Enregistrement Potentiel évoqué visuel dans un modèle de rat of Experimental Optic Nerve démyélinisation

Résumé

Focal demyelination is induced in the optic nerve using lysolecithin microinjection. Visual evoked potentials are recorded via skull electrodes implanted over the visual cortex to examine the signal conduction along the visual pathway in vivo. This protocol details the surgical procedures underlying electrode implantation and optic nerve microinjection.

Résumé

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to monitor the disease course in the follow-up period. Changes in the VEP parameters closely correlate with pathological damage in the optic nerve. This protocol provides a detailed description about the rodent model of optic nerve microinjection, in which a partial demyelination lesion is produced in the optic nerve. VEP recording techniques are also discussed. Using skull implanted electrodes, we are able to acquire reproducible intra-session and between-session VEP traces. VEPs can be recorded on individual animals over a period of time to assess the functional changes in the optic nerve longitudinally. The optic nerve demyelination model, in conjunction with the VEP recording protocol, provides a tool to investigate the disease processes associated with demyelination and remyelination, and can potentially be employed to evaluate the effects of new remyelinating drugs or neuroprotective therapies.

Introduction

Optic neuritis is one of the most common form of optic neuropathy, causing complete or partial loss of vision¹. Histologically, it is featured by inflammatory demyelination, retinal ganglion cell axonal loss and varying degrees of remyelination in the optic nerve². Optic neuritis is usually the manifest onset of multiple sclerosis. The visual evoked potential (VEP) is a non-invasive tool for investigating the function of the visual system. It reflects the post-retinal function from the retina to the primary visual cortex and is affected in many optic nerve disease conditions³. The VEP has been predominantly used in optic neuritis patients to assess the integrity of the visual pathway⁴.

The latency of VEP, which reflects the velocity of signal conduction along the visual pathway, is considered to be an accurate measurement of the level of myelin associated changes in the optic nerve⁵; while the amplitude of VEP is believed to be closely correlated with axonal damage of the retinal ganglion cells (RGC)⁶. This hypothesis has been fairly well established using the rat model of lysolecithin-induced optic nerve demyelination⁵.

Here, we explicate a comprehensive protocol of optic nerve microinjection technique in rodents, which can minimise the surgical manipulation-related damage to the nerve per se as well as to the adjacent tissues such as extraocular muscles and blood vessels. Also, the skull electrode implantation surgery has been described for VEP recording in animals⁷. The VEP recordings can be repeatedly carried out on animals over a period of time to assess demyelination/remyelination related changes as well as impact on axonal integrity in the optic nerve.

Protocole

Déclaration éthique: Toutes les procédures impliquant des animaux ont été effectuées en conformité avec le Code australien de pratiques pour le soin et l'utilisation des animaux à des fins scientifiques et les lignes directrices de la Déclaration ARVO pour l'utilisation d'animaux dans ophtalmique et Vision Research, et ont été approuvés par le Comité d'éthique animale de l'Université de Macquarie.

1. VEP implantation d'électrodes

1. Anesthésier les animaux par une injection intraperitoneale de kétamine (75 mg / kg) et la médétomidine (0,5 mg / kg).
   Remarque: Après l'induction de l'anesthésie, observer les réflexes de retrait (test de pincement, réflexe cornéen et palpébrale, etc.) et leur absence comme une indication pour commencer la chirurgie. Surveiller continuellement les animaux tout au long de la chirurgie et administrer anesthésique supplémentaire (10% de la dose de kétamine initial par top-up) si les réflexes sont présents. Des rats adultes (> 12 semaines) sont utilisés dans les expériences.
2. Raser la peau de la zone chirurgicale.Placez l'animal sur un coussin chauffant (37 ° C) afin de maintenir la température du corps pendant l'intervention chirurgicale. Préparer la peau grâce à l'application topique de povidone-iode. Appliquer drapage chirurgical. Appliquer une pommade ophtalmique topique pour prévenir la sécheresse de la cornée sous anesthésie générale. Maintenir l'asepsie en utilisant des instruments stériles.
3. Faire une incision longitudinale de la peau sur la ligne médiane de la peau de la tête. Désactivez le tissu conjonctif pour obtenir une bonne exposition du crâne.
4. Soigneusement, percer de petits trous de bavures manuellement à l'aide d'une perceuse à main micro à 7 mm derrière le bregma et 3 mm latéralement de la ligne médiane.
5. Implant à vis des électrodes à travers le crâne dans le cortex (zone 17), pénétrant dans le cortex à une profondeur d'environ 0,5 mm. Implanter une électrode de vis de référence sur la ligne médiane 3 mm rostral au bregma. Appliquer ciment dentaire pour envelopper et fixer les vis (pas toujours nécessaire).
6. Suturer la peau de la tête, administrer une pommade antibiotique sur la peau et permettre aux animaux de recover de l'anesthésie sur un coussin chauffant.
   Remarque: vous pouvez électrodes peuvent être laissés exposés, de sorte que la peau n'a pas besoin d'être rouvert dans chaque enregistrement. Immédiatement après la cessation de la chirurgie, mais avant la récupération anesthésique, administrer un médicament non-stéroïdiens anti-inflammatoire non stéroïdien (AINS) (si pas administré en pré-opératoire) ou un analgésique opioïde. Surveiller les animaux constamment jusqu'à ce que le rétablissement complet de l'anesthésie et entièrement ambulatoire.
7. Prévoyez au moins 1 semaine pour les animaux de récupérer de la chirurgie avant l'enregistrement VEP.

2. Optic Nerve Injection

1. Anesthésier l'animal, préparer la peau et appliquer drapage comme ci-dessus (1.1 et 1.2).
2. Ajouter un 1- à 1,5 cm incision dans la peau au-dessus de l'orbite de l'oeil choisi de façon aléatoire. Ouvrez le tissu sous-cutané pour atteindre la cavité orbitaire en utilisant l'iris ciseaux fins. Ouvrir la conjonctive et de la partie antérieure de la capsule de Tenon sous le microscope opératoire.
3. Rétracter le extraoculaireles muscles et les glandes lacrymales intraobital pour exposer environ 3 mm de longueur du nerf optique. Ouvrez la dure-mère et l'arachnoïde matière couches autour du nerf optique en utilisant une lame longitudinalement ophtalmique.
4. Insérez la pipette en verre dans le nerf optique à une distance de 2 mm en arrière du globe. La micropipette en verre est fixée à une seringue Hamilton.
5. Injecter 1% lysolécithine (0,4 à 1,0 pi, avec 0,02% de bleu d'Evan qui n'a pas d'effets sur la myélinisation) lentement dans le nerf environ sur une période de 30 sec.
6. Suturer l'incision de la peau. Appliquer une pommade antibiotique pour prévenir l'infection. Compagnons yeux peuvent être servis que des contrôles internes pour les enregistrements électrophysiologiques.
7. Placez les animaux sur un coussin chauffant pour récupérer de l'anesthésie.

3. VEP Enregistrement

1. Anesthésier l'animal et de préparer la peau en tant que 1,1 et 1,2.
   Remarque: Une dose réduite d'anesthésiques peut être utilisé pour reco électrophysiologiquerding (kétamine à 40 mg / kg de médétomidine et 0,25 mg / kg).
2. Placez le rat dans une pièce sombre et lui permettre d'adapter à l'obscurité pendant 5 - 30 min. Dans certains cas, les rats peuvent être respectivement O adapté foncé / N pour scotopique ou de lumière adapté pour les enregistrements photopique de VEP ^8.
3. Maintenir la température du corps à 37 ± 0,5 ° C par le système de couverture homéothermes avec une sonde de thermomètre rectal.
4. Dilater les pupilles avec 1,0% tropicamide gouttes oculaires. Ouvrir la peau sur le crâne pour accéder à la pré-électrodes placés dans de vis situ.
5. Connectez la vis sur le cortex visuel de l'oeil controlatéral stimulée et la vis de référence à l'amplificateur. Insérez une électrode de l'aiguille dans la queue que le sol. Mesurer et maintenir l'impédance de l'électrode en dessous de 5 kQ.
6. Placer un stimulateur mini-Ganzfeld directement sur ​​la peau autour des paupières pour assurer une isolation supérieure ⁷ de l'oeil. L'illumination du stimulateur doit être étalonné au préalablepar un photomètre.
7. Livrer la stimulation lumineuse à travers clignote 100 fois à une fréquence de 1 Hz, avec des réglages de filtre passe-bande basse et haute de 1 et 100 Hz, respectivement. Le taux d'échantillonnage du signal est à 5 kHz.
   Remarque: Les signaux doivent être échantillonnés au moins à environ 250 à 300 Hz pour assurer que plus de deux échantillons sont prélevés au cours de chaque cycle.
8. Suturer la peau du dos et de garder les animaux sur un coussin chauffant pour récupérer de l'anesthésie. L'enregistrement peut être enregistrée de façon répétée sur des animaux individuels pour surveiller les changements fonctionnels sur une période de temps.
9. À la fin du point, administrer une injection surdose de pentobarbital de sodium (100 mg / kg, ip) pour euthanasier l'animal. Confirmez l'euthanasie par arrêt cardiaque, arrêt respiratoire et la diminution de la température du corps.

4. Préparation des tissus et histologie

1. Retirer les nerfs optiques à partir d'animaux euthanasiés au microscope et fixer le tissu dans 1% de paraformaldehyde O / N.
2. Laver le tissu à fond avec une solution saline. Traiter le tissu dans un processeur automatique de tissu et l'intégrer dans de la paraffine. sections coupées (5 - 10 um) à l'aide d'un microtome rotatif.
   Remarque: Pour l'étude d'immunohistochimie, fixer le tissu dans 1% de paraformaldehyde, laver avec une solution saline et incuber avec 30% de saccharose O / N. Incluez le tissu dans l'OCT milieu d'inclusion et de faire cryosections l'aide d'un cryostat.
3. Incuber les coupes dans 0,1% de solution de bleu rapide tels que Luxol (dans 95% d'éthanol) O / N à 56 ° C. Différencier les sections de carbonate de lithium à 0,05% pendant 30 secondes et ensuite éthanol à 70% pendant 30 sec. Enfin, contre-colorer dans une solution de violet de crésyl à 0,1% pendant 30 secondes avant de monter les sections. Utilisez la coloration au bleu rapide pour identifier la myéline dans le nerf optique ^5.

Résultats

Traces de VEP intrasessions reproductibles sont présentés dans la figure 1 et un retard important dans la latence N1 peuvent être observés après l'injection du nerf optique. Lésions du nerf optique partielles de démyélinisation peuvent être observées sur des coupes histologiques utilisant Luxol coloration au bleu rapide ^5. La figure 2 montre une section représentative avec une petite lésion démyélinisée focal dans le centre du nerf optique. Notez que sectio...

Discussion

The optic nerve is very susceptible to mechanical damage. Optic nerve crush injury over a duration of 1 s can lead to about 75% loss of RGC over a period of 2 weeks¹⁰. Therefore, extreme care is required while performing the surgical procedures. According to the authors’ experience, it is much better to adapt a blunt dissection approach to expose and make way through the tissues around the optic nerve along the orientation of the nerve, rather than penetrating in a perpendicular orientation to the optic ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine 100 mg/ml (Ketamil)	Troy Laboratories	AC 116
Medetomidine 1 mg/ml (Domitor)	Pfizer	sc-204073
Tropicamide 1.0% (Mydriacyl)	Alcon	sc-202371
Homoeothermic blanket system	Harvard Apparatus	NC9203819
Impedance meter	Grass	F-EZM5
Screw electrodes	Micro Fasteners	M1.0×3mm Csk Slot M/T 304 S/S
Subdermal needle electrodes	Grass	F-E3M-72
Rapid Repair	DeguDent GmbH
Light-emitting diode	Nichia	NSPG300A
Bioamplifier	CWE, Inc.	BMA-400
CED system	Cambridge Electronic Design, Ltd.	Power1401
Hamilton syringe	Hamilton	87930
Lysolecithin	Sigma	L4129
Evan’s blue	Sigma	E2129