JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

منذ فترة طويلة افترض تنظيم خلية من خلايا العظام القحفي ولكن لم تصور مباشرة. وضع العلامات خلية متعددة الأطياف والحية على الهواء مباشرة التصوير يسمح التصور من سلوك الخلية الحيوي في الفك السفلي الزرد. هنا، ونحن بالتفصيل بروتوكول للتلاعب Zebrabow الأسماك المعدلة وراثيا ومراقبة مباشرة إقحام خلية والتغيرات المورفولوجية للغضروفية في غضروف ميكل.

Abstract

تطوير الهياكل القحفي الفقارية يتطلب التنسيق الدقيق للهجرة الخلايا وانتشار، الالتصاق والتمايز. الزخرفة من غضروف ميكل، والبلعوم الأولى قوس مشتق، ينطوي على الهجرة من قمة العصبية في الجمجمة (CNC) خلايا والتدريجي التقسيم وانتشارها وتنظيم غضروفية متباينة. وقد وصفت عدة دراسات الهجرة CNC خلال أقل التشكل الفك، ولكن تفاصيل كيفية غضروفية تحقيق التنظيم في النمو وتوسيع غضروف ميكل لا يزال غير واضح. وsox10 المقيدة والتي يسببها كيميائيا لجنة المساواة العرقية بوساطة recombinase إعادة التركيب يولد التباديل من البروتينات الفلورية متميزة (RFP، YFP وCFP)، وبالتالي خلق وضع العلامات المتعددة الأطياف من الخلايا الاولية وذريتهم، مما يعكس السكان نسيلي متميزة. باستخدام متحد البؤر الوقت الفاصل بين التصوير الفوتوغرافي، فمن الممكن لمراقبة غضروفية behaviأو أثناء وضع الغضروف الزرد ميكل.

وضع العلامات الخلية متعدد الأطياف تمكن العلماء من إثبات تمديد غضروفية وميكل. خلال مرحلة تمديد غضروف ميكل الذي ينبئ الفك السفلي، غضروفية يقحم لإحداث تمديد لأنها كومة في خلية واحدة في الصف الطبقات تنظيما. فشل هذه العملية الإقحام المنظمة للتوسط تمديد خلية يوفر التفسير الآلي الخلوي للفك السفلي عن نقص التنسج التي نلاحظها في تشوهات الفك السفلي.

Introduction

وتتطلب التنمية القحفي الجزيئية، والتفاعلات الخلوية والأنسجة المعقدة لدفع تكاثر الخلايا، والهجرة والتمايز 1،2، 3. هذه عملية منظمة بإحكام ومعقدة وتخضع لاضطرابات وراثية وبيئية، بحيث تشوهات القحفي هي من بين تشوهات المواليد الأكثر شيوعا 1-9. في حين لا تزال التدخلات الجراحية الدعامة الأساسية لعلاج الشذوذ القحفي، فهم أساس التنمية ضروري لابتكار علاجات في المستقبل. لذلك، ودراسة التشكل والآليات في التقارب والإرشاد والتكامل الخلية يقدم أفكارا جديدة في تشكيل الهيكل العظمي القحفي 1.

الجمجمة العصبية ترحيل قمة وملء أول البلعوم القوس، عمليات الفك السفلي ثم شكل تقرن التي تمتد لتشكيل غضروف ميكل الذي ينبئ الفك السفلي. التشكل سو غضروف ميكل يتطلب تنظيم خلية غضروفية عبر انتشار الاتجاه، الاستقطاب الخلايا والتمايز 1،10. ومع ذلك، فإن تعقيد تنظيم خلية غضروفية في النمو وتوسيع غضروف ميكل لا يزال غير واضح. فهم سلوك الخلية الحيوي أمر بالغ الأهمية لفهم التشوهات الخلقية التي تؤثر على حجم الفك السفلي، مثل الظواهر الفك السفلي مصبغ 11.

الأجنة الزرد توفر العديد من المزايا التنموية وراثية لدراسة مفصلة للغضروف ميكل التشكل. من قابلية الإستطراق الجيني، والشفافية، فيفو السابقين والتطور السريع مزايا قوية الإقراض جيدا لرصد حركة الخلايا والمنظمة من قبل التصوير الحي 6. باستخدام أدوات تتبع النسب، مثل sox10: خط المعدلة وراثيا Kaede الذي، نحن وغيرنا قد حددت أصول قمة العصبية الهيكل العظمي القحفي الجنينية 1،5. باليودنانوغرام sox10: ERT2-لجنة المساواة العرقية مع يو بي آي: Zebrabow-M خط المعدلة وراثيا، أصبح من الممكن الآن لاستكشاف تفاصيل الحركات الخلوية أثناء تطوير القحفي. وZebrabow-M، هو خط المعدلة وراثيا هندسيا مع المروج بتحول القيادة التعبير عن fluorophores مختلفة، ولكل يحيط بها مواقع السلمون المدخن 8. وfluorophore الافتراضي Zebrabow-M هو أحمر، معربا عن طلب تقديم العروض. بعد تحريض لجنة المساواة العرقية التعبير، وZebrabow-M بناء يعيد توحيد والخلايا التعبير عن مزيج من fluorophores مختلفة (RFP، CFP وYFP) خلق التعبير متعددة الأطياف في الجنين. كل الخلايا الوليدة التي تفرق من الخلايا المسمى بعد وقوع الحدث إعادة التركيب ثم يتم المسمى متطابق بسلالة، لذلك وصفت أن السكان الخلية التي تستمد من الأسلاف جنبا إلى جنب مختلفة متطابق بسلالة. من خلال هذا الوسم خلية الاستنساخ، وتكاثر الخلايا والهجرة مع قرار نسيلي يمكن اتباعها (الشكل 1 و 2).

Protocol

وافقت لجنة ماساتشوستس العام مستشفى المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) جميع الإجراءات المنصوص عليها في البروتوكول رقم # 2010N000106. هذا هو في الامتثال مع جمعية للتقويم والاعتماد في مختبر رعاية الحيوان الدولية (AAALAC) المبادئ التوجيهية.

1. الكواشف والمواد التحضير

  1. إعداد 1 L من 50X E3 المتوسط ​​الجنين (انظر الجدول 1) وإعداد 1 لتر من 1X E3 المتوسط ​​الجنين (انظر الجدول 2).
  2. إعداد E3 المتوسط ​​الجنين مع N-الفنيل (PTU) وذلك بإضافة 30 ملغ من PTU إلى 1 L من 1X E3. ضجة O / N لضمان أن PTU قد حلت تماما. تخزين في RT.
  3. لإعداد حل pronase، وتمييع 150 ميكرولتر من pronase (0.5 ملغ / مل) مع 15 مل من 1X E3. هذا المبلغ يكفي لطبق بتري 1. استخدامها على الفور.
  4. يعد حل ميثيل.
    1. يعد حل E3-تريكين عن طريق خلط 75 مل من 0.2٪ تريكين مع 25 ملمن 1X E3. يغلي 3 جرام من ميثيل في 75 مل من محلول E3-تريكين.
    2. تشكل الحجم النهائي إلى 100 مل مع حل E3-تريكين. الحل ميثيل النهائي هو لزج وغير شفافة مع لون مصفر. التخزين: RT محمية من الضوء.
  5. تاموكسيفين الأسهم وحل التعريفي
    1. إعداد 5 ملي حل الأسهم تاموكسيفين عن طريق إذابة في الإيثانول بنسبة 100٪، hydroxytamoxifen 4. متجر السهم عند -80 درجة مئوية.
    2. إعداد التخفيف جديدة من التاموكسيفين في تركيز الرغبة في 1X E3 للحصول على حل الاستقراء. الحذر! يرجى الرجوع MSDS قبل الاستخدام.
  6. إعداد 1 L 0.2٪ تريكين حسب الجدول 3.
  7. الحصول على الشرائح مبائر. الغراء أربعة ساترة (18 × 18) معا لتشكيل كتلة ثم وضع لبنات 2 على 24 × 60 سم ساترة 2 الى جانب اتاحة الفرصة المتزايدة للجنين في الوسط.

2. إعداد الأجنة

  1. خطوط المعدلة وراثيا.
    ملاحظة: كان Zebrabow-M هدية سخية من مختبر اليكس شير ل.
  2. sox10: ERT2-لجنة المساواة العرقية
    ملاحظة: توليد ناقلات استهداف pDestTol2- sox10: ERT2-لجنة المساواة العرقية باستخدام أساليب الاستنساخ الجزيئي القياسية والحصول على تجاريا إعادة التركيب تكنولوجيا الاستنساخ.
    1. الجمع بين 5 "استنساخ الدخول (pENTR5'- sox10p) التي تحتوي على 7.2Kb من المروج sox10، استنساخ الأوسط عبارة (PME-ERT2-لجنة المساواة العرقية)، و3 'استنساخ الدخول (pENTR3'-بوليا) في رد فعل LR مع جهة العدسة ناقلات pDestTol2- α-غلوبولين العدسة: YFP.
    2. تنقية بناء pDestTol2- sox10: ERT2-لجنة المساواة العرقية. شارك في حقن بناء (100 نانوغرام / ميكرولتر) تنقيته مع Tol2 transposase مرنا (50 نانوغرام / ميكرولتر) في أجنة WT (F0) في مرحلة خلية واحدة.
    3. شاشة مؤسسي F0 الكبار لنقل خط الجرثومية على أساس مضان أصفر قوي في الأجنة F1.
  3. sox10: ERT2-لجنة المساواة العرقية؛ Zebrabow-M
    1. تهجين وZebrabow-Mخط (2.1.1) مع sox10: خط المعدلة وراثيا ERT2-لجنة المساواة العرقية.
    2. اختر الأجنة اظهار تعبير قوي في كل مكان RFP وYFP عدسة علامة وتنمو لهم حتى الكبار.

3. الأجنة مجموعة

  1. إعداد عدة أزواج من sox10: ERT2-لجنة المساواة العرقية؛ Zebrabow-M الزرد المعدلة وراثيا 17:00 حتي 18:00 في يوم 1.
  2. في اليوم التالي، وسحب فواصل في الصباح وجمع البيض عند الظهر تقريبا.
  3. نقلها إلى أطباق بتري وإضافة 15 مل من محلول pronase إلى dechorionate الأجنة.
  4. احتضان الأجنة عن 1-5 دقائق حتى تم dechorionated ما يقرب من 60٪ من الأجنة. وقف رد فعل من قبل الصب الحل pronase وغسل الأجنة 3-4 مرات مع الطازجة المتوسطة E3.
  5. احتضان الأجنة dechorionated في E3 في RT O / N والسماح لهم تطوير للوصول إلى مرحلة 10 القطع البدنية النمطية. احتضان 50-60 الأجنة في مخلب لتجنب نمو التنموية المختلفة.

    6. 4. علاج

    1. تحقق المرحلة التنموية الأجنة "تحت المجهر مجال ضوء للتأكد من أنها في مرحلة 10 القطع البدنية النمطية.
    2. باستخدام المجهر الفلورسنت مع أحمر بروتين فلوري (RFP) مرشح، عزل الأجنة الحمراء الزاهية.
    3. انتقل إلى تحريض جنة المساواة العرقية، إعادة التركيب من خلال إضافة 10 ميكرومتر من حل hydroxytamoxifen إلى طبق بتري واحتضان الأجنة المعزولة في 28.5 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
    4. صب الحل تاموكسيفين وغسل الأجنة عدة مرات مع E3.
      الحذر! تجاهل الحل تاموكسيفين في وعاء خاص النفايات البيولوجية.
    5. احتضان الأجنة في 28.5 درجة CO / N.
    6. عندما الأجنة هي تقريبا 28-29 مرحلة القطع البدنية النمطية (حوالي 24 ساعة الإخصاب آخر)، واحتضان الأجنة في 28.5 درجة مئوية في E3-PTU حل الآخرة.
      ملاحظة: PTU هنا تستخدم لمنع تشكيل melanophores في الأجنة النامية. هذا هو العلاج اللازم لتجنب تشويه إشارة مضان من قبل melanophores السيارات الفلورسنت.
    7. احتضان الأجنة في 28.5 ° C

    5. اختيار الأجنة

    1. لتصور هياكل القحفي تطويره بالكامل، حدد الأجنة في 4 أيام الإخصاب آخر لشدة الإشارة الحمراء وجنة المساواة العرقية التعبير علامة إيجابية (الصفراء في شبكية العين).
    2. تخدير الأجنة مع الحل E3 / 0.015٪ تريكين. تأكيد التخدير عندما لا تحركات نشطة أو النشاط الزعانف لوحظ عندما حث بلطف الجنين.

    6. تركيب الأجنة في Methycellulose

    1. نقل الجنين اختيارها للتصوير في طبق بتري تحتوي على قطرة من ميتيل وضمخ بلطف الجنين مع ميثيل.
    2. على شريحة متحد البؤر نظيفة، ضع قطرة من ميثيل الطازجة وجبل الجنين الخاص بك في غضون الهبوط باستخدام طرف microloader. موقف الجنين يأخذ ظهريا الحذر عدم لمسالجنين مباشرة.
    3. تغطية الجنين شنت مع 25 × 25 ساترة وضبط الموقف من الجنين إذا لزم الأمر عن طريق التلاعب في ساترة.
    4. الجنين هو الآن على استعداد لصورة.

    تحليل 7. بواسطة المجهر مضان

    1. استخدام الهدف 20x والجاف عدسة (الفتحة العددية 0.75؛ الثقب حجم 2.0 ميكرون) لتركيز الجنين.
    2. اضغط على زر L100 على المجهر واختيار القنوات في البرنامج.
    3. حدد زر الإعداد متحد البؤر وانقر على 'السيارات' وحدد القنوات التالية قبل أن يغلق النافذة: CH1: CFP، CH2: GFP، CH3: طلب تقديم العروض أو mCherry
    4. بدوره على CH2 CH3 وقبل النقر على زر "إزالة التعشيق. انقر على "مسرحية" لبدء المسح الضوئي.
    5. التركيز على بنية الفائدة، التي من الأفضل القيام من خلال البدء مع الإطار ½ / ثانية والجهد العالي (HV) 150 ثم ضبط الإعدادات وفقا لذلك حتى نوعية الصورة المطلوبة هي ميلانhieved. ان طلب تقديم العروض تكون أكثر إشراقا من الألوان الأخرى، وبالتالي ضبط HV. تغيير Z موقف للعثور على حد سواء YFP والخلايا إيجابية طلب تقديم العروض.
    6. مرة واحدة مع مجموعة الضبط، التقاط صورة الجنين الخاص بك. حفظ الصورة الخاصة بك في شكل برامج التصوير وTIFF شكل متحد البؤر لمعالجة الصور في كل قناة الانقسام.
    7. المقبل، لتصوير CFP، إيقاف CH2 CH3 ووتشغيل CH1. إعادة ضبط الإعدادات كما في الخطوة 5 دون تغيير مجال التركيز.
      ملاحظة: CFP يمكن أن يكون من الصعب حقا للكشف بسبب إشارة الخلفية في القناة الزرقاء التي يمكن التحايل عليها من خلال تعديل حجم الثقب. A حجم الثقب أكبر يسمح كشف أفضل لمضان عن طريق الحد من إشارة / نسبة الضوضاء الخلفية. ومع ذلك، فإن الثقب أكبر تقليل تأثير متحد البؤر، المساومة على جودة الصورة. ولذلك، مطلوب التعديل الدقيق لإعدادات لتحقيق جودة الصورة المطلوبة وشدة.
    8. التقاط الصورة وحفظها في شكل كليهما (البرمجيات متحد البؤر وTIFF) لمعالجة الصور. ويمكن بعد ذلك معالجة الصور باستخدام مشترك برامج معالجة الصور لدمج الطبقات وتحسين إعدادات الألوان كما وصفها وعموم الزملاء 8.

النتائج

كان التصور الغضروف التقليدي كلها جبل الألسيان بقع زرقاء لا تقدر بثمن في مراقبة وضع غضروف ميكل وتستخدم عادة لتصور نهائي الخلوي التنظيم 12 (الشكل 1A). لمزيد من تحليل غضروفية تطوير العمل الإضافي، وتتبع النسب باستخدام sox10: خطوط المعدلة وراثيا Kaede الذي مك...

Discussion

خطوط المعدلة وراثيا الزرقاء وphotoconvertible الألسيان كما هو موضح أعلاه يكمل بعضها البعض لتحديد عملية معقدة من الغضاريف ونمو العظام. ومع ذلك، منذ فترة طويلة افترض الهجرة الخلوية الحية والمنظمة خلال توالد وغير مباشرة ولكن أثبتت تصور أبدا. Zebrabow-M خط المعدلة وراثيا إلى جانب و?...

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

الكتاب أشكر أليكس شير لتتكرم تقاسم خط Zebrabow-M المعدلة وراثيا، جيفري بيرنز للناقلات pDEST ورينيه ايتييه-ديغل] لرعاية ممتازة للمنشأة الأسماك والخطوط.

التمويل:

ونحن ممتنون للدعم السخي بتمويل من NIDCR RO3DE024490 ومستشفى شراينرز للأطفال (ECL) والزمالات التدريبية ما بعد الدكتوراه من مستشفى شراينرز للأطفال (LR وYK).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
PronaseRoche Life Sciences10165921001Prepare 500 μl stock aliquots at 50 mg/ml
MethylcelluloseSigma-AldrichM0262
PTU (N-Phenylthiourea)Sigma-AldrichP7619
TricaineSigma-AldrichE10521
4-HydoxyTamoxifenSigma-AldrichT176
24 x 60 coverslipsFisher Scientific12-548-5P
18 x 18 coverslipsFisher Scientific12-540A
25 x 25 coverslipsFisher Scientific12-540C
pENTR5'-TOPO TA Cloning KitLife technologies K591-20
pENTR/D-TOPO Cloning Kit Life TechnologiesK2400-20
pENTR3'-pATol2Kit302
pDESTGift from Geoffrey Burns labs
Bright field microscope 
Fluorescent microscope 
Confocal microscope
Image processing software

References

  1. Dougherty, M., et al. Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis. Development. 140, 76-81 (2013).
  2. Dougherty, M., et al. Embryonic fate map of first pharyngeal arch structures in the sox10: kaede zebrafish transgenic model. The Journal of craniofacial surgery. 23, 1333-1337 (2012).
  3. Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
  4. Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature reviews Genetics. 12, 167-178 (2011).
  5. Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50525 (2013).
  6. McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth defects research. Part C, Embryo today : reviews. 93, 67-114 (2011).
  7. Mossey, P. Dental education and CPD: are you being served. British dental journal. Suppl, 3-4 (2002).
  8. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
  9. Vieira, A. R. . Journal of dental research. 87, 119-125 (2008).
  10. Le Pabic, P., Ng, C., Schilling, T. F. Fat-Dachsous Signaling Coordinates Cartilage Differentiation and Polarity during Craniofacial Development. PLoS genetics. 10, e1004726 (2014).
  11. Ricks, J. E., Ryder, V. M., Bridgewater, L. C., Schaalje, B., Seegmiller, R. E. Altered mandibular development precedes the time of palate closure in mice homozygous for disproportionate micromelia: an oral clefting model supporting the Pierre-Robin sequence. Teratology. 65, 116-120 (2002).
  12. Javidan, Y., Schilling, T. F. Development of cartilage and bone. Methods in cell biology. 76, 415-436 (2004).
  13. McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140, 3254-3265 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

104 sox10 Zebrabow

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved