Прямая индукция гемогенного эндотелия и крови сверхэкспрессией факторов транскрипции в человека плюрипотентные стволовые клетки

Резюме

This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.

Аннотация

Во время разработки, кроветворные клетки возникают из специализированного подмножества эндотелиальных клеток, кроветворный эндотелия (ОН). Развитие моделирования Его в пробирке имеет важное значение для механистических исследований эндотелия-гемопоэтических перехода и кроветворной спецификации. Здесь мы описываем способ эффективного индукции HE от человека плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) путем сверхэкспрессии различных наборов транскрипционных факторов. Сочетание ETV2 и GATA1 или GATA2 ТФ используется, чтобы вызвать он, пан-миелоидный потенциала, в то время как комбинация GATA2 и TAL1 факторов транскрипции позволяет для производства он, эритроидных и мегакариоцитарной потенциала. Добавление LMO2 к GATA2 и комбинации TAL1 существенно ускоряет дифференциацию и увеличивает эритроидной и мегакариоцитарной клеток производства. Этот метод обеспечивает эффективное и быстрое средство индукции Его из hPSCs и позволяет для наблюдения эндотелиальной-hematopoietiС переходом в культуральной чашке. Протокол включает в себя процедуры hPSCs трансдукции и пост-трансдукции анализ он и предшественники крови.

Введение

Уникальная способность человека плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) для самообновлению и дифференцировке в клетки трех зародышевых листков, в том числе крови, сделать их ценный инструмент для механистических исследований кроветворной развития, моделирования болезней крови, скрининг наркотиков, исследования токсичности и развитие клеточной терапии. Потому что образование в крови эмбриона выручки от гемогенного эндотелия (ОН) через эндотелиальной кроветворной перехода ^1,2, генерация HE в культурах бы важно изучить молекулярные механизмы, регулирующие эндотелиальные к кроветворной перехода и кроветворной спецификации. Современные методы исследований HE основаны на индукции дифференциации в hematoendothelial агрегатов (EBS) с добавлением гемопоэтических цитокинов ^3-5, и совместного культивирования в hPSCs с кроветворения-поддержку стромальных клеток ^6,7 или в двумерных культур с внеклеточной матрицы и сytokines ^8,9. Эти классические методы дифференциации основаны на введении внешних сигналов, действующих на поверхности клеток и инициирующих каскады молекулярных путей, которые в конечном итоге приводят к активации транскрипции программы руководящей hematoendothelial развития. Таким образом, эффективность hPSCs дифференциации в этих системах зависит от эффективной индукции этих сигналов, сигнальной трансдукции к ядру, и в результате активации специфических транскрипционных регуляторов. Кроме того, изучение HE в обычных культурах дифференцировки требует дополнительного шага изоляции HE клеток с использованием клеток сортировку. Здесь мы опишем простой протокол для прямого индукции он и крови по избыточной экспрессии кроветворных факторов транскрипции. Этот метод позволяет эффективно индукции HE в блюдо и непосредственного наблюдения за эндотелиальной к кроветворной перехода без необходимости выделения HE с использованием процедуры сортировки громоздким клеток.

Формирование он и кровь из человека плюрипотентных стволовых клеток может быть эффективно индуцируется с гиперэкспрессией всего несколько транскрипционных факторов (ТФ). Оптимальное сочетание ТФ, способных индуцировать надежную пан-миелоидный кроветворение из hPSCs включает ETV2 и GATA1 или GATA2. В отличие от этого, сочетание GATA2 и TAL1 вызывает erythromegakaryocytopoiesis ^10. Программирование hPSCs через гиперэкспрессией этих факторов отличает hPSCs непосредственно к VE-хама ⁺ CD43 ^- CD73 ^- клетки, которые HE постепенно приобретают кроветворную фенотип определяется выражением раннего маркера CD43 гемопоэтических ^7. Этот метод основан лентивирусов-за непосредственного программирования методом человека плюрипотентных стволовых клеток применяется для генерации он и клеток крови для механистических исследований, исследований эндотелиальных к кроветворной перехода и регуляции транскрипции гемопоэтических развития и спецификации. Хотя CПротокол омер текущего описано получение крови с помощью конститутивной экспрессии трансгенов, аналогичные результаты можно было бы получить с использованием модифицированной мРНК ^10.

протокол

1. Вирусные препараты и фактор транскрипции Комбинации

1. Готовят растворы с pSIN-EF1α лентивирусов плазмида экспрессии, содержащий ДНК, кодирующей белок по ETV2, GATA1, GATA2, TAL1 и LMO2 (Таблица 1).
2. Измерение концентрации и чистоты плазмидных составов, используемых для производства лентивирусов путем записи УФ-поглощению с помощью спектрофотометра при 230 нм, 260 нм, и 280 нм. Примечание: Препараты ДНК, демонстрирующие A260 / A260 280 и / 230 значения выше 1,8, как правило, считается хорошим качеством. Нижние A260 / 280 значение может указывать на заражение белка, тогда как более низкие A260 / 230 значения указывают примеси солей или с какой-то растворителе, таком как фенол. Рекомендуемая концентрация плазмида 1-3 мкг / мкл.
3. Продукция лентивирусы для каскадов, как описано в ранее опубликованных протоколов ^11. Индукция он с пан-миелоидный потенциала требует сотрудничества выражение ETV2 и GATA1 или ETV2 и GATA2.Индукция он с эритро- и мегакариоцитарной потенциала требует GATA2 и TAL1. Добавление LMO2 значительно улучшает выход эритро-мегакариоцитов клеток от hPSCs в присутствии GATA2 и TAL1 ^10.

2. hPSCs Культура протокол

1. Растут плюрипотентных стволовых клеток в труднодоступных колоний с острыми краями 70-80% слияния, прежде чем пересева. Марк и удалить спонтанно дифференцироваться колонии, прежде чем пассажей клеток.
2. Развести коммерческую внеклеточного матрикса геля (таблица 2) в соответствии с инструкциями производителя и покрытие 6-луночных планшетах в течение ночи при 4 ° С, или, по крайней мере, одного часа при 37 ° С до использования. Перед пассажей клетки, аспирация матрицу, добавьте 2 мл свежей коммерческой полной culturemedium (таблица 2) и держать пластины в 37 ° С, 5% СО ₂ до клетки готовы для посева.
3. Прохождение hPSCs
   1. Аспирате вещества из одной сливной лунку 6-луночного планшета с hPSCs и добавить 1,5 мл подогретого раствора диспаза II (2 мг / мл в DMEM / F12, стерилизуют фильтрацией через 0,22 мкм фильтры). Инкубировать в течение 5-7 мин при температуре 37 ° С, 5% СО ₂ до края колоний начинают поднимать с поверхности.
   2. Решение Аспирируйте диспазу II и тщательно мыть колонии дважды, добавив затем аспирации 2 мл свежей DMEM / F12 среде. Затем, используя 5 мл серологические пипетки стекла, отделить hPSCs с 3 мл свежего коммерческой полной культуральной среде (таблица 2) с помощью пипетки клеточной суспензии вверх и вниз несколько раз.
   3. Добавить 0,5 мл суспензии клеток в каждую лунку 6-луночного планшета, содержащего 1,5 мл коммерческой полной культуральной среде (таблица 2). Перемешайте пластину назад и вперед и справа налево несколько раз, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток при располагающий пластины в инкубатор. Сохранить клетки при 37 ° С, 5% СО ₂ в течение 18-24 ч.
   4. На следующий день изменение средней на свежий коммерческой полной культуральной среде (таблица 2) и проверьте hPSCs морфологию. Успешные результаты пассажей в небольших, хорошо прикрепленными колонии подпорных HPSC морфологию. hPSCs должны подаваться с 2,5-3 мл freshmedium за хорошо на ежедневной основе, и пассировать каждые 4-5 дней не более чем на 70-80% слияния.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если hiPSCs поддерживали на эмбриональных фибробластов мыши (МЭФ), они должны быть переданы в фидерных без условиях и пассировать 2-3 раза до трансдукции для обеспечения эффективного дифференциации.

3. Индукция Hematoendothelial Pprecursors от hPSCs (день 0, трансдукции hPSCs)

1. Для подготовки реакционную среду объединить 1,3 мл коммерческой полной среде без сыворотки (см таблицу 2), вирус, Полибрен и Y27632 ROCK ингибитор (таблица 1): добавить 1,3 мкл ингибитора ROCK 10 мм до 1,3 мл среды до конечной ConCentraние 10 мкм, и полибрен до конечной концентрации 6 мкг / мл.
   1. Добавить соответствующее количество вирусного концентрата (ов) в конечной концентрации 0,5-1,0 MOI (множественность инфекции) каждого вируса на клетку. Хранить реакционную среду на льду или при 4 ° С до тех пор, суспензии отдельных клеток не будет готов.
      Примечание: То же самое количество MOI для каждого вируса в GATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1, и смеси GATA2 / TAL1 / реакции LMO2 является оптимальным для индукции дифференцировки. Тем не менее, в ETV2 / GATA2 трансдуцированные культуры удвоения МВД для GATA2, по отношению к ETV2, повышает дифференциацию. Таким образом, для этих культур, отношение 1: 2 по МВД ETV2 и 1 МВД GATA2 рекомендуется (например, если вирусные концентрат оценивается приблизительно 6,8 х 10 ⁷ частиц / мл, добавляют 10 мкл ETV2 и 20 мкл GATA2 вирусных концентратов 0,68 ^× 10 6 клеток на одной реакции ETV2 / GATA2 в 35 мм лунку 6-луночного планшета).
2. Подготовка hPSCs в одном SUSP клетокension.
   1. Растут hPSCs в фидерных без условиях, как описано в разделе 2. На 4-й день после последнего прохода, наблюдать плотность клеток и морфологию под инвертированным микроскопом. hPSCs должны расти в плотных колониях с острыми краями, без спонтанной дифференцировки и достигать ~ 60-70% слияния в день трансдукции.
   2. Аспирируйте среднего, добавить 1,5-2 мл коммерческого реагента для диссоциации клеток (таблица 1) на лунку и инкубируют при 37 ° С с 5% СО ₂ в течение 5-7 мин.
   3. Сбор клеток в равных объемах коммерческой полной среде (таблица 2) с 10 мкМ ингибитора ROCK, подсчет клеток и определить жизнеспособность. Гранул клетки центрифугированием при 200 х г в течение 5 мин и затем вновь суспендируют клетки в полной среде коммерческой с 10 мкМ ингибитора ROCK до концентрации 3.4-5 х 10 ⁶ клеток на мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность клеток имеет решающее значение для успешного вирусного преобразования и последующей дифференциации.Как правило, жизнеспособность клеток, прежде чем трансдукции должна превышать 90%.
3. Добавить 200 мкл клеточной суспензии, содержащие 0.68-1 x10 ⁶ клеток, в 1,3 мл реакционной среде, приготовленной в разделе 3.1.
4. Аспирируйте матричного раствора, из ночной покрытием 6-луночного планшета, полученного в 2.2., Передача реакционной смеси до одну лунку 6-луночного планшета и распространять клетки равномерно. Инкубируют при 37 ° С с 5% СО ₂ в течение 24 часов. Через 24 часа, по крайней мере 80% клеток должны быть прикреплены к матрице.

4. Индукция Hematoendothelial прекурсоров из hPSCs (День 1-7)

1. 24 ч после трансдукции, удалить вирус-среде, содержащей и мыть прикрепленные клетки с коммерческой неполным культивирования клеток среды (см таблицу 1), а затем добавить 3 мл на лунку коммерческой неполным культивирования клеток среде, содержащей гемопоэтические цитокины: SCF 100 нг / мл, ТПО 50 нг / мл, оФРФ 20 нг / мл (в дальнейшем именуемые 3F-среде),
2. Заменить общую среду со свежим 3F-среды в дни 2, 3 и 4 день, чтобы удалить мертвые клетки и мусор. Через 4 дня, когда плавающие кроветворные клетки возникают, заменить половина 3F-среднего через день, сохраняя при этом общий объем в 4 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: pSIN-EF1α лентивирусный плазмиды экспрессии включают ген устойчивости к пуромицину тем самым позволяя позитивной селекции трансдуцированных клеток. 1-мкг / мл пуромицин может быть добавлен к среде в течение первых 1-2 суток дифференцировки для устранения любых остаточных недифференцированных hPSCs.
3. Соблюдайте морфологии клеток на 4-й день под инвертированным микроскопом: жесткие скопления клеток с типичной морфологией эндотелиальных начинают появляться (2А, 3А). Круглые клетки крови появляется из 5 день 7 день дифференцировки, в то время как в некоторых районах может сохранить hPSCs морфологию. Анализ он и кроветворной дифференциации, как описано ниже.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Успешное hematoendothelial отличаетсятельная приводит к получению клеток крови, которые появляются в рефрактильные круглые клетки слабо прикреплены к основных плоских эндотелиальных клеток. Эти клетки активно размножаются образуя небольшие агрегаты, и в конечном итоге снять и поплавок (2А и 3А). Текущие кровяные клетки могут быть визуально отличается от мертвых и умирающих клеток в зависимости от их способности отражать свет и расширения в условиях культивирования.

5. Анализ гемогенного эндотелия (ОН) Стадия дифференциации.

1. Обнаружение образование он сквозь дней 3 и 4 дифференциации микроскопическим наблюдением клеток с эндотелиальными морфологии. Там нет плавающие клетки крови в культуре на данном этапе дифференциации. Наличие он может быть подтвержден иммунофлуоресцентным окрашивания и проточной цитометрии анализ с использованием VE-кадгерин, CD73, CD226 и CD43 антитела.
   1. Для оценки образования HE с помощью проточной цитометрии использовать анализ клеток на 3-й деньи 4-й день от одного эксперимента. Собирают клетки путем инкубации культур с коммерческой диссоциации клеток реагентом (таблица 1) в течение 5-10 мин при температуре 37 ° С, 5% СО _2, а затем использовать до 1 × 10 ⁵ клеток на реакцию окрашивания (проточной цитометрии процедуры окрашивания, описанной в ^12).
      ПРИМЕЧАНИЕ: VE-кадгерин ⁺ ОН клетки приобретают экспрессию раннего маркера гемопоэтических CD226, но не хватает экспрессии CD73 и CD43 ^6. В отличие от этого, не-HE клетки CD73 выразить (цифры 2B, 3B).
2. Иммунофлуоресценции окрашивание HPSC-производного он.
   1. Промыть прилагаемый монослой клеток фосфатно-солевым буфером (PBS), а затем исправить клеток в 4% параформальдегид от 30 до 60 мин при комнатной температуре.
   2. Промывают клетки снова PBS и затем проницаемыми использованием 0,1% Тритона Х-100 в PBS в течение 20 мин при комнатной температуре.
   3. Вымойте клеток в PBS два-три раза, а затем инкубировать вблокирующем буфере, состоящий из PBS с 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), в течение от 30 до 120 мин.
   4. Подготовьте красящим раствором, содержащим как первичные антитела (1: 1,000 разведение) мышиного антитела против человеческого CD43 и кроличьим антителом против человека VE-кадгерин в PBS с 5% FBS, (Таблица 1).
   5. Аспирируйте блокирующий буфер из клеток и добавить 1 мл на лунку окрашивающего буфера с добавлением первичных антител; инкубировать 3 часа при комнатной температуре, или в течение ночи при 4 ° C.
   6. Промыть клетки три раза, добавив 2 мл PBS с 5% FBS.
   7. Подготовьте второй буфер окрашивания, содержащий вторичные антитела 1: 500 разбавление в PBS с 5% FBS: осла против кролика, конъюгированного с зеленым флуоресцентным красителем, и анти-мышь, конъюгированного с красным флуоресцентным красителем (Таблица 1). Добавить 1 мл на лунку вторичного буфера окрашивания и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 часа.
   8. Промыть три раза PBS без сыворотки. Пятно клетки с 300 нМ рабочего раствора DAPI в дН2 О в течение 10-15 мин.
   9. Вымойте клеток с PBS в два раза и добавить 2-3 мл PBS в хорошо окрашенных клеток. Соблюдайте флуоресценции с зелеными, красными и синими микроскопа фильтров.

6. Анализ индуцированных гемопоэтических прекурсоров

1. Поддержание дифференциации культур до плавающие клетки не расширить значительно, до 10-14 дней, меняя половину 3F-среде, как описано в 3.1, раз в два дня.
2. Разбить и собирать дифференциации монослоев клеток при обработке клеток с коммерческой диссоциации клеток реагентом (см таблицу 1) в течение 5-10 мин при 37 ° С, 5% СО _2.
3. Выполните проточной цитометрии с использованием анти-VE-кадгерина, CD43 и CD45 антитела, чтобы оценить кроветворение в культурах ^12. Обратите внимание, что большая часть клеток, вплоть до 40% от ETV2 и GATA2 трансдуцированных клеток, со-экспрессов VE-CAD и CD43. Следующие антитела могут быть использованы для определения специфических клеточных клонов следующий адресXpansion или дифференциация индуцированных клеток-предшественников крови: CD235a (эритроидных клеток), CD41a (мегакариоцитарной), CD32 (все виды клеток миелоидного), CD66b (нейтрофилы) и CD163 (макрофаги).
4. Выполните ХФУ-анализа с использованием коммерческого клоногенных среду (таблица 1) в соответствии с инструкциями изготовителя.
   1. Трансфер 1-2 х 10 ⁴ клеток в 3 мл коммерческой клоногенного среды (таблица 3), чтобы оценить количество колониеобразующих клеток и типов гемопоэтических колоний. Оптимальная плотность посева позволяет для идентификации и изоляции отдельных колоний, которые растут отдельно друг от друга и не пересекаются. Посев плотность может варьироваться от экспериментов в зависимости от эффективности дифференцировки, но не должна превышать 1 х 10 ⁴ клеток на 1 мл среды коммерческой образующих клоны.
   2. Смешайте клетки в коммерческой среде клоногенного нежным встряхивания и передать 3 мл суспензии двух 35 мм ультра-низкие блюд креплениядля CFC анализа 1,5 мл суспензии в каждую чашку. Распределить равномерно среду и инкубируют при 37 ° С, 5% СО ₂ в течение 14 дней. Избегайте нарушая блюда; наблюдать образование колоний на 7 день и 10 день анализа.
   3. Выявление и подсчет колоний кроветворных в соответствии с их морфологии на 14 день.

Результаты

Принципиальная схема он и индукции крови из hPSCs по избыточной экспрессии транскрипционных факторов показана на рис 1. ETV2 с GATA1 или GATA2 комбинации вызывает пан-миелоидный кроветворение, в то время как GATA2, TAL1 +/- LMO2 сочетание вызывает преимущественно эритро-мегакариоцитарной кров?...

Обсуждение

Описанный выше метод кроветворной дифференциации hPSCs по избыточной экспрессии ТФ, представляет собой быстрое и эффективный подход для генерации он и миелоидных и erytho-magakaryocytic предшественников из ЭСК и ИПСК, тем самым позволяя производить до 30 миллионов клеток крови из один миллион плю?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells.
pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61061	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61063	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61062	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61062	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61064	Lentiviral Vector
Hexadimethrine bromide (Polybrene)	Sigma-Aldrich	107689-10G	Cationic polymer used to increase the efficiency of infection
Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor	STEMCELL Technologies	72302	RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A11105-01	Cell Dissociation Reagent
Incomplete (growth factor- free) culture medium                                              mTeSR1 Custom formulation	WiCell Research Institute (Madison, WI)	MCF	Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb
human SCF	Peprotech	300-07	Premium grade
human TPO	Peprotech	300-18	Research grade
human FGF-basic	Peprotech	100-18B	Premium grade
CD144 (VE-cad) FITC	BD Biosciences	560411	Endothelial marker (FACS)
CD226 PE	BD Biosciences	338305	Hematopoietic (FACS)
CD43 PE	BD Biosciences	560199	Hematopoietic (FACS)
CD73 APC	R&D Systems	FAB5795A	Endothelial marker (FACS)
CD45 APC	BD Biosciences	555485	Hematopoietic (FACS)
7AAD	Life Technologies	A1310	Live/Dead assay (FACS)
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Cell fixation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML	Permeabilization
FBS	Fisher Scientific	SH3007003	Fetal bovine serum
Mouse anti-human CD43	BD Biosciences	551457	Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining
Rabbit anti-human VE-cadherin	BenderMedSystem	BMS158	Primary (IF)
Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated	JacksonResearch	715-486-152	Secondary (IF)
Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated	JacksonResearch	715-516-150	Secondary (IF)
DAPI nucleic acid stain	Life Technologies	D1306	Live/Dead assay (IF)
Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched	STEMCELL Technologies	4435	CFC-assay
Wright Stain solution	Sigma -Aldrich	32857	Staining cytospins
Table 2. hPSCs culture.
Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs)	WiCell Research Institute (Madison, WI)	hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells	hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers
Complete serum-free medium for culture of hPSCs                                                    mTeSR1 media	WiCell Research Institute (Madison, WI)	M500	Serum-free  medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs
Matrigel	BD Biosciences/ Corning	356234	Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs
DMEM/F-12, powder	Life Technologies	12500-062	Basal Medium
HyClone Dulbecco's PBS powder	Fisher Scientific	dSH30013.04	PBS
Dispase II, powder	Life Technologies	17105-041	Neutral protease, Cell dissociation
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration.
Primer's Name	Forward (Fwd)  5’ -->3’	Reverse (Rev) 5’-->3’	Discription
pSIN EF1a Fwd	TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA	--	EF1a promoter sequence
GATA1 Rev	--	TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC	Coding Region
GATA2 Rev	--	GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG	Coding Region
TAL1 Rev	--	AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT	Coding Region
LMO2 Rev	--	GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC	Coding Region
ETV2 Rev	--	GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC	Coding Region