البصري مستدعى تسجيل المحتملين في نموذج الفئران التجريبية العصب البصري إزالة الميالين

Summary

Focal demyelination is induced in the optic nerve using lysolecithin microinjection. Visual evoked potentials are recorded via skull electrodes implanted over the visual cortex to examine the signal conduction along the visual pathway in vivo. This protocol details the surgical procedures underlying electrode implantation and optic nerve microinjection.

Abstract

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to monitor the disease course in the follow-up period. Changes in the VEP parameters closely correlate with pathological damage in the optic nerve. This protocol provides a detailed description about the rodent model of optic nerve microinjection, in which a partial demyelination lesion is produced in the optic nerve. VEP recording techniques are also discussed. Using skull implanted electrodes, we are able to acquire reproducible intra-session and between-session VEP traces. VEPs can be recorded on individual animals over a period of time to assess the functional changes in the optic nerve longitudinally. The optic nerve demyelination model, in conjunction with the VEP recording protocol, provides a tool to investigate the disease processes associated with demyelination and remyelination, and can potentially be employed to evaluate the effects of new remyelinating drugs or neuroprotective therapies.

Introduction

Optic neuritis is one of the most common form of optic neuropathy, causing complete or partial loss of vision¹. Histologically, it is featured by inflammatory demyelination, retinal ganglion cell axonal loss and varying degrees of remyelination in the optic nerve². Optic neuritis is usually the manifest onset of multiple sclerosis. The visual evoked potential (VEP) is a non-invasive tool for investigating the function of the visual system. It reflects the post-retinal function from the retina to the primary visual cortex and is affected in many optic nerve disease conditions³. The VEP has been predominantly used in optic neuritis patients to assess the integrity of the visual pathway⁴.

The latency of VEP, which reflects the velocity of signal conduction along the visual pathway, is considered to be an accurate measurement of the level of myelin associated changes in the optic nerve⁵; while the amplitude of VEP is believed to be closely correlated with axonal damage of the retinal ganglion cells (RGC)⁶. This hypothesis has been fairly well established using the rat model of lysolecithin-induced optic nerve demyelination⁵.

Here, we explicate a comprehensive protocol of optic nerve microinjection technique in rodents, which can minimise the surgical manipulation-related damage to the nerve per se as well as to the adjacent tissues such as extraocular muscles and blood vessels. Also, the skull electrode implantation surgery has been described for VEP recording in animals⁷. The VEP recordings can be repeatedly carried out on animals over a period of time to assess demyelination/remyelination related changes as well as impact on axonal integrity in the optic nerve.

Protocol

وأجريت جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات وفقا للقانون الاسترالي من الممارسة لرعاية واستخدام الحيوانات لأغراض علمية والمبادئ التوجيهية لبيان ARVO لاستخدام الحيوانات في العيون والبحوث الرؤية، وتمت الموافقة من قبل: بيان الأخلاق لجنة أخلاقيات الحيوان من جامعة ماكواري.

1. VEP الكهربائي زرع

1. تخدير الحيوانات مع حقن داخل الصفاق من الكيتامين (75 ملغ / كلغ) وmedetomidine (0.5 ملغ / كلغ).
   ملاحظة: بعد التخدير، ومراقبة ردود الفعل انسحاب (اختبار قرصة، منعكسة القرنية وجفني، الخ) وغيابها مؤشرا لبدء عملية جراحية. باستمرار مراقبة الحيوانات في جميع أنحاء الجراحة وإدارة المخدرات مخدر إضافية (10٪ من جرعة الكيتامين الأولية في أعلى متابعة) في حالة وجود ردود الفعل. وتستخدم الجرذان الكبار (> 12 أسبوعا) في التجارب.
2. حلق الجلد من منطقة العمليات الجراحية.وضع الحيوان على وسادة ارتفاع درجة حرارة (37 درجة مئوية) للحفاظ على درجة حرارة الجسم أثناء الجراحة. تحضير الجلد من خلال التطبيق الموضعي للبوفيدون اليود. تطبيق اللف الجراحي. تطبيق مرهم موضعي لمنع جفاف القرنية تحت التخدير العام. الحفاظ على عقامة باستخدام أدوات معقمة.
3. جعل شق الجلد الطولي في خط الوسط من جلد الرأس. مسح النسيج الضام لتحقيق التعرض جيدة من الجمجمة.
4. بعناية، حفر ثقوب لدغ صغيرة يدويا باستخدام الحفر اليد الصغيرة في 7 مم وراء bregma و 3 مم الوحشي على خط الوسط.
5. أقطاب المسمار الزرع من خلال الجمجمة في القشرة (منطقة 17)، اختراق القشرة على عمق حوالي 0.5 مم. زرع قطب كهربائي المسمار إشارة على خط الوسط 3 مم منقاري إلى bregma. تطبيق الاسمنت الأسنان ليغلف وإصلاح مسامير (غير مطلوب دائما).
6. خياطة الجلد من الرأس، وإدارة مرهم مضاد حيوي على الجلد والسماح للحيوان لريكوالنسخة من التخدير على لوحة ظاهرة الاحتباس.
   ملاحظة: بدلا من ذلك، الأقطاب الكهربائية يمكن تركها مكشوفة، لذلك لا يحتاج أن الجلد لإعادة فتح في كل تسجيل. فور وقف عملية جراحية ولكن قبل الاستعادة مخدر، وإدارة الدواء غير الستيرويدية المضادة للالتهابات (NSAID) (إن لم تكن تدار قبل الجراحة) أو مسكن أفيوني. مراقبة الحيوانات باستمرار حتى الشفاء التام من التخدير والعيادات الخارجية بالكامل.
7. تسمح على الأقل 1 أسبوع للحيوانات للتعافي من عملية جراحية قبل التسجيل VEP.

2. حقن العصب البصري

1. تخدير الحيوان، وإعداد البشرة وتطبيق اللف على النحو الوارد أعلاه (1.1 و 1.2).
2. جعل 1- 1.5 سم شق في الجلد فوق المدار من العين تم اختيارها عشوائيا. فتح الأنسجة تحت الجلد لتصل إلى تجويف المداري باستخدام مقص القزحية الجميلة. فتح الملتحمة والأمامي كبسولة تينون تحت المجهر التشغيل.
3. التراجع عن المقلةالعضلات والغدد الدمعية intraobital لفضح ما يقرب من 3 ملم طول العصب البصري. فتح الجافية والمواد العنكبوتية طبقات حول العصب البصري طوليا باستخدام شفرة العيون.
4. إدراج ماصة الزجاج في العصب البصري على مسافة 2 مم الخلفي إلى العالم. يتم إرفاق micropipette الزجاج لحقنة هاملتون.
5. حقن 1٪ ليزوليسيتين (0،4-1،0 ميكرولتر، مع 0.02٪ الأزرق ايفان والتي لا يكون لها آثار على المايلين) ببطء في العصب تقريبا على مدى فترة 30 ثانية.
6. خياطة شق الجلد. تطبيق مرهم مضاد حيوي لمنع العدوى. ويمكن تقديم عيون زميل والضوابط الداخلية للتسجيلات الكهربية.
7. وضع الحيوانات على لوحة ظاهرة الاحتباس للتعافي من التخدير.

3. VEP تسجيل

1. تخدير الحيوان وإعداد الجلد مثل 1.1 و 1.2.
   ملاحظة: أقل جرعة من التخدير يمكن استخدامها لريكو الكهربيةrding (الكيتامين 40 ملغ / كغ وmedetomidine 0.25 ملغ / كلغ).
2. وضع فأر في غرفة مظلمة واتركه على التكيف مع الظلام ل5-30 دقيقة. في بعض الحالات الفئران يمكن أن يكون على التوالي الظلام O تكييفها / N للالرؤية الليلية أو ضوء تكييفها للتسجيلات ضيائية VEP ^8.
3. الحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 ± 0.5 ° C من قبل النظام بطانية homoeothermic مع لجنة التحقيق مقياس الحرارة المستقيم.
4. تمدد التلاميذ مع 1.0٪ قطرات تروبيكاميد العين. فتح الجلد فوق الجمجمة للوصول إلى أقطاب المسمار في الموقع الطبيعي وضعت مسبقا.
5. ربط المسمار على القشرة البصرية المقابل للعين حفز والمسمار إشارة إلى مكبر للصوت. إدراج القطب الإبرة في ذيل مثل الأرض. قياس والحفاظ على مقاومة الكهربائي أقل من 5 أوم.
6. وضع مشجعا مصغرة فريق Ganzfeld مباشرة على الجلد حول الجفون لتوفير العين متفوقة العزلة ^7. إضاءة للمشجعا تحتاج إلى معايرة مسبقاقبل مضواء.
7. تقديم تحفيز ضوئي من خلال ومضات ضوء 100 مرة بتردد 1 هرتز، مع إعدادات التصفية الفرقة تمرير المنخفضة والعالية من 1 و 100 هرتز، على التوالي. معدل أخذ العينات إشارة هو في 5 كيلو هرتز.
   ملاحظة: يجب أخذ عينات إشارات على الأقل في حوالي 250-300 هرتز للتأكد من أن أكثر من اثنين من العينات التي تم جمعها خلال كل دورة.
8. خياطة الجلد إلى الوراء والحفاظ على الحيوانات على لوحة ظاهرة الاحتباس للتعافي من التخدير. تسجيل يمكن تسجيل مرارا وتكرارا على الحيوانات الفردية لرصد التغيرات الوظيفية على مدى فترة من الزمن.
9. في نهاية المرحلة، إدارة حقن جرعة زائدة من الصوديوم بنتوباربيتون (100 ملغ / كغ، والملكية الفكرية) إلى الموت ببطء الحيوان. تأكيد القتل الرحيم التي كتبها سكتة قلبية، توقف التنفس وانخفاض في درجة حرارة الجسم.

4. إعداد الأنسجة والأنسجة

1. إزالة الأعصاب البصرية من الحيوانات الموت الرحيم تحت المجهر وإصلاح الأنسجة في 1٪ بارافورمالدهيد O / N.
<لى> غسل الأنسجة تماما باستخدام محلول ملحي. علاج الأنسجة في معالج النسيج الآلي وتغرس في البارافين. أقسام قطع (5-10 ميكرون) باستخدام مشراح الدوارة.
ملاحظة: للحصول على دراسة المناعية، وإصلاح الأنسجة في 1٪ امتصاص العرق، ويغسل بمحلول ملحي واحتضان مع 30٪ سكروز O / N. الأنسجة تغرس في أكتوبر التضمين المتوسطة وتجعل cryosections باستخدام ناظم البرد.
2. احتضان المقاطع في 0.1٪ محلول أزرق سريع مثل Luxol (في 95٪ من الإيثانول) O / N عند 56 ° C. تمييز المقاطع في 0.05٪ كربونات الليثيوم لمدة 30 ثانية ثم الايثانول 70٪ لمدة 30 ثانية أخرى. أخيرا، مباين في 0.1٪ محلول الكريزيل البنفسجي لمدة 30 ثانية قبل تركيب الأبواب. استخدام تلطيخ الأزرق سريع لتحديد المايلين في العصب البصري ^5.

النتائج

وتظهر آثار استنساخه VEP داخل الدورات في الشكل 1 و تأخير كبير في الكمون N1 يمكن أن ينظر بعد حقن العصب البصري. ويمكن ملاحظة آفات العصب البصري جزئية من إزالة الميالين على أقسام النسيجية باستخدام Luxol تلطيخ الأزرق سريع ⁵ الشكل 2 يوضح مقطع تمثيلي مع آفة ?...

Discussion

The optic nerve is very susceptible to mechanical damage. Optic nerve crush injury over a duration of 1 s can lead to about 75% loss of RGC over a period of 2 weeks¹⁰. Therefore, extreme care is required while performing the surgical procedures. According to the authors’ experience, it is much better to adapt a blunt dissection approach to expose and make way through the tissues around the optic nerve along the orientation of the nerve, rather than penetrating in a perpendicular orientation to the optic ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine 100 mg/ml (Ketamil)	Troy Laboratories	AC 116
Medetomidine 1 mg/ml (Domitor)	Pfizer	sc-204073
Tropicamide 1.0% (Mydriacyl)	Alcon	sc-202371
Homoeothermic blanket system	Harvard Apparatus	NC9203819
Impedance meter	Grass	F-EZM5
Screw electrodes	Micro Fasteners	M1.0×3mm Csk Slot M/T 304 S/S
Subdermal needle electrodes	Grass	F-E3M-72
Rapid Repair	DeguDent GmbH
Light-emitting diode	Nichia	NSPG300A
Bioamplifier	CWE, Inc.	BMA-400
CED system	Cambridge Electronic Design, Ltd.	Power1401
Hamilton syringe	Hamilton	87930
Lysolecithin	Sigma	L4129
Evan’s blue	Sigma	E2129