הקמת קלינית רלוונטי<em&gt; Ex Vivo</em&gt; דגם ניתוח קטרקט מוק לחקירת תיקון פצע אפיתל במייקרו-סביבה של ילידים

Summary

Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.

Abstract

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells’ native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens¹. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.

Introduction

ניתוח הקטרקט הרלוונטי מבחינה קלינית, מדומה, לשעבר vivo מודל ריפוי פצעי אפיתל המתואר כאן פותח כדי לספק כלי לחקר המנגנונים המווסתים את התיקון של רקמות האפיתל בתגובה לפציעה. תכונות עיקריות שנועדו ביצירת מודל זה כלול 1 תנאים) ובלבד שמשוכפלים מקרוב את התגובה בvivo לנפצע בהגדרת תרבות, 2) להקל בויסות אלמנטי הרגולציה של תיקון, ו- 3) יכולת תמונת תהליך התיקון, בשלמותו, בזמן אמת. האתגר, לכן, היה ליצור מודל תרבות שבה ניתן היה ללמוד, ולטפל, לתקן פצע אפיתל במייקרו-הסביבה האם של התאים. הזמינות של מודל פצע-תיקון זה פותחת אפשרויות חדשות לזיהוי רמזי איתות אנדוגני ממטריצת חלבונים, ציטוקינים וכמוקינים המסדירים את תהליך התיקון. בנוסף, המודל אידיאלי לבחינה איךn האפיתל הוא מסוגל לנוע כגיליון קולקטיבי מחדש epithelialize אזור פצע ^2,3, ולקביעת השושלת של תאי מנהיג mesenchymal בשולי הפצע שפועלים בהכוונת ההגירה הקולקטיבית של האפיתל נפצע ^4. מודל זה גם מספק פלטפורמה שעם לזהות תרופות שיכולים לקדם את ריפוי פצע יעיל ולמנוע תיקון פצע חריג ^5.

יש כבר מספר דגמי פצע-תיקון זמינים, הן בתרבות וin vivo, שספק את רוב מה שידוע על תהליך תיקון הפצע היום. במודלים של בעלי חיים פציעה, כגון קרנית ^6-12 ועור ^13-17, יש את ההזדמנות ללמוד את התגובה של הרקמה לפציעתם בהקשר של כל מתווכי התיקון שיכול להיות מעורב בתהליך, כוללים תרומות מ מערכת עצבים כלי דם ו. עם זאת, יש מגבלות למניפולציה של ההתנסותתנאים נפשיים in vivo, וזה עדיין לא ניתן לבצע מחקרי הדמיה של תגובת תיקון in vivo, רציף ולאורך זמן. לעומת זאת, רוב דגמי תרבות במבחנה פצע-תיקון, כגון פצע השריטה, ניתן להשפיע בקלות ואחריו לאורך זמן, אבל חסרים את ההקשר הסביבתי של לימוד ריפוי פצעים ברקמות in vivo. בעוד מודלים vivo לשעבר מציעים את היתרון של לימוד תהליך תיקון פגיעה ברציפות לאורך זמן בהקשר של מייקרו-הסביבה של התאים בשילוב עם היכולת לווסת את הרגולטורים המולקולריים של תיקון בכל נקודה בתהליך זמן, יש כמה דגמים שמתאימים אלה פרמטרים.

כאן מתואר הליך כדי ליצור vivo לשעבר פצע אפיתל מאוד לשחזור ריפוי תרבויות שלשכפל התגובה של רקמת האפיתל לפציעה פיזיולוגית. שימוש בעדשה עובר אפרוח כמקור רקמות, vivo לשעבר MOCניתוח קטרקט k מתבצע. העדשה היא רקמה אידיאלית לשימוש עבור מחקרים אלה שכן הוא בתוך כמוסת קרום במרתף עבה עצמאי, avascular, לא innervated, וללא כל סטרומה קשורה ^18,19. במחלות של בני אדם, ניתוח קטרקט מתייחס לאובדן ראייה עקב עננות של העדשה, וכרוך בהסרת מסת תאי עדשת סיבים, הכוללת את חלק הארי של העדשה. חזון ניתוח קטרקט בעקבות משוחזר באמצעות ההחדרה של עדשה תוך-עינית מלאכותית. ניתוח הקטרקט, באמצעות הסרת תאי סיבים, גורם תגובת פציעה באפיתל העדשה הסמוכה, שמגיב בepithelialization מחדש של האזור האחורי של הקפסולה העדשה שנכבש על ידי תאי הסיבים. בניתוח קטרקט, כמו ברוב תגובות תיקון הפצע, יש לפעמים מתרחש תוצאה חריגה fibrotic לתגובת ריפוי הפצע, הקשורים בהופעתה של myofibroblasts, אשר בעדשה ידועה כאחורי Capsule העננות ^20-22. על מנת ליצור את מודל ריפוי פצע ניתוח קטרקט, ניתוח קטרקט הוא חיקה בעדשות הוסרו מן העין עובר אפרוח לייצר פגיעה פיזיולוגית. הסרת מייקר תוצאות תאי עדשת סיבים באזור פצע עגול מאוד עקבי מוקף תאי אפיתל העדשה. אוכלוסיית תא זה נשארה מחובר היטב לכמוסת הקרום במרתף עדשה והוא נפגע על ידי ההליך כירורגי. תאי האפיתל להעביר על האזור הערום של הקרום במרתף אנדוגני לרפא את הפצע, בראשות אוכלוסייה של תאי mesenchymal vimentin העשיר הידועים בתהליך תיקון תאי מנהיג ^1. בעזרת מודל זה התגובה של האפיתל לפציעה ניתן דמיין בקלות ואחריו עם זמן בהקשר של מייקרו-הסביבה של התאים. התאים נגישים לשינויים בביטוי או ההפעלה של המולקולות צפויות לשחק תפקיד בתיקון פצע. תכונה חזקה של ההוא מודל הוא היכולת לבודד ולחקור שינויי הגירה ספציפית במסגרת ריפוי פצעים. היכולת להכין מספר גדול של תרבויות בגילים תואמות vivo לשעבר ריפוי פצע ללימודים היא יתרון נוסף של מודל זה. לפיכך, מערכת מודל זה מספקת הזדמנות ייחודית ללהפריד מנגנוני תיקון פצע ותרופות מבחן להשפעתם על תהליך ריפוי פצע. מודל ניתוח קטרקט המדומה vivo לשעבר צפוי להיות תחולה רחבה, מתן משאבים קריטיים לחקר מנגנונים של תיקון פציעה.

Protocol

הפרוטוקול הבא עומד בהנחיות הטיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש אוניברסיטת תומס ג'פרסון ועם הצהרת ארוו לשימוש בבעלי חיים במחקר חזון.

1. התקנה והכנת עדשות לתרבות Ex Vivo פצע

1. הנח שלוש 100 מ"מ צלחות פטרי ב, זרימה למינרית סטרילי. מלא שתי צלחות פטרי באמצע הדרך עם חיץ טריס / דקסטרוז (חיץ TD, 140 מ"מ NaCl, 5 מ"מ KCl, 0.7 מ"מ Na ₂ PO _4, 5 מ"מ D-גלוקוז, 8.25 מ"מ טריס בסיס, pH 7.4 עם HCl) ב RT , עוזב את ריק שלישי. תקשורת ותרבות טרום חמה (199 מדיה בתוספת, 1% L- גלוטמין ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין) עד 37 ^{מעלות צלסיוס}
   הערה: הפצע הסטנדרטי ריפוי תקשורת והתרבות הוא סרום ללא, כפי שקורה בvivo; עם זאת, ניתן לגדל תרבויות פצע-תיקון בהצלחה בתנאים שהוגדרו בתקשורת הכוללים סרום או גורמים אחרים.
2. הסר ד העוברי הפורהאיי 15 ביצת אפרוח ליבורנו לבנה מחממה (מוחזק ב37.7 מעלות צלזיוס עם נדנדה עדינה)
3. מקום שנבחרה ביצה בזרימה למינרית ומחוץ נקי של פגז עם אתנול 70% מבקבוק לשטוף. לנהל את כל ההליכים המפורטים להלן בתנאים אספטיים בזרימה למינרית, תוך שימוש בפתרונות וכלים סטריליים.
4. לפצח תוכן ביצה ומקום לצלחת פטרי 100 מ"מ הריקים. לערוף עובר באמצעות מלקחיים סטנדרטיים ומספריים עדינים. מניחים את ראש עובר אפרוח בצלחת פטרי המכילה מאגר TD ולהשליך כיאות את השארית של העובר. לחלופין לשמור על הראשים עוברים אפרוח במאגר TD לתקופה קצרה של זמן, לא יותר מ -15 דקות.
5. מניחים את ראש עובר אפרוח על מכסה צלחת פטרי. בעזרת מלקחיים דיוק גבוהים, להסיר את העדשה יחד עם ההומור שלה מצורף זגוגית מהעין ברצף הבא. לצבוט את החלק האחורי של העין עם המלקחיים כדי ליצור פתח קטן בחלק האחורי של העין.
6. לאחר מכן, לתפוס את הומור זגוגי wמלקחיים ה- i ובעדינות למשוך על הזגוגית בתנועת גלגול, הזגוגית עם העדשה מצורפת, וחילצה מן העין. עדשת מקום / זגוגית בצלחת פטרי שנותרה המכילה מאגר TD. לאפשר העדשות להישאר במאגר TD לא יותר מ -30 דקות.
7. הזז את העדשה למכסה צלחת פטרי חדש תחת מיקרוסקופ לנתח. בשלב זה לבצע את כל הפעולות תחת מיקרוסקופ לנתח. עם מלקחיים דיוק גבוהים לצחצח בזהירות כל גוף הריסים (תאי פיגמנט) שחלצו עם העדשה באמצעות קצה המלקחיים, לוקח זהירות שלא לפגוע ברקמת העדשה.
   הערה: הסרת גוף הריסים מבטיחה כי סוגי תאים שאינם אנדוגני לעדשה אינם כלולים בתרבות תיקון פצע.
8. הפרד את העדשה מהזגוגית עם מלקחיים דיוק גבוהים על ידי צובט את הגוף הזגוגי מהקשר שלה עם הקפסולה העדשה האחורית.
9. באמצעות דיוק גבוה מלקחיים להעביר את העדשה לירידה קטנהשל חיץ TD (כ -200 μl) בצלחת תרבית רקמת 35mm.

2. ניתוח קטרקט מוק הבמה

1. לכוון את העדשה בירידה של חיץ TD בצלחת 35 מ"מ עם ההיבט הקדמי של העדשה פונה כלפי מעלה.
   הערה: הקדמי של העדשה מזוהה בקלות על ידי הנוכחות של טבעת צפופה ברקמה שמציינת את הגבול בין קדמי ואזור קו המשווה של האפיתל העדשה. לעומת זאת, יש העדר סימונים על האחורי של הקפסולה העדשה שתאי עדשת הסיבים מחוברים.
2. שימוש בשני מלקחיים דיוק גבוהים לעשות חתך קטן (כ 850μm) במרכז הקפסולה הקדמית העדשה, הקרום במרתף העבה המקיף את רקמת העדשה, ואפיתל העדשה קדמית הקשורים אליו, תוך כדי אחיזה ברקמה עם מלקחיים בכל יד ו בעדינות מושך בכיוונים מנוגדים.
3. הסר את מסת תאי סיבים, מה שהופך את חלק הארי של רקמת עדשה, dislodגינג מנספחיו לאפיתל העדשה ומקיפה כמוסת עדשה על ידי הידרו-elution (גישה המשמשת בניתוחי קטרקט קלאסיים, דגם באיור 1 א).
4. ממלאי מזרק 1 מיליליטר עם קצה מחט 27.5 G עם 300 μl של חיץ TD. הכנס את קצה המחט לתוך החתך שנעשה בכמוסת העדשה הקדמית, ובערך באמצע הדרך לעדשה.
5. בעדינות לדכא את מזרק הזרקת חיץ TD למסת תאי סיבי עדשה. להזריק בין 50 ל 200 TD μl, ולא יותר מ -300 μl. שים לב למסת תאי סיבי התרופפות עצמו מכמוסת האפיתל ועדשה.
6. בעזרת מלקחיים דיוק גבוהים, להסיר את מסת תאי סיבים משוחררת מהעדשה דרך אתר החתך הקדמי.
   הערה: הליך זה יוצא הקפסולה העדשה האחורית קרום במרתף כדי שתאי הסיבים היו קשורים ערום של תאים, ואפיתל עדשה נפצע רק בסמוך לאתר זה.

3. ומתכונניםז העדשות הפצועים לאקס תרבות Vivo

1. לשטח את שקית קופסית העדשה, הנובעת מניתוח הקטרקט שתואר לעיל על צלחת התרבות, צד עד תא, על ידי ביצוע חמישה חתכים בהיבט הקדמי של תיק קופסית.
2. חותך בניצב לאתר החתך המקורי ועד לקו המשווה של הכדור. שטחו את חמישה "הדשים" התוצאה של כמוסת עדשה עם אפיתל המצורף בצד כמוסת צלחת התרבות למטה, בצד עד תא. שים לב לעדשה נפצעה vivo לשעבר עכשיו צריך לקחת על כוכב או צורה דמוית פרחים (ראה איור 1).
3. כדי להבטיח את הקפסולה לצלחת, עיתונות ברכות למטה עם המלקחיים בכל נקודה של הכוכב. זה יהפוך את כניסה קטנה בחמשת הטיפים מחוץ ביותר של explant ולגרום לקובץ מצורף מתמשך לצלחת.
   הערה: ניתן לפגוע בכמוסה במהלך הליך זה ולכן חשוב להבטיח את הקפסולה לצלחת הקרובה לטיפים של פלורידהנ.ב. ככל האפשר, כמו גם להפוך את הכמות המינימאלית של נקודות הבטחת ככל האפשר (בדרך כלל שתיים, מקסימום שלושה לדש).
4. הסר את חיץ TD מצלחת 35mm ולהחליף אותו עם 1.5 מיליליטר של תקשורת מחוממת מראש. מכסה את צלחת 35mm עם המכסה שלה ומקום בחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2).

4. הפרדה של מרכז הגירת האזור (CMZ), שבו מחדש epithelialization של האזור הפצוע בקפסולה אחורית מתרחש, מהקובץ המצורף המקורי האזור (OAZ) של תאי אפיתל העדשה, לניתוח כמותי.

הערה: התאים מתחילים לנוע לאזור CMZ מייד בתגובה לפציעה. ביום אחד בתרבות מספיק תאים נודדים ברחבי CMZ לניתוח מולקולרי וביוכימיים, הבאים הפרדת CMZ וOAZ על ידי מיקרו לנתיחה ^23. פרוטוקול זה כרוך ההסרה של כנף אחת (OAZ) בכל פעם מהאזור הפצוע של הקפסולה.

1. שים לב Demarקטיון, נראה בבירור מתחת למיקרוסקופ לנתח, בין OAZ וCMZ (ראה איור 2 א). שימוש בשני מלקחיים דיוק גבוהים, לתפוס בשני המלקחיים בקצה קו OAZ / CMZ, אחד רק בסמוך לאחר, משני צדי הקו (ראה איור 2 א, ב, חץ).
2. שימוש ביד אחת / אחד מלקחיים בצד CMZ להמשיך להחזיק בתרבות הפצועה, בעוד עם היד / מלקחיים אחרים, משוך בעדינות את OAZ לאורך קו OAZ / CMZ. CMZ קלות מפריד מOAZ לאורך הקו הזה. תמשיך לאורך הקו הזה מסביב לכל התרבות עד שני האזורים מופרדים לחלוטין.
3. ללמוד את השברים המופרדים OAZ וCMZ לניתוח מולקולרי כמו ²⁴ או ביוכימיים ניתוח RNA-Seq כגון כתם מערבי או שיתוף immunoprecipitation ^23,25.

תוצאות

Ex Vivo דגם נוצר כדי ללמוד את תהליך ריפוי הפצע במייקרו-הסביבה האם של התאים

לחקור מנגנונים מעורבים בויסות ריפוי פצע של האפיתל במייקרו-הסביבה המקומית של התאים, מודל ניתוח קטרקט רלוונטי קליני vivo לשעבר מדומה נוצר. מודל זה נוצר ...

Discussion

Here is described a technique for preparing a culture model of wound repair that involves performing an ex vivo cataract surgery on chick embryo lenses after their removal from the eye. The lens epithelium responds to this clinically relevant wounding with a repair process that closely mimics that which occurs in vivo, and shares features with wound repair in other epithelial tissues^2,4. While the protocol is straightforward and simple to follow, performing mock cataract surgery with embryoni...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	S271-3	Use at 140 mM in TD Buffer
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	P217-500	Use at 5 mM in TD Buffer
Sodium Phosphate (Na2HPO4)	Sigma	S0876	Use at 0.7 mM in TD Buffer
D-glucose (Dextrose)	Fisher Scientific	D16-500	Use at 0.5 mM in TD Buffer
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-1	Use at 8.25 mM in TD Buffer
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144-500	Use to pH TD buffer to 7.4
Media 199	GIBCO	11150-059
L-glutamine	Corning/CellGro	25-005-CI	Use at 1% in Media199
Penicillin/streptomycin	Corning/CellGro	30-002-CI	Use at 1% in Media199
100 mm petri dishes	Fisher Scientific	FB0875711Z
Stericup Filter Unit	Millipore	SCGPU01RE	Use to filter sterilize Media
Dumont #5 forceps (need 2)	Fine Science Tools	11251-20
35 mm Cell Culture Dish	Corning	430165
27 G 1 ml SlipTip with precision glide needle	BD	309623
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-11
Standard Forceps	Fine Science Tools	91100-12
Other Items Needed: General dissection instruments,  fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37.7°C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting microscope