Induzione diretta di Hemogenic endotelio e Sangue da sovraespressione di fattori di trascrizione in cellule staminali pluripotenti umane

Riepilogo

This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.

Abstract

Durante lo sviluppo, cellule ematopoietiche derivano da un sottoinsieme specializzato di cellule endoteliali, endotelio hemogenic (HE). Modellazione sviluppo HE in vitro è essenziale per gli studi meccanicistici della transizione endoteliale-ematopoietiche e le specifiche ematopoietiche. Qui, si descrive un metodo per l'induzione efficiente di SE da cellule umane pluripotenti staminali (hPSCs) mediante sovraespressione di diverse serie di fattori di trascrizione. La combinazione di ETV2 e GATA1 o GATA2 TF viene usato per indurre HE con potenziale pan-mieloide, mentre una combinazione di fattori di trascrizione e GATA2 TAL1 consente la produzione di HE con eritroide e potenziale megacariocitica. L'aggiunta di LMO2 a GATA2 e la combinazione TAL1 accelera notevolmente il differenziamento eritroide e aumenta e le cellule megacariociti produzione. Questo metodo fornisce un mezzo efficace e rapido di induzione HE da hPSCs e permette l'osservazione del endoteliale-hematopoietic transizione in un piatto di coltura. Il protocollo comprende le procedure hPSCs trasduzione e analisi post-trasduzione di SE e progenitori sangue.

Introduzione

La capacità unica di cellule staminali umane pluripotenti (hPSCs) per auto-rinnovarsi e di differenziarsi in cellule di tre foglietti embrionali, compreso il sangue, li rendono uno strumento prezioso per gli studi meccanicistici di sviluppo ematopoietiche, la modellazione di malattie del sangue, lo screening di stupefacenti, studi di tossicità, e lo sviluppo di terapie cellulari. Perché la formazione del sangue nei proventi embrioni da endotelio hemogenic (HE) attraverso una transizione ematopoietiche endoteliale ^1,2, la generazione di SE nelle culture sarebbe essenziale per studiare i meccanismi molecolari che regolano la endoteliale transizione ematopoietiche e le specifiche ematopoietiche. Metodi attuali per studi di HE si basano sull'induzione di differenziazione hematoendothelial in aggregati (EBS) con l'aggiunta di citochine ematopoietiche ^3-5, e di co-coltura con cellule stromali hPSCs Emopoiesi-solidale ^6,7 o nelle culture bidimensionali con extracellulare matrici e cytokines ^8,9. Questi metodi di differenziazione classici si basano sull'introduzione di segnali esterni che agiscono sulla superficie cellulare e avvio cascate di percorsi molecolari che conducono alla attivazione del programma trascrizionale guidare lo sviluppo hematoendothelial. Quindi, l'efficienza di hPSCs differenziazioni in questi sistemi si basa su una induzione effettivo di questi segnali, la trasduzione del segnale al nucleo, e l'attivazione di specifiche risultante regolatori trascrizionali. Inoltre, lo studio di HE in colture di differenziazione convenzionali richiede l'ulteriore fase di isolare HE cellule usando separazione delle cellule. Qui, descriviamo un semplice protocollo per l'induzione diretta di SE e sangue sovraespressione di fattori di trascrizione ematopoietiche. Questo metodo consente l'induzione efficiente HE in un piatto e osservazione diretta della endoteliale transizione ematopoietiche senza la necessità di isolamento di HE utilizzando una procedura di ordinamento cellule ingombrante.

Formazione di SE e del sangue da cellule staminali umane pluripotenti possono essere efficacemente indotti da iperespressione pochi fattori di trascrizione (TFS). La combinazione ottimale di TF in grado di indurre robusto emopoiesi pan-mieloide da hPSCs include ETV2 e GATA1 o GATA2. Al contrario, la combinazione di GATA2 e TAL1 induce erythromegakaryocytopoiesis ^10. Programmazione hPSCs attraverso la sovraespressione di questi fattori differenzia hPSCs direttamente al VE-cad ⁺ CD43 ^- CD73 ^- HE cellule che acquisiscono gradualmente il fenotipo ematopoietiche definito mediante l'espressione dei primi ematopoietiche marcatore CD43 ^7. Questo metodo basato lentivirali-per la programmazione diretta del metodo di cellule staminali pluripotenti umane è applicabile per la generazione di HE e cellule del sangue per studi meccanicistici, studi di endoteliale di transizione ematopoietiche e regolazione trascrizionale di sviluppo ematopoietiche e le specifiche. Sebbene la cprotocollo orrente descrive la produzione di sangue usando l'espressione costitutiva dei transgeni, risultati simili possono essere ottenuti utilizzando modificato mRNA ^10.

Protocollo

1. Preparativi Virus e fattore di trascrizione combinazioni

1. Preparare soluzioni con PSIN-EF1α lentivirale plasmide di espressione contenente proteine ​​DNA codificante per ETV2, GATA1, GATA2, TAL1 e LMO2 (Tabella 1).
2. Misurare la concentrazione e la purezza dei preparati plasmide usato per la produzione lentivirale registrando assorbimento UV con uno spettrofotometro a 230 nm, 260 nm e 280 nm. Nota: Preparati DNA dimostrano A260 / 280 e A260 / 230 valori superiori a 1.8 sono generalmente considerati di buona qualità. Lower A260 / 280 valori possono indicare contaminazione di proteine, mentre bassi valori A260 / 230 indicano le impurità con sali o qualche solvente quale il fenolo. Concentrazione plasmide consigliato è di 1-3 mg / mL.
3. Produrre lentivirus per trasduzioni come descritto in protocolli precedentemente pubblicati ^11. Induzione di SE con un potenziale pan-mieloide richiede un co-espressione di ETV2 e GATA1, o ETV2 e GATA2.Induzione di SE con un potenziale erythro- e megacariocitica richiede GATA2 e TAL1. L'aggiunta di LMO2 migliora significativamente la resa di cellule eritro-megacariocitica dal hPSCs in presenza di GATA2 e TAL1 ^10.

2. hPSCs Cultura protocollo

1. Crescere cellule staminali pluripotenti in colonie stretti con bordi taglienti al 70-80% di confluenza prima subcoltura. Mark e rimuovere spontaneamente differenziati colonie prima passaging cellule.
2. Diluire commerciale gel matrice extracellulare (vedi Tabella 2) secondo le istruzioni del produttore e piastre coat 6 pozzetti notte a 4 ° C, o per almeno un'ora a 37 ° C prima dell'uso. Prima passaging cellule, aspirare la matrice, aggiungere 2 ml di fresco culturemedium completo commerciale (vedi Tabella 2) e tenere le piastre a 37 ° C, 5% CO ₂ finché le cellule sono pronte per la semina.
3. HPSCs Passage
   1. Aspirate mezzo da un pozzetto confluenti di una piastra da 6 pozzetti con hPSCs e aggiungere 1,5 ml di soluzione di pre-riscaldato dispasi II (2 mg / ml in DMEM / F12, sterilizzata mediante filtrazione attraverso filtri 0,22 micron). Incubare per 5-7 minuti a 37 ° C, 5% CO ₂ finché i bordi di colonie cominciano a sollevare dalla superficie.
   2. Aspirare soluzione dispasi II e lavare accuratamente le colonie due volte con l'aggiunta e poi aspirando 2 ml di fresco medio DMEM / F12. Quindi, utilizzando un 5 ml sierologica pipetta di vetro, dissociare hPSCs con 3 ml di terreno di coltura fresco commerciale completa (vedi Tabella 2) pipettando sospensione cellulare su e giù diverse volte.
   3. Aggiungere 0,5 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti contenente 1,5 ml di mezzo di coltura completo commerciale (vedi Tabella 2). Agitare piatto avanti e indietro e da destra a sinistra diverse volte per garantire una distribuzione uniforme delle cellule quando collocare la piastra nell'incubatore. Mantenere cellule a 37 ° C, 5% CO _{2 per} 18-24 ore.
   4. Il prossimo cambiamento giorno medio e fresco commerciale terreno di coltura completo (vedi Tabella 2) ed esaminare hPSCs morfologia. Risultati passaging successo in piccole colonie, ben attaccati, di sostegno HPSC morfologia. hPSCs devono essere alimentati con 2,5-3 ml freshmedium per bene su una base quotidiana e diversi passaggi ogni 4-5 giorni a non più del 70-80% di confluenza.
      NOTA: Se hiPSCs sono stati mantenuti su fibroblasti embrionali di topo (MEF), hanno bisogno di essere trasferiti in condizioni prive di alimentazione e diversi passaggi 2-3 volte prima di trasduzione per garantire la differenziazione efficiente.

3. Induzione di Hematoendothelial Pprecursors da hPSCs (giorno 0, trasduzione di hPSCs)

1. Per preparare mezzo di reazione si combinano 1,3 ml di terreno completo commerciale privo di siero (vedi Tabella 2), virus, polibrene, e Y27632 inibitore ROCK (Tabella 1): aggiungere 1,3 ml di inibitore ROCK 10 mm a 1,3 ml di mezzo ad una concentrazione finalezione di 10 pM, e polibrene una concentrazione finale 6 mg / ml.
   1. Aggiungere una quantità appropriata di concentrato virale (s) ad una concentrazione finale di 0,5-1,0 MOI (molteplicità di infezione) di ogni virus per cellula. Mantenere mezzo di reazione in ghiaccio oa 4 ° C fino a quando la sospensione di cellule singole è pronto.
      NOTA: La stessa quantità di MOI per ogni virus nel GATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1, e miscele GATA2 / TAL1 / reazione LMO2 è ottimale per l'induzione della differenziazione. Culture Tuttavia, in ETV2 / GATA2 trasdotte raddoppio MOI per GATA2, relativi a ETV2, migliora la differenziazione. Pertanto, per queste culture, rapporto 1: 2 per MOI di ETV2 e 1 MOI di GATA2 è raccomandato (ad esempio, se concentrato virale è stimato a circa 6,8 x ¹⁰ 7 particelle / ml, aggiungere 10 ml di ETV2 e 20 ml di concentrati virali GATA2 a 0,68 x 10 ^{6 cellule per} una reazione ETV2 / GATA2 in un pozzo 35 millimetri di un 6-pozzetti).
2. Preparare hPSCs in una singola cella di sospensione.
   1. Crescere hPSCs in condizioni di assenza di alimentazione, come descritto nella sezione 2. Il giorno 4 dopo l'ultimo passaggio, osservare densità cellulare e la morfologia sotto un microscopio invertito. hPSCs dovrebbero crescere in colonie stretti con spigoli vivi senza differenziazione spontanea e raggiungere ~ 60-70% di confluenza il giorno della trasduzione.
   2. Aspirare il terreno, aggiungere 1,5-2 ml di reagente commerciale dissociazione delle cellule (Tabella 1) per pozzetto e incubare a 37 ° C con 5% di CO _{2 per} 5-7 minuti.
   3. Raccogliere le cellule in volumi uguali di terreno completo commerciale (vedi tabella 2) con 10 micron di inibitore ROCK, contare le cellule e determinare la vitalità. Cellule pellet per centrifugazione a 200 xg per 5 minuti e poi risospendere le cellule in terreno completo commerciale con 10 pM di inibitore ROCK ad una concentrazione di 3.4-5 x 10 ^{6 cellule per} ml.
      NOTA: La vitalità cellulare è fondamentale per la trasduzione virale di successo e la successiva differenziazione.Tipicamente, la vitalità cellulare prima trasduzione deve superare il 90%.
3. Aggiungere 200 microlitri della sospensione cellulare, contenenti 0.68-1 x10 ⁶ cellule in 1,3 ml di mezzo di reazione preparata in 3.1.
4. Aspirare la soluzione matrice dal rivestita 6 pozzetti durante la notte preparato in 2.2., Trasferire la miscela di reazione ad un pozzetto di un 6-pozzetti e distribuire le cellule in modo uniforme. Incubare a 37 ° C con 5% di CO _{2 per} 24 ore. Dopo 24 ore almeno l'80% delle cellule deve essere collegato alla matrice.

4. Induzione Hematoendothelial precursori da hPSCs (giorno 1-7)

1. 24 ore dopo la trasduzione, rimuovere medio virus contenente e lavare le cellule attaccate con commerciale terreno di coltura cellulare incompleto (vedi Tabella 1) e poi aggiungere 3 ml per pozzetto di commerciale terreno di coltura cellulare incompleto contenente citochine ematopoietiche: SCF 100 ng / ml, TPO 50 ng / ml, bFGF 20 ng / ml (di seguito denominati 3F-medium).
2. Sostituire medio totale con fresco 3F-media nei giorni 2, 3 e 4 giorno per rimuovere le cellule morte e detriti. Dopo 4 giorni, quando le cellule ematopoietiche galleggianti stanno emergendo, sostituire la metà del 3F-medio ogni altro giorno, mantenendo il volume totale a 4 ml.
   NOTA: PSIN-EF1α plasmidi di espressione lentivirali incorporano puromicina gene di resistenza consentendo così la selezione positiva di cellule trasdotte. Il 1 ug / ml di puromicina può essere aggiunto a un terreno durante i primi 1-2 giorni di differenziazione per eliminare gli eventuali residui hPSCs indifferenziate.
3. Osservare morfologia cellulare il giorno 4 sotto un microscopio invertito: gruppi ristretti di cellule con morfologia tipica endoteliali iniziano a comparire (figure 2A, 3A). Globuli rotondi appare dal giorno 5 al 7 ° giorno di differenziazione, mentre alcune aree possono mantenere hPSCs morfologia. Analizzare HE e differenziazione ematopoietiche come descritto di seguito.
   NOTA: Riuscito diverso hematoendothelialiation provoca la produzione di globuli che appaiono cellule rotonde come rifrangenti vagamente attaccato alle cellule endoteliali piatte sottostanti. Queste cellule proliferano attivamente formando piccoli aggregati, ed eventualmente staccare e galleggiante (Figure 2A e 3A). Cellule del sangue dal vivo possono essere visivamente distinta dalle cellule morte e morenti in base alla loro capacità di riflettere la luce ed espandere in condizioni di coltura.

5. Analisi di Hemogenic endotelio (HE) Fase di differenziazione.

1. Rilevare la formazione di HE tra i giorni 3 e 4 di differenziazione mediante osservazione microscopica delle cellule con morfologia endoteliale. Non ci sono globuli galleggianti in coltura in questa fase di differenziazione. La presenza di SE può essere confermata mediante colorazione immunofluorescenza e citometria a flusso di analisi utilizzando anticorpi VE-caderina, CD73, CD43 e CD226.
   1. Per valutare la formazione di HE by cellule utilizzare l'analisi di citometria a flusso il giorno 3e il giorno 4 da un esperimento. Raccogliere le cellule incubando di culture con reagente commerciale dissociazione delle cellule (vedi Tabella 1) per 5-10 minuti a 37 ° C, 5% di CO ₂ e quindi utilizzare fino a 1 x 10 ⁵ cellule per reazione di colorazione (citometria a flusso procedura di colorazione descritta ^12).
      NOTA: VE-caderina ⁺ HE cellule acquisiscono espressione della precoce ematopoietiche marcatore CD226, ma manca l'espressione di CD73 e CD43 ^6. Al contrario, le cellule non esprimono CD73 HE (figure 2B, 3B).
2. Immunofluorescenza per HPSC di derivazione HE.
   1. Lavare il monostrato di cellule allegata con tampone fosfato (PBS) e quindi fissare le cellule in 4% paraformaldeide da 30 a 60 min a temperatura ambiente.
   2. Lavare le cellule nuovamente con PBS e quindi permeabilize usando 0,1% Triton X-100 in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente.
   3. Lavare le cellule in PBS due a tre volte e poi incubaretampone di bloccaggio costituito da PBS con siero fetale bovino 10% (FBS), per 30 a 120 min.
   4. Preparare la soluzione di colorazione, contenente entrambi gli anticorpi primari (1: 1.000 diluizione) topo CD43 anti-umana e di coniglio anti-umane VE-caderina in PBS con 5% FBS, (Tabella 1).
   5. Aspirare il tampone di bloccaggio dalle cellule e aggiungere 1 ml per pozzetto di tampone colorazione con gli anticorpi primari aggiunti; incubare 3 ore a temperatura ambiente, o per una notte a 4 ° C.
   6. Lavare le cellule tre volte con l'aggiunta di 2 ml di PBS con 5% FBS.
   7. Preparare un secondo buffer di colorazione, contenente anticorpi secondari a diluizione 1: 500 in PBS con 5% FBS: asino anti-coniglio coniugato con colorante fluorescente verde, e anti-topo coniugato con colorante fluorescente rosso (Tabella 1). Aggiungere 1 ml per pozzetto di tampone colorazione secondaria e incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
   8. Lavare tre volte con PBS senza siero. Cellule macchia con 300 Nm DAPI soluzione di lavoro in dH2 O per 10-15 minuti.
   9. Lavare le cellule con PBS due volte e aggiungere 2-3 ml di PBS in bene con cellule colorate. Osservare fluorescenza con filtri microscopio verde, rosso e blu.

6. Analisi della indotte ematopoietiche precursori

1. Mantenere colture differenziazione fino cellule galleggianti espandono significativamente, fino a 10-14 giorni, cambiando la metà del 3F-mezzo, come descritto in 3.1, ogni due giorni.
2. Dissociano raccogli differenziando monostrati di cellule trattando le cellule con un reagente di dissociazione cellulare commerciale (vedi Tabella 1) per 5-10 min a 37 ° C, 5% di CO _2.
3. Eseguire la citometria a flusso utilizzando anti-VE-caderina, anticorpi CD43 e CD45 per valutare emopoiesi nelle culture ^12. Si noti che una grande frazione di cellule, fino al 40% delle cellule ETV2 e GATA2 trasdotte, co-esprime VE-cad e CD43. Gli anticorpi seguenti possono essere utilizzati per individuare linee cellulari specifiche e seguentiXpansion o differenziazione dei progenitori indotte sangue: CD235a (cellule eritroidi), CD41a (megacariocitica), CD32 (tutti i tipi di cellule mieloidi), CD66b (neutrofili) e CD163 (macrofagi).
4. Eseguire CFC-dosaggio con un mezzo clonogenico commerciale (Tabella 1) secondo le istruzioni del produttore.
   1. Trasferire 1-2 x 10 ⁴ cellule in 3 ml di terreno clonogenica commerciale (vedi Tabella 3) per valutare il numero di cellule che formano colonie e tipi di colonie ematopoietiche. Ottimale densità di semina consente l'identificazione e l'isolamento di singole colonie che crescono separatamente gli uni dagli altri e non si sovrappongono. Densità di semina può variare tra esperimenti in base all'efficienza differenziazione, ma non dovrebbe superare 1 x 10 ⁴ cellule per 1 ml di terreno clonogenica commerciale.
   2. Mescolare cellule in terreno clonogenica commerciale vortexando gentilmente, e trasferire 3 ml di sospensione per due 35 millimetri piatti ultra-basso di attaccoper CFC test, 1,5 ml di sospensione di ogni piatto. Distribuire uniformemente media e incubare a 37 ° C, 5% CO ₂ per 14 giorni. Evitare di disturbare i piatti; osservare la formazione di colonie il giorno 7 e il giorno 10 del test.
   3. Identificare e contare le colonie ematopoietiche, secondo le loro morfologie il giorno 14.

Risultati

Lo schema di SE e induzione sangue da hPSCs di sovraespressione di fattori di trascrizione è mostrato in Figura 1. ETV2 con combinazione GATA1 o GATA2 induce emopoiesi pan-mieloide, mentre un GATA2, TAL1 +/- combinazione LMO2 induce emopoiesi prevalentemente eritro-megacariocitica. Entrambe le combinazioni TF direttamente indotto cellule HE che in seguito trasformati in progenitori di sangue con una gamma diversa di differenziazione ematopoietiche. Differenziazione delle hPSCs dallo st...

Discussione

Il metodo sopra descritto per ematopoietiche differenziazione hPSCs di sovraespressione di TF, rappresenta un metodo veloce ed efficace per la generazione di HE e mieloidi e erytho-magakaryocytic progenitori da hESC e iPSCs, consentendo in tal modo la produzione di fino a 30 milioni di cellule del sangue dal un milione di cellule staminali pluripotenti ^10. Questo metodo esposto differenziazione consistente in più di hESC e iPSCs ^linee 10. Durante differenziazione per ETV2 e GATA2, fattori GATA1 no...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells.
pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61061	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61063	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61062	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61062	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61064	Lentiviral Vector
Hexadimethrine bromide (Polybrene)	Sigma-Aldrich	107689-10G	Cationic polymer used to increase the efficiency of infection
Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor	STEMCELL Technologies	72302	RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A11105-01	Cell Dissociation Reagent
Incomplete (growth factor- free) culture medium                                              mTeSR1 Custom formulation	WiCell Research Institute (Madison, WI)	MCF	Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb
human SCF	Peprotech	300-07	Premium grade
human TPO	Peprotech	300-18	Research grade
human FGF-basic	Peprotech	100-18B	Premium grade
CD144 (VE-cad) FITC	BD Biosciences	560411	Endothelial marker (FACS)
CD226 PE	BD Biosciences	338305	Hematopoietic (FACS)
CD43 PE	BD Biosciences	560199	Hematopoietic (FACS)
CD73 APC	R&D Systems	FAB5795A	Endothelial marker (FACS)
CD45 APC	BD Biosciences	555485	Hematopoietic (FACS)
7AAD	Life Technologies	A1310	Live/Dead assay (FACS)
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Cell fixation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML	Permeabilization
FBS	Fisher Scientific	SH3007003	Fetal bovine serum
Mouse anti-human CD43	BD Biosciences	551457	Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining
Rabbit anti-human VE-cadherin	BenderMedSystem	BMS158	Primary (IF)
Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated	JacksonResearch	715-486-152	Secondary (IF)
Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated	JacksonResearch	715-516-150	Secondary (IF)
DAPI nucleic acid stain	Life Technologies	D1306	Live/Dead assay (IF)
Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched	STEMCELL Technologies	4435	CFC-assay
Wright Stain solution	Sigma -Aldrich	32857	Staining cytospins
Table 2. hPSCs culture.
Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs)	WiCell Research Institute (Madison, WI)	hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells	hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers
Complete serum-free medium for culture of hPSCs                                                    mTeSR1 media	WiCell Research Institute (Madison, WI)	M500	Serum-free  medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs
Matrigel	BD Biosciences/ Corning	356234	Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs
DMEM/F-12, powder	Life Technologies	12500-062	Basal Medium
HyClone Dulbecco's PBS powder	Fisher Scientific	dSH30013.04	PBS
Dispase II, powder	Life Technologies	17105-041	Neutral protease, Cell dissociation
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration.
Primer's Name	Forward (Fwd)  5’ -->3’	Reverse (Rev) 5’-->3’	Discription
pSIN EF1a Fwd	TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA	--	EF1a promoter sequence
GATA1 Rev	--	TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC	Coding Region
GATA2 Rev	--	GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG	Coding Region
TAL1 Rev	--	AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT	Coding Region
LMO2 Rev	--	GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC	Coding Region
ETV2 Rev	--	GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC	Coding Region