Visual Gravação Potencial Evocado em um modelo de rato de Experimental Nervo Óptico desmielinização

Resumo

Focal demyelination is induced in the optic nerve using lysolecithin microinjection. Visual evoked potentials are recorded via skull electrodes implanted over the visual cortex to examine the signal conduction along the visual pathway in vivo. This protocol details the surgical procedures underlying electrode implantation and optic nerve microinjection.

Resumo

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to monitor the disease course in the follow-up period. Changes in the VEP parameters closely correlate with pathological damage in the optic nerve. This protocol provides a detailed description about the rodent model of optic nerve microinjection, in which a partial demyelination lesion is produced in the optic nerve. VEP recording techniques are also discussed. Using skull implanted electrodes, we are able to acquire reproducible intra-session and between-session VEP traces. VEPs can be recorded on individual animals over a period of time to assess the functional changes in the optic nerve longitudinally. The optic nerve demyelination model, in conjunction with the VEP recording protocol, provides a tool to investigate the disease processes associated with demyelination and remyelination, and can potentially be employed to evaluate the effects of new remyelinating drugs or neuroprotective therapies.

Introdução

Optic neuritis is one of the most common form of optic neuropathy, causing complete or partial loss of vision¹. Histologically, it is featured by inflammatory demyelination, retinal ganglion cell axonal loss and varying degrees of remyelination in the optic nerve². Optic neuritis is usually the manifest onset of multiple sclerosis. The visual evoked potential (VEP) is a non-invasive tool for investigating the function of the visual system. It reflects the post-retinal function from the retina to the primary visual cortex and is affected in many optic nerve disease conditions³. The VEP has been predominantly used in optic neuritis patients to assess the integrity of the visual pathway⁴.

The latency of VEP, which reflects the velocity of signal conduction along the visual pathway, is considered to be an accurate measurement of the level of myelin associated changes in the optic nerve⁵; while the amplitude of VEP is believed to be closely correlated with axonal damage of the retinal ganglion cells (RGC)⁶. This hypothesis has been fairly well established using the rat model of lysolecithin-induced optic nerve demyelination⁵.

Here, we explicate a comprehensive protocol of optic nerve microinjection technique in rodents, which can minimise the surgical manipulation-related damage to the nerve per se as well as to the adjacent tissues such as extraocular muscles and blood vessels. Also, the skull electrode implantation surgery has been described for VEP recording in animals⁷. The VEP recordings can be repeatedly carried out on animals over a period of time to assess demyelination/remyelination related changes as well as impact on axonal integrity in the optic nerve.

Protocolo

Declaração de Ética: Todos os procedimentos envolvendo animais foram conduzidos de acordo com o Código de Prática australiano para o Cuidado e Utilização de animais para fins científicos e as diretrizes da Declaração ARVO para o Uso de Animais em Oftalmologia e Vision Research, e foram aprovadas pelo Comitê de Ética Animal da Universidade Macquarie.

1. VEP Eletrodo Implantação

1. Anestesiar o animal com uma injecção intraperitoneal de cetamina (75 mg / kg) e medetomidina (0,5 mg / kg).
   Nota: Após a indução da anestesia, observar os reflexos de retirada (teste beliscão, reflexos da córnea e da pálpebra, etc.) e sua ausência como uma indicação para começar a cirurgia. Continuamente monitorar animais durante toda a cirurgia e administrar anestésico adicional (10% da dose inicial por cetamina top-up), se os reflexos estão presentes. Ratos adultos (> 12 semanas) são utilizados nas experiências.
2. Raspar a pele da área cirúrgica.Colocar o animal numa almofada de aquecimento (37 ° C) para manter a temperatura do corpo durante a cirurgia. Prepare a pele através da aplicação tópica de povidona-iodo. Aplicar drapeados cirúrgico. Aplicar pomada oftálmica tópica para prevenir o ressecamento da córnea sob anestesia geral. Manter assepsia utilizando instrumentos esterilizados.
3. Faça uma incisão cutânea longitudinal na linha média da pele cabeça. Limpar o tecido conjuntivo para conseguir uma boa exposição do crânio.
4. Cuidadosamente, perfurar pequenos buracos burr manualmente usando uma broca de micro mão em 7 mm para trás do bregma e 3 mm lateral à linha média.
5. Eléctrodos de parafuso do implante através do crânio para o córtex (zona 17), que penetram no córtex a uma profundidade de aproximadamente 0,5 mm. Implantar um eletrodo parafuso de referência na linha média 3 mm rostral do bregma. Aplique o cimento dental para envolver e fixar os parafusos (nem sempre necessário).
6. Suturar a pele da cabeça, administrar pomada antibiótica na pele e permitir que o animal recover da anestesia em uma almofada de aquecimento.
   Nota: Em alternativa, os eléctrodos podem ser deixada exposta, de forma que a pele não precisa ser reaberto em cada gravação. Imediatamente após a cessação da cirurgia, mas antes da recuperação da anestesia, administrar uma droga não-esteróide anti-inflamatório (NSAID) (se não for administrado no período pré-operatório), ou um analgésico opióide. Monitorar os animais constantemente até a recuperação completa de anestésico e totalmente ambulatorial.
7. Permitir que pelo menos uma semana para os animais para se recuperar da cirurgia antes da gravação VEP.

2. Optic Nerve Injeção

1. Anestesiar o animal, preparar a pele e aplicar drapejar como acima (1.1 e 1.2).
2. Adicione um, de 1 a 1,5 cm de incisão na pele acima da órbita de um olho seleccionada aleatoriamente. Abra o tecido subcutâneo para alcançar a cavidade orbital usando íris tesoura fina. Abra a conjuntiva e anterior da cápsula de Tenon sob o microscópio de operação.
3. Retrair o extraocularmúsculos e as glândulas lacrimais intraobital para expor aproximadamente 3 mm de comprimento do nervo óptico. Abra as camadas da dura e matéria aracnóide ao redor do nervo óptico longitudinalmente usando uma lâmina oftalmológica.
4. Inserir a pipeta de vidro para o nervo óptico a uma distância de 2 mm posterior ao globo. A micropipeta de vidro é ligada a uma seringa Hamilton.
5. Injectar 1% lisolecitina (0,4-1,0 mL, com 0,02% de azul de Evan, que não tem efeitos sobre a mielinização) lentamente no nervo aproximadamente ao longo de um período de 30 seg.
6. Suturar a incisão na pele. Aplicar pomada antibiótica para prevenir a infecção. Olhos do companheiro pode ser servido como controles internos para gravações de eletrofisiologia.
7. Colocar os animais numa almofada de aquecimento para recuperar da anestesia.

3. VEP Recording

1. Anestesiar o animal e preparar a pele como 1.1 e 1.2.
   Nota: Baixa dose de anestésico pode ser utilizado para reco electrofisiológicording (cetamina 40 mg / kg de medetomidina e 0,25 mg / kg).
2. Coloque o rato em um quarto escuro e deixe-a adaptar-se à escuridão por 5-30 min. Em alguns casos os ratos podem respectivamente ser escuro O adaptados / N para scotopic ou luz adequada para gravações photopic VEP ^8.
3. Manter a temperatura do corpo a 37 ± 0,5 ° C, segundo o sistema de cobertor Homeotérmica com uma sonda do termómetro rectal.
4. Dilatar as pupilas com 1,0% tropicamide colírio. Abra a pele sobre o crânio para aceder ao pré-colocada em eléctrodos de parafuso situ.
5. Ligar o parafuso ao longo do córtex visual do olho contralateral estimulada e o parafuso de referência para o amplificador. Insira um eletrodo de agulha na cauda como o chão. Medir e manter a impedância do eléctrodo inferior a 5 kW.
6. Coloque um estimulador mini-Ganzfeld diretamente sobre a pele ao redor das pálpebras para fornecer isolamento superior de olho ^7. A iluminação do estimulador necessita de ser calibrado de antemãopor um fotómetro.
7. Entregar fotostimulação através de flashes de luz 100 vezes a uma frequência de 1 Hz, com configurações de filtro passa-banda de baixa e alta de 1 e 100 Hz, respectivamente. A taxa de amostragem de sinal é a 5 kHz.
   Nota: devem ser sujeitos a amostragem Sinais de, pelo menos, a cerca de 250-300 Hz para assegurar que mais que duas amostras são recolhidas durante cada ciclo.
8. Suturar a pele para trás e manter os animais em uma almofada de aquecimento para se recuperar da anestesia. A gravação pode ser repetidamente gravado em animais individuais para monitorar as alterações funcionais ao longo de um período de tempo.
9. No ponto final, administrar uma injecção sobredosagem de pentobarbitona de sódio (100 mg / kg, ip) de sacrificar o animal. Confirme a eutanásia por parada cardíaca, parada respiratória e diminuição da temperatura corporal.

4. Preparação de tecidos e Histologia

1. Remova os nervos ópticos de animais sacrificados sob o microscópio e fixar o tecido em paraformaldeído 1% O / N.
2. Lavar cuidadosamente o tecido com solução salina. Tratar o tecido em um processador de tecido automático e incorporar em parafina. Seções de corte (5-10 um) usando um micrótomo rotativo.
   Nota: Para o estudo imuno-histoquímica, fixar o tecido em paraformaldeído a 1%, lavou-se com solução salina e incubar com 30% de sacarose S / N. Tecido incorporar em outubro incorporação médio e fazer criosecções usando um criostato.
3. Incubar seções em 0,1% rápida solução de azul, como Luxol (em 95% de etanol) O / N a 56 ° C. Diferenciar as secções em 0,05% de carbonato de lítio durante 30 seg e em seguida etanol a 70% durante mais 30 seg. Finalmente, contracoloração em solução violeta de cresilo a 0,1% durante 30 s antes de montar as secções. Utilizar a coloração com azul rápido para identificar mielina no nervo óptico ^5.

Resultados

Vestígios VEP intra-sessões reprodutíveis são mostrados na Figura 1 e um atraso significativo na latência N1 pode ser visto depois da injecção do nervo óptico. Lesões do nervo óptico parciais de desmielinização pode ser observado em secções histológicas utilizando coloração com azul rápido Luxol ^5. A Figura 2 mostra uma secção representativa com uma pequena lesão demyelinated focal no centro do nervo óptico. Note-se que a secção transversal não repres...

Discussão

The optic nerve is very susceptible to mechanical damage. Optic nerve crush injury over a duration of 1 s can lead to about 75% loss of RGC over a period of 2 weeks¹⁰. Therefore, extreme care is required while performing the surgical procedures. According to the authors’ experience, it is much better to adapt a blunt dissection approach to expose and make way through the tissues around the optic nerve along the orientation of the nerve, rather than penetrating in a perpendicular orientation to the optic ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine 100 mg/ml (Ketamil)	Troy Laboratories	AC 116
Medetomidine 1 mg/ml (Domitor)	Pfizer	sc-204073
Tropicamide 1.0% (Mydriacyl)	Alcon	sc-202371
Homoeothermic blanket system	Harvard Apparatus	NC9203819
Impedance meter	Grass	F-EZM5
Screw electrodes	Micro Fasteners	M1.0×3mm Csk Slot M/T 304 S/S
Subdermal needle electrodes	Grass	F-E3M-72
Rapid Repair	DeguDent GmbH
Light-emitting diode	Nichia	NSPG300A
Bioamplifier	CWE, Inc.	BMA-400
CED system	Cambridge Electronic Design, Ltd.	Power1401
Hamilton syringe	Hamilton	87930
Lysolecithin	Sigma	L4129
Evan’s blue	Sigma	E2129