الحث المباشر للمكون للدم البطانة Endothelium والدم عن طريق overexpression من العوامل المحفزة النسخ في الإنسان الخلايا الجذعية

Summary

This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.

Abstract

خلال التنمية، تنشأ الخلايا المكونة للدم من مجموعة فرعية متخصصة من الخلايا البطانية، البطانة مكون للدم (HE). تطوير النمذجة سعادة في المختبر أمر ضروري للدراسات الميكانيكية للانتقال-البطانية المكونة للدم ومواصفات المكونة للدم. هنا، نحن تصف طريقة لتحريض الفعال للسعادة من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) عن طريق overexpression من مجموعات مختلفة من عوامل النسخ. يتم استخدام مزيج من ETV2 وGATA1 أو GATA2 TFS للحث على سعادة مع إمكانية عموم الدم النخاعي، في حين أن مجموعة من GATA2 وعوامل النسخ TAL1 يسمح لإنتاج سعادة مع محمر وإمكانات النواءات. إضافة إلى LMO2 GATA2 والجمع بين TAL1 يسرع إلى حد كبير التمايز ويزيد إنتاج خلايا محمر والنواءات. يوفر هذا الأسلوب وسيلة فعالة وسريعة لسعادة تحريض من hPSCs ويسمح لمراقبة البطانية-hematopoietiج الانتقالية في صحن الثقافة. ويتضمن البروتوكول إجراءات hPSCs تنبيغ وتحليل ما بعد تنبيغ معالي والأسلاف الدم.

Introduction

قدرة فريدة من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) لتجديد الذات والتمايز إلى خلايا الطبقات الجرثومية الثلاث، بما في ذلك الدم، وجعلها أداة قيمة للدراسات الميكانيكية للتنمية المكونة للدم، والنمذجة من أمراض الدم، وفحص المخدرات، دراسات السمية، وتطوير العلاجات الخلوية. لأن تشكيل الدم في العائدات الجنين من البطانة مكون للدم (HE) من خلال الانتقال للدم البطانية ^1،2، وتوليد سعادة في الثقافات سيكون ضروريا لدراسة الآليات الجزيئية التي تنظم البطانية إلى الانتقال للدم ومواصفات المكونة للدم. وتستند الأساليب الحالية للدراسات سعادة على تحريض التمايز hematoendothelial في المجاميع (EBS) مع إضافة السيتوكينات المكونة للدم ^3-5، وcoculture من hPSCs مع خلايا انسجة-تكون الدم داعمة ^6،7 أو في الثقافات ثنائية الأبعاد مع خارج الخلية المصفوفات وجytokines ^8،9. وتستند هذه الأساليب التمايز الكلاسيكية على إدخال الإشارات الخارجية المؤثرة على سطح الخلية وبدء مجموعات من المسارات الجزيئية التي تؤدي في نهاية المطاف إلى تفعيل برنامج النسخي توجيه التنمية hematoendothelial. وهكذا، فإن كفاءة hPSCs التفرقة في هذه الأنظمة تعتمد على الاستقراء الفعال لتلك الإشارات، نقل الإشارة إلى النواة، وتفعيل الناتجة من المنظمين النسخي محددة. وبالإضافة إلى ذلك، ودراسة سعادة في الثقافات التمايز التقليدية تتطلب خطوة إضافية لعزل سعادة الخلايا باستخدام فرز الخلايا. هنا، نحن تصف بروتوكول بسيط للتحريض مباشر من معالي والدم عن طريق overexpression من عوامل النسخ المكونة للدم. يسمح هذا الأسلوب للتحريض الفعال للسعادة في طبق والملاحظة المباشرة من البطانية على الانتقال للدم دون الحاجة لعزل سعادة باستخدام إجراء فرز الخلايا المرهقة.

تشكيل معالي والدم من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان يمكن أن يتسبب بكفاءة عن طريق overexpressing عدد قليل من عوامل النسخ (TFS). الجمع الأمثل للTFS قادرة على إحداث قوية على عموم النخاعي تكون الدم من hPSCs يشمل ETV2 وGATA1 أو GATA2. في المقابل، مزيج من GATA2 وTAL1 يدفع erythromegakaryocytopoiesis ^10. برمجة hPSCs من خلال overexpression من هذه العوامل يفرق hPSCs مباشرة إلى VE-نذل ⁺ CD43 ^- CD73 ^{- سعادة} الخلايا التي يكتسب تدريجيا النمط الظاهري للدم الذي حدده التعبير في وقت مبكر للدم علامة CD43 ^7. هذا الأسلوب القائم على lentiviral للبرمجة مباشرة لالبشري المحفزة طريقة الخلايا الجذعية ينطبق على الجيل معالي وخلايا الدم للدراسات الميكانيكية، دراسات البطانية إلى الانتقال للدم، وتنظيم النسخي التنمية المكونة للدم والمواصفات. على الرغم من أن جيصف بروتوكول urrent إنتاج الدم باستخدام التعبير التأسيسي للالجينات المحورة، يمكن الحصول على نتائج مماثلة باستخدام تعديل مرنا ^10.

Protocol

1. الاستعدادات الفيروسات والنسخ عامل دمج

1. إعداد الحلول مع pSIN-EF1α lentiviral التعبير البلازميد التي تحتوي على الحمض النووي تشفير البروتين لETV2، GATA1، GATA2، TAL1 وLMO2 (الجدول 1).
2. قياس تركيز ونقاء الاستعدادات البلازميد المستخدمة لإنتاج lentiviral عن طريق تسجيل امتصاص الأشعة فوق البنفسجية مع معمل في 230 نانومتر و 260 نانومتر، و 280 نانومتر. تعتبر التحضيرات DNA مما يدل A260 / 280 و A260 / 230 القيم أكبر من 1.8 عموما نوعية جيدة: مذكرة. قد يشير انخفاض A260 / 280 القيم تلوث البروتين، في حين انخفضت A260 / 230 القيم تشير الشوائب مع أملاح أو بعض المذيبات مثل الفينول. الموصى بها تركيز البلازميد هو 1-3 ميكروغرام / ميكرولتر.
3. إنتاج lentiviruses لtransductions كما هو موضح في البروتوكولات التي تم نشرها مسبقا ^11. تحريض سعادة مع إمكانية عموم الدم النخاعي يتطلب شارك في التعبير عن ETV2 وGATA1، أو ETV2 وGATA2.تحريض سعادة مع إمكانية erythro- والنواءات يتطلب GATA2 وTAL1. إضافة LMO2 تحسن كبير في العائد من الخلايا erythro النواءات من hPSCs بحضور GATA2 وTAL1 ^10.

2. بروتوكول الثقافة hPSCs

1. تنمو الخلايا الجذعية المحفزة في مستعمرات ضيقة مع حواف حادة إلى 70-80٪ confluency قبل subculturing. المستعمرات علامة وإزالة متباينة بشكل عفوي قبل الركض الخلايا.
2. تمييع التجاري جل المصفوفة خارج الخلية (انظر الجدول 2) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وألواح معطف 6 جيدا بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، أو لمدة ساعة واحدة على الأقل في 37 ° C قبل استخدامها. قبل الركض الخلايا، ونضح المصفوفة، إضافة 2 مل من culturemedium كاملة تجارية جديدة (انظر الجدول 2) والحفاظ على لوحات في 37 ° C، 5٪ CO _{2 حتى} الخلايا جاهزة للزرع.
3. hPSCs مرور
   1. ASPIRAالشركة المصرية للاتصالات المتوسطة من بئر واحد متكدسة لوحة 6 جيدا مع hPSCs وإضافة 1.5 مل من قبل تحسنت Dispase حل II (2 ملغ / مل في DMEM / F12، تعقيمها عن طريق الترشيح من خلال 0.22 ميكرون مرشحات). احتضان لمدة 5-7 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO _{2 حتى} حواف المستعمرات تبدأ لرفع من على سطح الأرض.
   2. حل نضح Dispase الثاني وبعناية غسل المستعمرات مرتين عن طريق إضافة وثم الشفط 2 مل من الطازجة المتوسطة DMEM / F12. ثم، وذلك باستخدام 5 مل المصلية ماصة الزجاج، فصل hPSCs مع 3 مل من جديد التجاري مستنبت كاملة (انظر الجدول 2) من قبل pipetting تعليق الخلية صعودا وهبوطا عدة مرات.
   3. إضافة 0.5 مل من خلية إلى تعليق كل بئر من لوحة 6 جيدا تحتوي على 1.5 مل من التجاري مستنبت كاملة (انظر الجدول 2). تستنهض الهمم لوحة ذهابا وإيابا واليمين إلى اليسار عدة مرات لضمان توزيع الخلية موحدة عند توضيع لوحة في الحاضنة. حفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO _{2 ل 1}8-24 ساعة.
   4. القادم المتوسطة التغيير يوم لالعذبة التجاري مستنبت كاملة (انظر الجدول 2) ودراسة hPSCs التشكل. النتائج الركض الناجحة في مستعمرات صغيرة تعلق جيدا الاحتفاظ hPSC التشكل. يجب أن تغذى hPSCs مع 2.5-3 مل freshmedium لكل بئر على أساس يومي وpassaged كل 4-5 أيام في ما لا يزيد عن 70-80٪ التقاء.
      ملاحظة: إذا كان الحفاظ على hiPSCs على الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFS)، فإنها تحتاج إلى أن يتم تحويلها إلى ظروف خالية من تغذية وpassaged 2-3 مرات قبل تنبيغ لضمان كفاءة التمايز.

3. تحريض Hematoendothelial Pprecursors من hPSCs (اليوم 0، تنبيغ من hPSCs)

1. لإعداد رد فعل المتوسطة الجمع بين 1.3 مل من التجاري الكامل المصل خالية المتوسطة (انظر الجدول 2)، فيروس، polybrene، وY27632 ROCK المانع (الجدول 1): إضافة 1.3 ميكرولتر من 10 ملي ROCK المانع إلى 1.3 مل المتوسطة إلى concentra النهائينشوئها من 10 ميكرومتر، وpolybrene إلى النهائي تركيز 6 ميكروغرام / مل.
   1. إضافة كمية مناسبة من التركيز الفيروسي (ق) بتركيز نهائي من 0،5-1،0 زارة الداخلية (تعدد العدوى) من كل فيروس لكل خلية. الحفاظ على رد فعل المتوسطة على الجليد أو على 4 درجات مئوية حتى تعليق خلية واحدة مستعدة لذلك.
      ملاحظة: نفس الكمية من وزارة الداخلية لكل الفيروس في GATA1 / ETV2، GATA2 / TAL1، وأخلاط GATA2 / TAL1 / رد فعل LMO2 هو الأمثل لتحريض التمايز. الثقافات ومع ذلك، في ETV2 / GATA2 transduced مضاعفة وزارة الداخلية لGATA2، نسبة إلى ETV2، يعزز التمايز. ويوصى 2 لوزارة الداخلية ETV2 و1 وزارة الداخلية GATA2 (على سبيل المثال إذا يقدر التركيز الفيروسي حوالي 6.8 × 10 ⁷ الجسيمات / مل، إضافة 10 ميكرولتر من ETV2 و 20 ميكرولتر من GATA2 مركزات الفيروسية إلى: ذلك، لهذه الثقافات، ونسبة 1 0.68 × 10 ⁶ خلايا في رد الفعل ETV2 / GATA2 واحد في 35 ملم بئر من لوحة 6 جيدا).
2. إعداد hPSCs في المعل خلية واحدةension.
   1. تنمو hPSCs في ظروف خالية من وحدة التغذية كما هو موضح في القسم 2. في يوم 4 بعد مرور الماضي، نلاحظ كثافة الخلايا والتشكل تحت مجهر مقلوب. يجب hPSCs تنمو في مستعمرات ضيقة مع حواف حادة مع عدم وجود التمايز عفوية وتصل ~ 60-70٪ confluency في يوم تنبيغ.
   2. نضح المتوسطة، إضافة 1.5-2 مل من تفكك خلية التجاري كاشف (الجدول 1) لكل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية مع CO ₂ 5٪ لمدة 5-7 دقيقة.
   3. جمع الخلايا في كميات متساوية من المتوسط ​​كاملة التجاري (أنظر الجدول 2) مع 10 ميكرومتر من ROCK المانع، عد الخلايا وتحديد الجدوى. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق ثم الخلايا resuspend في المتوسط ​​كاملة التجاري مع 10 ميكرومتر من ROCK المانع إلى تركيز من 3،4-5 × 10 ⁶ خلايا لكل مل.
      ملاحظة: بقاء الخلية أمر بالغ الأهمية لنجاح تنبيغ الفيروسية والتمايز لاحق.عادة، يجب أن بقاء الخلية قبل تنبيغ تتجاوز 90٪.
3. إضافة 200 ميكرولتر من تعليق الخلية، التي تحتوي على ،68-1 X10 ⁶ خلايا، إلى 1.3 مل من وسط التفاعل أعد في 3.1.
4. نضح حل مصفوفة من بين عشية وضحاها المغلفة لوحة 6 جيدا أعد في 2.2.، نقل خليط التفاعل إلى بئر واحدة من لوحة 6 جيدا وتوزيع الخلايا بالتساوي. احتضان عند 37 درجة مئوية مع CO ₂ 5٪ لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة يجب أن ترفق لا يقل عن 80٪ من الخلايا إلى المصفوفة.

4. تحريض Hematoendothelial السلائف من hPSCs (يوم 07/01)

1. 24 ساعة بعد تنبيغ، وإزالة المتوسطة المحتوية على الفيروس وغسل الخلايا المرفقة مع التجاري مستنبت خلايا غير مكتملة (انظر الجدول 1) ثم قم بإضافة 3 مل لكل بئر من التجاري مستنبت خلايا غير مكتملة تحتوي على السيتوكينات المكونة للدم: SCF 100 نانوغرام / مل، TPO 50 نانوغرام / مل، bFGF 20 نانوغرام / مل (يشار إليها فيما 3F المتوسطة).
2. استبدال مجموع المتوسطة مع الطازجة 3F المتوسطة في أيام 2 و 3 و 4 يوم لإزالة الخلايا الميتة والحطام. بعد يوم 4، عندما العائمة الخلايا المكونة للدم في الظهور، استبدال نصف 3F المتوسطة كل يوم مع الحفاظ على الحجم الإجمالي في 4 مل.
   ملاحظة: pSIN-EF1α البلازميدات التعبير lentiviral تتضمن بوروميسين الجينات المقاومة مما يسمح لاختيار الإيجابية للخلايا transduced. 1 ميكروغرام / مل من بوروميسين يمكن أن تضاف إلى متوسطة خلال 1-2 أيام الأولى من التمايز للقضاء على أي hPSCs غير متمايزة المتبقية.
3. مراقبة مورفولوجيا الخلايا في يوم 4 تحت مجهر مقلوب: مجموعات ضيقة من الخلايا البطانية مع التشكل نموذجية تبدأ في الظهور (أرقام 2A، 3A). خلايا الدم مستديرة تظهر من يوم 5 إلى يوم 7 من التمايز، في حين أن بعض المناطق قد تحتفظ hPSCs التشكل. تحليل معالي والتمايز للدم كما هو موضح أدناه.
   ملاحظة: تختلف hematoendothelial الناجحالنتائج ينتقم في إنتاج خلايا الدم التي تظهر خلايا الجولة سهل الانكسار كما فضفاضة يعلق على الخلايا البطانية مسطحة الأساسية. هذه الخلايا تتكاثر بنشاط تشكيل مجاميع صغيرة، وأخيرا فصل وتعويم (أرقام 2A و 3A). خلايا الدم الحية يمكن تمييزها بصريا من الخلايا الميتة والموت على أساس قدرتها على عكس ضوء وتوسيع في ظروف الثقافة.

5. تحليل مكون للدم البطانة Endothelium (HE) مرحلة التمايز.

1. الكشف عن تشكيل سعادة بين أيام 3 و 4 من التمايز عن طريق الملاحظة المجهرية للخلايا مع التشكل البطانية. لا توجد العائمة خلايا الدم في الثقافة في هذه المرحلة من التمايز. ويمكن التأكد بحضور سعادة التي كتبها تلطيخ مناعي وتحليل تدفق cytometric باستخدام VE كادهيرين، CD73، CD43 CD226 والأجسام المضادة.
   1. لتقييم تشكيل سعادة بواسطة تدفق cytometric الخلايا استخدام التحليل في اليوم 3ويوم 4 من تجربة واحدة. جمع الخلايا التي يحتضنها الثقافات مع التجاري تفكك خلية الكاشف (انظر الجدول 1) لمدة 5-10 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO ₂ ثم استخدام ما يصل إلى 1 × 10 ⁵ خلايا لكل رد فعل تلطيخ (التدفق الخلوي الإجراء تلطيخ هو موضح في ^12).
      ملاحظة: VE كادهيرين ⁺ HE خلايا اكتساب التعبير في وقت مبكر للدم علامة CD226، ولكنها تفتقر إلى التعبير عن CD73 CD43 ^و6. في المقابل، خلايا غير HE-التعبير عن CD73 (أرقام 2B، 3B).
2. تلطيخ المناعي للhPSC المستمدة-HE.
   1. غسل أحادي الطبقة تعلق الخلايا مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ثم إصلاح الخلايا في 4٪ امتصاص العرق 30-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   2. غسل الخلايا مرة أخرى مع برنامج تلفزيوني ثم permeabilize باستخدام 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   3. غسل الخلايا في PBS 2-3 مرات ثم احتضان فيعازلة تمنع تتألف من برنامج تلفزيوني مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، لمدة 30 إلى 120 دقيقة.
   4. يعد حل تلطيخ، تحتوي على كل الأجسام المضادة الأولية (1: 1000 تمييع) الماوس CD43 مكافحة الإنسان والأرنب مكافحة البشرية VE كادهيرين في برنامج تلفزيوني مع 5٪ FBS، (الجدول 1).
   5. نضح عازلة تمنع من الخلايا وإضافة 1 مل لكل بئر من العازلة تلطيخ مع الأجسام المضادة الأولية المضافة؛ احتضان 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة، أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
   6. غسل الخلايا ثلاث مرات عن طريق إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني مع 5٪ FBS.
   7. إعداد العازلة تلطيخ الثاني، التي تحتوي على الأجسام المضادة الثانوية في 1: 500 التخفيف في برنامج تلفزيوني مع 5٪ FBS: حمار المضادة للأرنب مترافق مع صبغة الفلورسنت الأخضر، ومكافحة فأر مترافق مع صبغ أحمر فلوري (الجدول 1). إضافة 1 مل لكل بئر من العازلة تلطيخ الثانوي ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
   8. يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني دون المصل. خلايا صمة عار مع حل 300 نانومتر دابي العمل في DH2 O لمدة 10-15 دقيقة.
   9. غسل الخلايا مع PBS مرتين وإضافة 2-3 مل من برنامج تلفزيوني إلى الخلايا بشكل جيد مع الملون. مراقبة مضان مع الأخضر والأحمر والأزرق مرشحات المجهر.

6. تحليل المستحثة لدم السلائف

1. الحفاظ على الثقافات تمايز الخلايا العائمة حتى تتوسع بشكل ملحوظ، ما يصل الى 10-14 يوما، وتغيير نصف 3F المتوسطة، كما هو موضح في 3.1، كل يومين.
2. فصل وجمع تمييز الطبقات الوحيدة من الخلايا عن طريق علاج الخلايا مع كاشف تفارق خلية التجاري (انظر الجدول 1) لمدة 5-10 دقيقة عند 37 ° C، 5٪ CO _2.
3. أداء التدفق الخلوي باستخدام مكافحة VE كادهيرين، CD43 CD45 والأجسام المضادة لتقييم تكون الدم في الثقافات ^12. لاحظ أن جزء كبير من الخلايا، وتصل إلى 40٪ من الخلايا ETV2 وGATA2 transduced، وشارك في يعبر عن VE-نذل وCD43. الأجسام المضادة التالية يمكن أن تستخدم لكشف الأنساب الخلية المحددة التالية هxpansion أو تمايز الناجم عن الأسلاف الدم: CD235a (خلايا محمر)، CD41a (النواءات)، CD32 (جميع أنواع خلايا الدم النخاعي)، CD66b (العدلات) وCD163 (الضامة).
4. أداء CFC-فحص باستخدام وسيلة مولد الرمع التجاري (الجدول 1) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
   1. نقل 1-2 × 10 ⁴ خلايا في 3 مل من المتوسط ​​مولد الرمع التجاري (أنظر الجدول 3) لتقييم عدد من الخلايا المكونة للمستعمرة وأنواع المستعمرات المكونة للدم. كثافة البذر مثلى تسمح لتحديد وعزل المستعمرات واحد التي تنمو بشكل منفصل عن بعضها البعض وتتداخل لا. قد تختلف كثافة بذر بين التجارب اعتمادا على كفاءة التمايز، ولكن يجب أن لا تتجاوز 1 × 10 ⁴ خلايا لكل 1 مل من المتوسط ​​مولد الرمع التجاري.
   2. خلط الخلايا في المتوسط ​​مولد الرمع التجاري من قبل vortexing لطيف، ونقل 3 مل من تعليق لمدة 35 ملم أطباق مرفق منخفضة للغايةلفحص مركبات الكربون الكلورية فلورية، 1.5 مل من التعليق على كل طبق. توزيع بالتساوي المتوسطة واحتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO ₂ لمدة 14 يوما. تجنب إزعاج الأطباق. مراقبة تشكيل مستعمرة في يوم 7 ويوم 10 من الفحص.
   3. تحديد والاعتماد المستعمرات المكونة للدم وفقا لالأشكال التضاريسية بها في يوم 14.

النتائج

يظهر الرسم التخطيطي للسعادة وتحريض الدم من hPSCs التي كتبها overexpression من عوامل النسخ في الشكل 1. ETV2 مع GATA1 أو GATA2 مزيج يدفع تكون الدم عموم النخاعي، في حين أن GATA2، TAL1 +/- مزيج LMO2 يدفع في الغالب تكون الدم erythro-النواءات. كلا مجموعات TF يسببها مباشرة خلايا سعادة التي حولت ل?...

Discussion

طريقة المبين أعلاه للدم تمايز hPSCs التي كتبها overexpression من TFS، يمثل نهجا السريع والفعال للجيل معالي والنخاعي وerytho magakaryocytic الأسلاف من hESCs وiPSCs، مما يسمح للإنتاجية تصل إلى 30 ملايين خلايا الدم من مليون الخلايا الجذعية المحفزة ^10. هذه الطريقة تعرض التمايز المستمر في عدة...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells.
pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61061	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61063	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61062	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61062	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61064	Lentiviral Vector
Hexadimethrine bromide (Polybrene)	Sigma-Aldrich	107689-10G	Cationic polymer used to increase the efficiency of infection
Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor	STEMCELL Technologies	72302	RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A11105-01	Cell Dissociation Reagent
Incomplete (growth factor- free) culture medium                                              mTeSR1 Custom formulation	WiCell Research Institute (Madison, WI)	MCF	Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb
human SCF	Peprotech	300-07	Premium grade
human TPO	Peprotech	300-18	Research grade
human FGF-basic	Peprotech	100-18B	Premium grade
CD144 (VE-cad) FITC	BD Biosciences	560411	Endothelial marker (FACS)
CD226 PE	BD Biosciences	338305	Hematopoietic (FACS)
CD43 PE	BD Biosciences	560199	Hematopoietic (FACS)
CD73 APC	R&D Systems	FAB5795A	Endothelial marker (FACS)
CD45 APC	BD Biosciences	555485	Hematopoietic (FACS)
7AAD	Life Technologies	A1310	Live/Dead assay (FACS)
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Cell fixation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML	Permeabilization
FBS	Fisher Scientific	SH3007003	Fetal bovine serum
Mouse anti-human CD43	BD Biosciences	551457	Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining
Rabbit anti-human VE-cadherin	BenderMedSystem	BMS158	Primary (IF)
Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated	JacksonResearch	715-486-152	Secondary (IF)
Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated	JacksonResearch	715-516-150	Secondary (IF)
DAPI nucleic acid stain	Life Technologies	D1306	Live/Dead assay (IF)
Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched	STEMCELL Technologies	4435	CFC-assay
Wright Stain solution	Sigma -Aldrich	32857	Staining cytospins
Table 2. hPSCs culture.
Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs)	WiCell Research Institute (Madison, WI)	hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells	hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers
Complete serum-free medium for culture of hPSCs                                                    mTeSR1 media	WiCell Research Institute (Madison, WI)	M500	Serum-free  medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs
Matrigel	BD Biosciences/ Corning	356234	Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs
DMEM/F-12, powder	Life Technologies	12500-062	Basal Medium
HyClone Dulbecco's PBS powder	Fisher Scientific	dSH30013.04	PBS
Dispase II, powder	Life Technologies	17105-041	Neutral protease, Cell dissociation
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration.
Primer's Name	Forward (Fwd)  5’ -->3’	Reverse (Rev) 5’-->3’	Discription
pSIN EF1a Fwd	TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA	--	EF1a promoter sequence
GATA1 Rev	--	TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC	Coding Region
GATA2 Rev	--	GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG	Coding Region
TAL1 Rev	--	AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT	Coding Region
LMO2 Rev	--	GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC	Coding Region
ETV2 Rev	--	GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC	Coding Region