実験視神経の脱髄のラットモデルにおける視覚誘発電位の記録

要約

Focal demyelination is induced in the optic nerve using lysolecithin microinjection. Visual evoked potentials are recorded via skull electrodes implanted over the visual cortex to examine the signal conduction along the visual pathway in vivo. This protocol details the surgical procedures underlying electrode implantation and optic nerve microinjection.

要約

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to monitor the disease course in the follow-up period. Changes in the VEP parameters closely correlate with pathological damage in the optic nerve. This protocol provides a detailed description about the rodent model of optic nerve microinjection, in which a partial demyelination lesion is produced in the optic nerve. VEP recording techniques are also discussed. Using skull implanted electrodes, we are able to acquire reproducible intra-session and between-session VEP traces. VEPs can be recorded on individual animals over a period of time to assess the functional changes in the optic nerve longitudinally. The optic nerve demyelination model, in conjunction with the VEP recording protocol, provides a tool to investigate the disease processes associated with demyelination and remyelination, and can potentially be employed to evaluate the effects of new remyelinating drugs or neuroprotective therapies.

概要

Optic neuritis is one of the most common form of optic neuropathy, causing complete or partial loss of vision¹. Histologically, it is featured by inflammatory demyelination, retinal ganglion cell axonal loss and varying degrees of remyelination in the optic nerve². Optic neuritis is usually the manifest onset of multiple sclerosis. The visual evoked potential (VEP) is a non-invasive tool for investigating the function of the visual system. It reflects the post-retinal function from the retina to the primary visual cortex and is affected in many optic nerve disease conditions³. The VEP has been predominantly used in optic neuritis patients to assess the integrity of the visual pathway⁴.

The latency of VEP, which reflects the velocity of signal conduction along the visual pathway, is considered to be an accurate measurement of the level of myelin associated changes in the optic nerve⁵; while the amplitude of VEP is believed to be closely correlated with axonal damage of the retinal ganglion cells (RGC)⁶. This hypothesis has been fairly well established using the rat model of lysolecithin-induced optic nerve demyelination⁵.

Here, we explicate a comprehensive protocol of optic nerve microinjection technique in rodents, which can minimise the surgical manipulation-related damage to the nerve per se as well as to the adjacent tissues such as extraocular muscles and blood vessels. Also, the skull electrode implantation surgery has been described for VEP recording in animals⁷. The VEP recordings can be repeatedly carried out on animals over a period of time to assess demyelination/remyelination related changes as well as impact on axonal integrity in the optic nerve.

プロトコル

倫理声明：動物に関わるすべての手順は、ケアと科学的な目的のための動物の使用と眼科と視覚研究における動物の使用に関するARVOステートメントの指針の実践のためのオーストラリアの規範に従って行われ、によって承認されましたマッコーリー大学の動物倫理委員会。

1. VEP電極移植

1. 腹腔内ケタミンの注射（75 mgの/ kg）およびメデトミジン（0.5ミリグラム/ kg）で動物を麻酔。
   、麻酔の誘導後に手術を開始する指標として離脱反射（ピンチ試験、角膜および眼瞼反射など）と、その不在を守ってください。注意して​​ください。継続的に手術を通して動物を監視し、反射神経が存在する場合、追加の麻酔薬（トップアップあたりの初期ケタミン投与量の10％）を管理。成体ラット（> 12週間）の実験で使用されています。
2. 手術領域の皮膚を剃ります。手術中の体温を維持するために加温パッド（37°C）で動物を置きます。ポビドンヨードの局所適用によって皮膚を準備します。手術用ドレープを適用します。全身麻酔下で角膜の乾燥を防ぐために、局所眼軟膏を適用します。滅菌器具を使用して無菌状態を維持します。
3. 頭皮の正中線上に縦方向の皮膚切開を行います。頭蓋骨の良い露出を達成するために、結合組織をクリアします。
4. 慎重に、ブレグマの後ろに7ミリメートルと正中線に横3ミリメートルでマイクロハンドドリルを使用して手動で小さなバーホールを開けます。
5. 約0.5mmの深さに皮質を貫通皮質（領域17）に頭蓋骨を介してインプラントネジ電極。ブレグマに正中線3mmの吻側の基準スクリュー電極を埋め込みます。ネジを包み込むと固定する歯科用セメントを適用します（必ずしも必要ではありません）。
6. 頭部の皮膚を縫合、皮膚に抗生物質軟膏を投与し、動物がRECOすることができます温暖化パッドの麻酔からの版。
   注：皮膚が各記録に再オープンする必要がないようにあるいは、電極は、露出したままこ​​とができます。手術直後の停止時が、麻酔回復に先立って、非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）（術前に投与されていない場合）、またはオピオイド鎮痛薬を投与します。麻酔薬と完全に歩行から完全に回復するまで、常に動物を監視します。
7. 動物は前VEP記録に手術から回復するために、少なくとも1週間を許可します。

2.視神経インジェクション

1. 、動物を麻酔皮膚を準備し、（1.1と1.2）上記のように立体裁断適用されます。
2. ランダムに選択された目の軌道上の皮膚で1〜1.5 cmの切開を行います。微細なアイリスはさみを使用して眼窩に到達するために皮下組織を開きます。結膜を開き、手術用顕微鏡下でテノン嚢を前方。
3. 外眼を撤回筋肉やintraobital涙腺は、視神経の約3mmの長さを露出させます。縦方向に眼科ブレードを用いて視神経の周りの硬膜とくも膜物質層を開きます。
4. 地球に2mmの後方の距離で視神経にガラスピペットを挿入します。ガラスマイクロピペットは、ハミルトンシリンジに取り付けられています。
5. 約30秒の期間にわたって神経にゆっくりと - （髄鞘形成に影響を持っていない0.02％エバンスブルーで、1.0μlの0.4）1％リゾレシチンを注入します。
6. 皮膚切開を縫合。感染を防ぐために抗生物質軟膏を適用します。フェロー目は電気生理学の記録のための内部コントロールとして提供することができます。
7. 麻酔から回復するために加温パッド上に動物を配置します。

3. VEPの記録

1. 動物を麻酔し、1.1や1.2のように肌を準備します。
   注：麻酔薬の低用量は、電気RECOのために使用することができますrding（ケタミン40 mgの/ kg及び0.25ミリグラム/ kgでメデトミジン）。
2. 暗い部屋で、ラットを置き、それは5のために闇に適応することができます - 30分。いくつかのケースでは、ラットは、それぞれ明所視VEPの記録⁸に適合さ暗順応または光に対する暗順応O / Nとすることができます。
3. 直腸体温計プローブと恒温ブランケットシステムにより37±0.5℃の体温を維持。
4. 1.0％トロピカミド点眼剤と生徒を拡張。 その場でのスクリュー電極に事前配置にアクセスするために頭蓋骨の上の皮膚を開きます。
5. 刺激眼の反対側の視覚皮質とアンプへの基準ネジの上にネジを接続します。グランドとして尾に針電極を挿入します。 5kΩの下の電極インピーダンスを測定し、維持します。
6. 優れた目の分離^7を提供するために、まぶたの周りの皮膚に直接ミニ全体野の刺激を配置します。刺激装置の照度を予め較正する必要があります光度計による。
7. それぞれ、1〜100ヘルツの低域と高域通過フィルタの設定で、1ヘルツの周波数の光が点滅を通じて100回光刺激を提供します。信号のサンプリングレートは5kHzです。
   注：信号は少なくとも約250でサンプリングされるべきである - 3つ以上のサンプルが、各サイクル中に収集されることを保証するために、300ヘルツ。
8. 背中の皮膚を縫合し、麻酔から回復するために加温パッド上で動物を飼います。録音を繰り返し、ある期間にわたって機能的変化を監視するために、個々の動物に記録することができます。
9. エンドポイントで、動物を安楽死させるためにナトリウムペントバルビトン（100mg / kg、腹腔内）の過剰投与の注射を投与します。心停止、呼吸停止や体温の低下によって安楽死を確認します。

4.組織調製および組織学

1. 顕微鏡下で安楽死させた動物から視神経を削除し、1％パラホルムアルデヒドO / Nで組織を固定します。
<李>は、生理食塩水で十分に組織を洗ってください。自動組織プロセッサで組織を処置し、パラフィンに埋め込むことができます。回転式ミクロトームを用いて - （10ミクロン5）のセクションをカット。
免疫組織化学研究のために、1％パラホルムアルデヒド中で組織を固定し、生理食塩水で洗浄し、30％スクロース、O / Nでインキュベート：注意してください。 10月に埋め込む組織がメディアを埋め込み、クライオスタットを用いて、凍結切片を作成します。
2. 56℃で、このようなルクソール（95％エタノール）O / Nとして0.1％ファーストブルー溶液中でのセクションをインキュベートします。 30秒間0.05％の炭酸リチウムと他の30秒間、次いで70％エタノールで切片を差別。最後に、切片をマウントする前に30秒間、0.1％クレシルバイオレット溶液で対比染色。視神経⁵にミエリンを識別するためにファーストブルー染色を使用してください。

結果

再現内会合VEPトレースは、 図1に示されており、N1潜時の有意な遅延は、視神経の注射後に見られます。脱髄の部分視神経病変は、ルクソールファーストブルー染色^5を用いて、組織切片上で観察することができる。 図2は、視神経の中心部にある小さな焦点脱髄病変を持つ代表的な断面を示しています。断面は、病変の総体積を表すものではありませんので注...

ディスカッション

The optic nerve is very susceptible to mechanical damage. Optic nerve crush injury over a duration of 1 s can lead to about 75% loss of RGC over a period of 2 weeks¹⁰. Therefore, extreme care is required while performing the surgical procedures. According to the authors’ experience, it is much better to adapt a blunt dissection approach to expose and make way through the tissues around the optic nerve along the orientation of the nerve, rather than penetrating in a perpendicular orientation to the optic ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine 100 mg/ml (Ketamil)	Troy Laboratories	AC 116
Medetomidine 1 mg/ml (Domitor)	Pfizer	sc-204073
Tropicamide 1.0% (Mydriacyl)	Alcon	sc-202371
Homoeothermic blanket system	Harvard Apparatus	NC9203819
Impedance meter	Grass	F-EZM5
Screw electrodes	Micro Fasteners	M1.0×3mm Csk Slot M/T 304 S/S
Subdermal needle electrodes	Grass	F-E3M-72
Rapid Repair	DeguDent GmbH
Light-emitting diode	Nichia	NSPG300A
Bioamplifier	CWE, Inc.	BMA-400
CED system	Cambridge Electronic Design, Ltd.	Power1401
Hamilton syringe	Hamilton	87930
Lysolecithin	Sigma	L4129
Evan’s blue	Sigma	E2129