включает большую часть объектива. После хирургии катаракты зрение восстанавливается путем включения искусственного хрусталика. Процедура хирургии катаракты, за счет удаления волокон клеток, индуцирует ответ травмы в соседнем линзы эпителия, который отвечает реэпителизацию заднего области капсулы хрусталика, которые были заняты клеток волокон. В хирургии катаракты, как и в большинстве ответов заживления ран, там иногда происходит аберрантный фиброзной исход в заживления ран ответ, связанный с появлением миофибробластов, что в объектив известного как Posterior Capsuле Помутнение ^20-22. Для создания хирургии катаракты заживление ран модель, процедура хирургии катаракты имитируется в линзах удалены из куриного эмбриона глаза, чтобы произвести физиологическое травмы. Микрохирургические удаление объектива волоконно клеток приводит в очень состоятельной зоне круговой раны в окружении объектив эпителиальных клеток. Это популяция клеток остается прочно прикреплены к мембраны капсулы линзы подвал и пострадал от хирургического вмешательства. Эпителиальные клетки мигрируют на обнаженную область эндогенного базальной мембраны, чтобы залечить раны, во главе с населением виментина богатых мезенхимальных клеток, известных в процессе ремонта, как лидер клеток ^1. С помощью этой модели реакция эпителия на повреждение можно легко визуализировать и последующим со временем в контексте микроокружения клеток. Клетки были легко доступны для модификации экспрессии или активации молекул ожидается, будет играть роль в заживлении ран. Мощная функция гоэто модель способность изолировать и изучать миграции конкретных изменений в рамках заживления ран. Возможность подготовки большого числа в возрасте подобранных бывших естественных условиях заживления ран культур для исследований является еще одним преимуществом этой модели. Таким образом, эта модель системы дает уникальную возможность дразнить друг от друга механизмы заживления ран и тестирования терапии для их влияния на процесс заживления ран. Экс естественных макет модель хирургии катаракты, как ожидается, широкое применение, обеспечивая критический ресурс для изучения механизмов ремонта повреждений.

протокол

Следующий протокол соответствует руководящим принципам Уходу за животными и использование комитета Университете Томаса Джефферсона и заявления ARVO для использования животных в Vision Research.

1. Установка и подготовка Объективы для экс Vivo ран культуры

1. Поместите три 100 мм чашки Петри в стерильной, ламинарного потока капотом. Заполните два из чашек Петри с полпути Трис / декстроза буфера (TD буфера; 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 0,7 мМ Na ₂ PO _4, 5 мМ D-глюкозы, 8,25 мМ трис-основани, рН до 7,4 с помощью HCl) при комнатной температуре , в результате чего третий пустым. Предварительно теплой культура СМИ (Media 199 дополнена, 1% L-глутамина и 1% пенициллина / стрептомицина) до 37 ^о С.
   Примечание: стандарт заживления питательных сред без сыворотки, как это происходит в естественных условиях; Однако раны-ремонтные культуры можно с успехом выращивать в определенных условиях медиа, которые включают сыворотку или другие факторы.
2. Удалить благодатную эмбриональных Dай 15 белый леггорн куриных яиц из инкубатора (проводится в 37,7 ° С с нежным покачиванием)
3. Поместите выбранный яйцо в ламинарный и чистой внешней оболочки с 70% этанола из промывочной бутылки. Провести все процедуры, приведенные ниже в асептических условиях в капюшоне ламинарного потока, используя стерильные растворы и инструменты.
4. Crack яйцо и место содержание в пустую 100 мм чашки Петри. Обезглавьте эмбриона с использованием стандартных щипцов и тонкие ножницы. Поместите куриного эмбриона голову в чашку Петри, содержащую буфер TD и правильно распоряжаться оставшейся части эмбриона. При желании сохранить не куриного эмбриона головы в TD буфере в течение короткого периода времени, не дольше, чем 15 мин.
5. Поместите куриного эмбриона голову на чашке крышкой блюдо. Использование высокоточных пинцета, снять объектив вместе с прикрепленной стекловидного тела из глаза в следующей последовательности. Зажмите заднюю часть глаза с помощью пинцета, чтобы создать небольшое отверстие в задней части глаза.
6. Затем, возьмитесь стекловидного тела шIth щипцы и осторожно потянуть на стекловидное тело с качения, стекловидное тело с объективом будет смещена от глаза. Место линзы / стекловидного в оставшейся чашку Петри, содержащую буфер TD. Разрешить линзы, чтобы остаться в TD буфера не более чем на 30 мин.
7. Перемещение объектива в новой крышкой чашки Петри при вскрытии микроскопом. С этого момента выполнения всех шагов при вскрытии микроскопом. С высокой точностью щипцы тщательно чистить от любой цилиарного тела (пигментные клетки), которые были выбиты с объективом, используя лезвие пинцетом, принимая осторожность, чтобы не повредить объектив ткани.
   Примечание: Удаление цилиарное тело гарантирует, что типы клеток, которые не эндогенным для объектива не включены в заживлении ран культуры.
8. Отделите объектив от стекловидного тела с высокой точностью щипцов, зажимая от стекловидного тела от его ассоциации с задней капсулы хрусталика.
9. Использование высокой точности щипцы передать объектив в маленькой каплиТД буфера (около 200 мкл) в 35-мм блюдо культуры ткани.

2. Выполнение Якобы хирургии катаракты

1. Расположите объектив в капле TD буфера в 35 мм блюдо с передней поверхности объектива вверх.
   Примечание: передней линзы легко идентифицированы по наличию плотным кольцом в ткани, что отмечает границу между передней и экваториальной области хрусталика эпителия. В отличие от этого, есть отсутствие маркировки на задней капсулы хрусталика, в которой клетки линзы волокна присоединены.
2. Использование двух Высокоточные пинцеты сделать небольшой разрез (примерно 850 мкм) в центре передней капсулы хрусталика, толстой базальной мембраны, которая окружает линзы ткани, и связанного с ним передней линзы эпителия, путем захвата ткани с одной щипцов в каждой руке и мягко дергая в противоположных направлениях.
3. Снимите массу волокна клеток, что составляет основную часть линзы ткани, dislodПеренять его от вложений в объектив эпителия и окружающих капсулы хрусталика гидро-элюции (подход, используемый в классическом хирургии катаракты, смоделированной на рисунке 1А).
4. Заполните 1 мл шприц с кончика иглы в 27,5 г с 300 мкл буфера TD. Вставьте кончик иглы в разрез, сделанный в передней капсуле хрусталика, и примерно на полпути в объектив.
5. Аккуратно нажмите на шприц для инъекций в TD буфер в массы линзы волокна клеток. Вводите между 50 и 200 мкл TD, и не более чем 300 мкл. Соблюдайте массу волокна клеток ослабив себя от эпителия и капсулы хрусталика.
6. Использование высокоточных пинцета, удалить остатков массы волокна клеток от объектива через переднюю сайта разреза.
   Примечание: Эта процедура оставляет задняя объектива базальной мембраны капсулы, в которой клетки волокна были присоединены лишена клеток и травмированного объектива эпителий просто, смежную с этого сайта.

3. Preparinг Раненый объектив для Ex Vivo культуры

1. Сведение объектива капсульный мешок, который образуется при хирургии катаракты, описанной выше на культуральную чашку, боковой клеток вверх, сделав пять разрезы в передней поверхности капсульного мешка.
2. Сокращение перпендикулярно к исходному разреза до экватора линзы. Свести результирующие пять "закрылки" по капсуле хрусталика с прикрепленным эпителия на стороне культура блюдо капсулы вниз, мобильный стороной вверх. Примечание экс естественных условиях раненого объектив должен теперь взять на звезды или flowerlike формы (рис 1B).
3. Для обеспечения капсулу на блюдо, нажмите мягко вниз с пинцетом в каждой точке звезды. Это позволит сделать небольшое углубление в пяти наиболее внешних концах эксплантата и привести к длительной привязанности к блюду.
   Примечание: Это можно повредить капсулу во время этой процедуры, и поэтому важно обеспечить капсулу на блюдо как можно ближе к кончикам FLAPS это возможно, а также сделать наименьшее количество точек крепления, насколько это возможно (как правило, два, максимум три за клапаном).
4. Снимите буфер TD от 35 мм блюдо и заменить его 1,5 мл подогретого СМИ. Накройте блюдо 35мм с крышкой и место в инкубаторе (37 ° С, 5% СО _2).

4. Разделение Центральной миграционной зоны (CMZ), где реэпителизацию раненых Площадь задней капсулы происходит, от оригинала Приложении зона (Oaz) объектива эпителиальных клеток, для количественного анализа.

Примечание: клетки начинают двигаться в область CMZ сразу в ответ на повреждение. По дня в культуре достаточное количество клеток мигрируют через CMZ для молекулярной и биохимического анализа, после разделения CMZ и Oaz по микро-рассечение ^23. Этот протокол включает в себя удаление одной створки (Oaz) одновременно с раненой области капсулы.

1. Соблюдайте Demarкатион, четко видны под микроскопом рассекает, между Oaz и CMZ (рис 2А). Использование двух высокоточных пинцета, захватить с обеих щипцов на краю OAZ / CMZ линии, один раз, прилегающей к другу, по обе стороны от линии (рис 2A, B, стрелка).
2. Использование одной рукой / один щипцы на стороне CMZ продолжать держаться раненого культуры, в то время как с другой стороны / щипцы, осторожно потяните Oaz по линии OAZ / CMZ. CMZ легко отделяется от Oaz вдоль этой линии. Продолжить вдоль этой линии вокруг всей культуре до двух регионах не полностью разделены.
3. Изучите разделенных Oaz и CMZ фракции для молекулярного анализа, такие как РНК-Seq ²⁴ или биохимического анализа, такие как вестерн-блоттинга или совместного иммунопреципитацией ^23,25.

Результаты

Создано Экс Vivo Модель для изучения процесса заживления ран на родном микросреды клеток

Чтобы исследовать механизмы, участвующие в регуляции заживления эпителия в родном микросреды клеток, клинически значимых экс естественных макет модель хирургии катаракты...

Обсуждение

Here is described a technique for preparing a culture model of wound repair that involves performing an ex vivo cataract surgery on chick embryo lenses after their removal from the eye. The lens epithelium responds to this clinically relevant wounding with a repair process that closely mimics that which occurs in vivo, and shares features with wound repair in other epithelial tissues^2,4. While the protocol is straightforward and simple to follow, performing mock cataract surgery with embryoni...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	S271-3	Use at 140 mM in TD Buffer
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	P217-500	Use at 5 mM in TD Buffer
Sodium Phosphate (Na2HPO4)	Sigma	S0876	Use at 0.7 mM in TD Buffer
D-glucose (Dextrose)	Fisher Scientific	D16-500	Use at 0.5 mM in TD Buffer
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-1	Use at 8.25 mM in TD Buffer
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144-500	Use to pH TD buffer to 7.4
Media 199	GIBCO	11150-059
L-glutamine	Corning/CellGro	25-005-CI	Use at 1% in Media199
Penicillin/streptomycin	Corning/CellGro	30-002-CI	Use at 1% in Media199
100 mm petri dishes	Fisher Scientific	FB0875711Z
Stericup Filter Unit	Millipore	SCGPU01RE	Use to filter sterilize Media
Dumont #5 forceps (need 2)	Fine Science Tools	11251-20
35 mm Cell Culture Dish	Corning	430165
27 G 1 ml SlipTip with precision glide needle	BD	309623
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-11
Standard Forceps	Fine Science Tools	91100-12
Other Items Needed: General dissection instruments,  fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37.7°C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting microscope