La inducción directa de Hemogenic endotelio y la Sangre por la sobreexpresión de factores de transcripción en células madre pluripotentes Humanos

Resumen

This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.

Resumen

Durante el desarrollo, las células hematopoyéticas se derivan de un subconjunto especializado de las células endoteliales, el endotelio hemogenic (HE). HE desarrollo Modeling in vitro es esencial para estudios mecanísticos de la transición-endotelial hematopoyético y especificación hematopoyético. Aquí se describe un método para la inducción eficiente de SE a partir de células humanas pluripotenciales (hPSCs) mediante la sobreexpresión de diferentes conjuntos de factores de transcripción. La combinación de ETV2 y GATA1 o GATA2 TFS se utiliza para inducir HE con potencial de pan-mieloide, mientras que una combinación de factores de transcripción y GATA2 TAL1 permite la producción de HE con eritroide y megacariocítica potencial. La adición de LMO2 a GATA2 y la combinación TAL1 acelera sustancialmente la diferenciación y aumenta células eritroides y megacariocíticos producción. Este método proporciona un medio eficiente y rápida de HE inducción de hPSCs y permite la observación del endotelio hematopoietic transición en una placa de cultivo. El protocolo incluye procedimientos hPSCs transducción y análisis post-transducción de SE y progenitores de sangre.

Introducción

La capacidad única de células madre pluripotentes humanas (hPSCs) para auto-renovarse y diferenciarse en células de las tres capas germinales, incluyendo sangre, que sean una herramienta valiosa para los estudios sobre el mecanismo de desarrollo hematopoyético, el modelado de enfermedades de la sangre, la detección de drogas, Los estudios de toxicidad y el desarrollo de terapias celulares. Debido a la formación de la sangre en los embriones producto de endotelio hemogenic (HE) a través de una transición hematopoyético endotelial ^1,2, la generación de la ES en culturas sería esencial para estudiar los mecanismos moleculares que regulan la endotelial a la transición hematopoyético y especificación hematopoyético. Los métodos actuales para estudios de HE se basan en la inducción de la diferenciación hematoendothelial en los agregados (EBS) con la adición de citoquinas hematopoyéticas ^3-5, y de cocultivo con células estromales hPSCs-hematopoyesis de apoyo ^6,7 o en cultivos de dos dimensiones con extracelular matrices y moldes cytokines ^8,9. Estos métodos de diferenciación clásicos se basan en la introducción de señales externas que actúan en la superficie celular y que inician cascadas de vías moleculares que eventualmente conducen a la activación de programa transcripcional guiar el desarrollo hematoendothelial. Por lo tanto, la eficiencia de hPSCs diferenciaciones en estos sistemas se basa en una inducción efectiva de esas señales, la transducción de señales al núcleo, y la activación resultante de reguladores transcripcionales específicos. Además, el estudio de HE en cultivos de diferenciación convencionales requiere la etapa adicional de aislamiento de células HE usando la clasificación de células. Aquí se describe un protocolo sencillo para la inducción directa de HE y sangre por la sobreexpresión de factores de transcripción hematopoyéticas. Este método permite la inducción eficiente de HE en un plato y la observación directa del endotelial a la transición hematopoyéticas sin la necesidad de aislamiento de HE utilizando un procedimiento de clasificación de células engorroso.

Formación de SE y la sangre a partir de células madre pluripotentes humanas pueden ser inducidas de manera eficiente mediante la sobreexpresión a pocos factores de transcripción (TFS). La combinación óptima de TFS capaces de inducir robusta hematopoyesis-pan mieloide de hPSCs incluye ETV2 y GATA1 o GATA2. En contraste, la combinación de GATA2 y TAL1 induce erythromegakaryocytopoiesis ^10. Programación hPSCs través de la sobreexpresión de estos factores que diferencia hPSCs directamente a la VE-cad ⁺ CD43 ^- CD73 ^- células HE que adquieren gradualmente el fenotipo hematopoyético definirse por la expresión de principios del CD43 marcador hematopoyético ^7. Este método basado en lentiviral para la programación directa del método de pluripotentes células madre humana es aplicable para la generación de HE y las células de sangre para estudios mecanísticos, estudios de endotelial a la transición hematopoyético, y la regulación transcripcional de desarrollo hematopoyético y especificación. Aunque la current protocolo describe la producción de sangre usando la expresión constitutiva de los transgenes, resultados similares podrían obtenerse utilizando ARNm modificado ^10.

Protocolo

1. Virus Preparaciones y factor de transcripción Combinaciones

1. Preparar soluciones con plásmido de expresión lentiviral pSIN-EF1α que contiene ADN que codifica la proteína para ETV2, GATA1, GATA2, TAL1 y LMO2 (Tabla 1).
2. Medir la concentración y pureza de las preparaciones de plásmido utilizado para la producción de lentiviral mediante el registro de la absorción UV con un espectrofotómetro a 230 nm, 260 nm, y 280 nm. Nota: preparaciones de ADN demuestran A260 / 280 y A260 / 230 valores superiores a 1,8 se consideran en general de buena calidad. 280 Los valores más bajos A260 / pueden indicar contaminación de proteínas, mientras que los valores más bajos A260 / 230 indican impurezas con sales o algún disolvente tal como fenol. Concentración de plásmido recomendada es de 1 a 3 mg / l.
3. Producir lentivirus para transducciones como se describe en los protocolos publicados previamente ^11. La inducción de la SE con potencial de pan-mieloide requiere co-expresión de ETV2 y GATA1 o ETV2 y GATA2.La inducción de la SE con potencial de eritro- y megacariocítico requiere GATA2 y TAL1. La adición de LMO2 mejora significativamente el rendimiento de las células-eritro megacariocítica de hPSCs en presencia de GATA2 y TAL1 ^10.

2. Protocolo Cultura hPSCs

1. Crecer células madre pluripotentes en colonias cerradas con bordes afilados para el 70-80% de confluencia antes de subcultivo. Mark y eliminar espontáneamente diferenciadas colonias antes de pases células.
2. Diluir gel de matriz extracelular comercial (véase la Tabla 2) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y las placas de capa de 6 pocillos durante la noche a 4 ° C, o durante al menos una hora a 37 ° C antes de su uso. Antes de pases células, aspirar la matriz, añadir 2 ml de culturemedium completa comercial fresco (ver Tabla 2) y mantener las placas a 37 ° C, 5% de CO ₂ hasta que las células están listas para la siembra.
3. HPSCs Passage
   1. Aspirate medio de un pozo confluente de una placa de 6 pocillos con hPSCs y añadir 1,5 ml de la solución de pre-calentado dispasa II (2 mg / ml en DMEM / F12, se esteriliza por filtración a través de filtros de 0,22 micras). Incubar durante 5-7 min a 37 ° C, 5% de CO ₂ hasta que los bordes de las colonias empiezan a levantar de la superficie.
   2. Aspirar solución de dispasa II y cuidadosamente se lavan las colonias dos veces mediante la adición de aspiración y luego 2 ml de medio DMEM / F12 fresco. Luego, utilizando una pipeta de vidrio de 5 ml serológica, se disocian hPSCs con 3 ml de medio de cultivo completo fresco comercial (véase la Tabla 2) pipeteando la suspensión celular arriba y abajo varias veces.
   3. Añadir 0,5 ml de suspensión celular a cada pocillo de una placa de 6 pocillos que contenía 1,5 ml de medio de cultivo completo comercial (véase la Tabla 2). Agite la placa de ida y vuelta y de derecha a izquierda varias veces para asegurar una distribución de células uniforme cuando situar la placa en la incubadora. Mantenga las células a 37 ° C, 5% de CO _{2 por 1}08.24 h.
   4. El siguiente cambio medio día al medio de cultivo completo comercial fresco (ver Tabla 2) y examinar hPSCs morfología. Resultados pases acertados en pequeñas colonias, así conectados a retención HPSC morfología. hPSCs deben ser alimentados con 2.5-3 ml freshmedium por pocillo sobre una base diaria y se pasaron cada 4-5 días en no más de un 70-80% de confluencia.
      NOTA: Si se mantuvieron hiPSCs en fibroblastos de embriones de ratón (MEFs), tienen que ser transferidos a condiciones de alimentación libre y pases 2-3 veces antes de transducción para asegurar la diferenciación eficiente.

3. Inducción de Hematoendothelial Pprecursors de hPSCs (día 0, la transducción de hPSCs)

1. Para preparar medio de reacción se combinan 1,3 ml de medio libre de suero completa comercial (ver Tabla 2), virus, polibreno, y Y27632 inhibidor ROCA (Tabla 1): añadir 1,3 l de inhibidor ROCA 10 mM a 1,3 ml de medio a una concentración final deción de 10 m, y polibreno a una concentración final de 6 mg / ml.
   1. Añadir una cantidad apropiada de concentrado viral (s) a una concentración final de 0,5 a 1,0 MOI (multiplicidad de infección) de cada virus por célula. Mantener medio de reacción en hielo oa 4 ° C hasta que la suspensión de una sola célula está listo.
      NOTA: La misma cantidad de MOI para cada virus en el GATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1, y mezclas de GATA2 / TAL1 de reacción / LMO2 es óptimo para la inducción de la diferenciación. Culturas Sin embargo, en ETV2 / GATA2 transducidas duplicando MOI para GATA2, en relación con ETV2, aumenta la diferenciación. Se recomienda 2 para MOI de ETV2 y 1 MOI de GATA2 (por ejemplo, si concentrado viral se estima aproximadamente 6,8 x 10 ⁷ partículas / ml, añadir 10 l de ETV2 y 20 l de GATA2 concentrados virales a: Por lo tanto, para estos cultivos, la relación de 1 0.68 x 10 ⁶ células por una de las reacciones ETV2 / GATA2 en un pozo de 35 mm de una placa de 6 pocillos).
2. Preparar hPSCs en una sola susp celularensión.
   1. Crecer hPSCs en condiciones libres de alimentador como se describe en la sección 2. El día 4 a partir del último paso, observar la densidad celular y la morfología bajo un microscopio invertido. hPSCs deben crecer en colonias apretados con bordes afilados sin diferenciación espontánea y llegar a ~ 60-70% de confluencia en el día de la transducción.
   2. Aspirar medio, añadir 1.5-2 ml de reactivo comercial de disociación celular (Tabla 1) por pocillo e incubar a 37 ° C con 5% de CO ₂ durante 5-7 min.
   3. Recoger las células en volúmenes iguales de medio completo comercial (ver Tabla 2) con 10 M de inhibidor de ROCK, contar las células y determinar la viabilidad. Precipitar las células por centrifugación a 200 xg durante 5 min y luego se resuspenden las células en medio completo comercial con 10 M de inhibidor de ROCK una concentración de 3.4-5 x 10 ⁶ células por ml.
      NOTA: La viabilidad celular es fundamental para la transducción viral exitosa y posterior diferenciación.Típicamente, la viabilidad celular antes de la transducción debe exceder de 90%.
3. Añadir 200 l de la suspensión celular, que contiene 0.68-1 ⁶ células x10, en 1,3 ml del medio de reacción preparada en 3.1.
4. Aspirar la solución de la matriz de la placa de 6 pocillos recubiertos noche preparado en 2.2., La transferencia de la mezcla de reacción a un pocillo de una placa de 6 pocillos y distribuir uniformemente las células. Incubar a 37 ° C con 5% de CO ₂ durante 24 horas. Después de 24 horas a menos 80% de las células debe estar unido a la matriz.

4. Inducción de Hematoendothelial Precursores de hPSCs (día 1-7)

1. 24 horas después de la transducción, eliminar el medio que contiene virus y lavar las células unidas con medio de cultivo celular incompleta comercial (véase la Tabla 1) y luego añadir 3 ml por pocillo de medio de cultivo celular incompleta comercial que contiene citoquinas hematopoyéticas: SCF 100 ng / ml, TPO 50 ng / ml, bFGF 20 ng / ml (en adelante como 3F-medio).
2. Reemplace medio total, con frescos 3F-medio en los días 2, 3 y 4 días para eliminar las células muertas y los desechos. Después del día 4, cuando están surgiendo células hematopoyéticas flotantes, reemplace la mitad del 3F-medio cada dos días, manteniendo el volumen total de 4 ml.
   NOTA: pSIN-EF1α plásmidos de expresión lentiviral incorporan gen de resistencia a puromicina permitiendo de este modo para la selección positiva de las células transducidas. El 1 mg / ml de puromicina se puede añadir al medio durante los primeros 1-2 días de diferenciación para eliminar los cualquier hPSCs indiferenciadas residuales.
3. Observar la morfología celular en el día 4 bajo un microscopio invertido: racimos apretados de células con morfología típica endotelial comienzan a aparecer (Figuras 2A, 3A). Células de la sangre de la Ronda aparece desde el día 5 al día 7 de diferenciación, mientras que algunas zonas pueden retener hPSCs morfología. Analizar HE y la diferenciación hematopoyética tal como se describe a continuación.
   NOTA: diferente hematoendothelial Exitosaiation resulta en la producción de células sanguíneas que aparecen células redondas como refráctiles débilmente unido a las células endoteliales planas subyacentes. Estas células proliferan activamente la formación de pequeños agregados, y, finalmente, separar y flotador (Figuras 2A y 3A). Glóbulos en directo se pueden distinguir visualmente de las células muertas y moribundas en función de su capacidad de reflejar la luz y ampliar en las condiciones de cultivo.

5. Análisis de Hemogenic endotelio (HE) etapa de diferenciación.

1. Detectar la formación de HE entre los días 3 y 4 de la diferenciación por la observación microscópica de las células con morfología endotelial. No hay células de la sangre que flotan en el cultivo en esta etapa de diferenciación. La presencia de SE puede confirmarse mediante tinción de inmunofluorescencia y citometría de flujo análisis utilizando anticuerpos VE-cadherina, CD73, CD226 y CD43.
   1. Para evaluar la formación de HE by células utilizan el análisis de citometría de flujo en el día 3y 4 días de un experimento. Recoger las células por incubación de las culturas con el reactivo de disociación celular comercial (ver Tabla 1) durante 5-10 minutos a 37 ° C, 5% de CO ₂ y luego usar hasta 1 x 10 ⁵ células por reacción de tinción (citometría de flujo procedimiento de tinción se describe en ^12).
      NOTA: VE-cadherina ⁺ HE células adquieren expresión de principios CD226 marcador hematopoyético, pero carecen de la expresión de CD73 y CD43 ^6. En contraste, las células no expresan CD73 HE (Figuras 2B, 3B).
2. La tinción de inmunofluorescencia para derivados de HPSC HE.
   1. Lavar la monocapa adjunta de células con tampón fosfato salino (PBS) y luego fijar las células en paraformaldehído al 4% de 30 a 60 min a temperatura ambiente.
   2. Lavar las células de nuevo con PBS y después se permeabilizan utilizando 0,1% de Triton X-100 en PBS durante 20 min a temperatura ambiente.
   3. Lavar las células en PBS dos a tres veces y luego se incuban entampón de bloqueo que consiste en PBS con suero bovino fetal al 10% (FBS), por 30 a 120 min.
   4. Preparar solución de tinción, que contiene ambos anticuerpos primarios (1: 1000 dilución) de ratón anti-CD43 humana y de conejo anti-humanos VE-cadherina en PBS con 5% de FBS, (Tabla 1).
   5. Aspirar el tampón de bloqueo de las células y añadir 1 ml por pocillo de tampón de tinción con los anticuerpos primarios añadidos; incubar 3 horas a temperatura ambiente, o durante la noche a 4 ° C.
   6. Se lavan las células tres veces mediante la adición de 2 ml de PBS con 5% de FBS.
   7. Preparar un segundo tampón de tinción, que contiene anticuerpos secundarios en dilución 1: 500 en PBS con 5% de FBS: burro anti-conejo conjugado con colorante fluorescente verde, y anti-ratón conjugado con colorante fluorescente rojo (Tabla 1). Añadir 1 ml por pocillo de tampón de tinción secundaria y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hr.
   8. Lavar tres veces con PBS sin suero. Las células se tiñen con 300 nM DAPI solución de trabajo en DH2 O durante 10-15 min.
   9. Lavar las células con PBS dos veces y añadir 2.3 ml de PBS en bien con células teñidas. Observar con filtros de fluorescencia de microscopio verde, rojo y azul.

6. Análisis de Inducidos hematopoyéticas Precursores

1. Mantener culturas de diferenciación hasta que las células flotantes se expanden significativamente, hasta 10-14 días, cambiando el medio de 3F-medio, como se describe en 3.1, cada dos días.
2. Se disocian y recoger la diferenciación de monocapas de células mediante el tratamiento de las células con un reactivo de disociación celular comercial (véase la Tabla 1) durante 5-10 min a 37 ° C, 5% de CO _2.
3. Realizar citometría de flujo utilizando anti-VE-cadherina, anticuerpos CD43 y CD45 para evaluar la hematopoyesis en las culturas ^12. Tenga en cuenta que una gran parte de las células, hasta el 40% de las células ETV2 y GATA2 transducidas, co-expresa VE-cad y CD43. Los siguientes anticuerpos pueden utilizarse para detectar linajes celulares específicos siguientes eXpansion o la diferenciación de células progenitoras de sangre inducidos: CD235a (células eritroides), CD41a (megacariocítica), CD32 (todos los tipos de células mieloides), CD66b (neutrófilos) y CD163 (macrófagos).
4. Realizar CFC-ensayo utilizando un medio clonogénico comercial (Tabla 1) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   1. Traslado 1-2 x 10 ⁴ células en 3 ml de medio clonogénica comercial (ver Tabla 3) para evaluar el número de células y tipos de colonias hematopoyéticas formadoras de colonias. Densidad óptima de siembra permite la identificación y el aislamiento de colonias individuales que crecen por separado unos de otros y no se solapan. Densidad de siembra puede variar entre los experimentos en función de la eficiencia de la diferenciación, pero no debe exceder de 1 x 10 ⁴ células por 1 ml de medio clonogénico comercial.
   2. Mezclar células en medio clonogénica comercial por agitación suave, y la transferencia de 3 ml de suspensión de dos 35 mm platos ultra-bajas de fijaciónpara el ensayo de CFC, 1,5 ml de la suspensión a cada plato. Distribuir uniformemente medio y se incuba a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante 14 días. Evite molestar a los platos; observar la formación de colonias en el día 7 y el día 10 del ensayo.
   3. Identificar y contar colonias hematopoyéticas según sus morfologías en el día 14.

Resultados

El diagrama esquemático de HE y la inducción de sangre de hPSCs por la sobreexpresión de factores de transcripción se muestra en la Figura 1. ETV2 con la combinación GATA1 o GATA2 induce la hematopoyesis pan-mieloide, mientras que un GATA2, TAL1 +/- combinación LMO2 induce la hematopoyesis predominantemente eritro-megacariocítica. Ambas combinaciones TF directamente inducidos células el que posteriormente transforman en células progenitoras de sangre con un espectro diferente de diferenciación...

Discusión

El método anteriormente descrito para la diferenciación hematopoyética de hPSCs por la sobreexpresión de TFS, representa un enfoque rápido y eficiente para la generación de HE y mieloides y erytho magakaryocytic progenitores de hESCs y CMPI, permitiendo así la producción de hasta 30 millones de células de sangre de un millón de células madre pluripotentes ^10. Este método exhibió diferenciación consistente en múltiples células madre y iPSCs ^líneas 10. Durante la diferenciación por ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells.
pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61061	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61063	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61062	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61062	Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro	Addgene	Plasmid #61064	Lentiviral Vector
Hexadimethrine bromide (Polybrene)	Sigma-Aldrich	107689-10G	Cationic polymer used to increase the efficiency of infection
Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor	STEMCELL Technologies	72302	RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A11105-01	Cell Dissociation Reagent
Incomplete (growth factor- free) culture medium                                              mTeSR1 Custom formulation	WiCell Research Institute (Madison, WI)	MCF	Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb
human SCF	Peprotech	300-07	Premium grade
human TPO	Peprotech	300-18	Research grade
human FGF-basic	Peprotech	100-18B	Premium grade
CD144 (VE-cad) FITC	BD Biosciences	560411	Endothelial marker (FACS)
CD226 PE	BD Biosciences	338305	Hematopoietic (FACS)
CD43 PE	BD Biosciences	560199	Hematopoietic (FACS)
CD73 APC	R&D Systems	FAB5795A	Endothelial marker (FACS)
CD45 APC	BD Biosciences	555485	Hematopoietic (FACS)
7AAD	Life Technologies	A1310	Live/Dead assay (FACS)
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Cell fixation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML	Permeabilization
FBS	Fisher Scientific	SH3007003	Fetal bovine serum
Mouse anti-human CD43	BD Biosciences	551457	Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining
Rabbit anti-human VE-cadherin	BenderMedSystem	BMS158	Primary (IF)
Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated	JacksonResearch	715-486-152	Secondary (IF)
Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated	JacksonResearch	715-516-150	Secondary (IF)
DAPI nucleic acid stain	Life Technologies	D1306	Live/Dead assay (IF)
Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched	STEMCELL Technologies	4435	CFC-assay
Wright Stain solution	Sigma -Aldrich	32857	Staining cytospins
Table 2. hPSCs culture.
Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs)	WiCell Research Institute (Madison, WI)	hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells	hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers
Complete serum-free medium for culture of hPSCs                                                    mTeSR1 media	WiCell Research Institute (Madison, WI)	M500	Serum-free  medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs
Matrigel	BD Biosciences/ Corning	356234	Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs
DMEM/F-12, powder	Life Technologies	12500-062	Basal Medium
HyClone Dulbecco's PBS powder	Fisher Scientific	dSH30013.04	PBS
Dispase II, powder	Life Technologies	17105-041	Neutral protease, Cell dissociation
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration.
Primer's Name	Forward (Fwd)  5’ -->3’	Reverse (Rev) 5’-->3’	Discription
pSIN EF1a Fwd	TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA	--	EF1a promoter sequence
GATA1 Rev	--	TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC	Coding Region
GATA2 Rev	--	GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG	Coding Region
TAL1 Rev	--	AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT	Coding Region
LMO2 Rev	--	GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC	Coding Region
ETV2 Rev	--	GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC	Coding Region