ויזואליזציה של הכונדרוציטים עיבור וכיוונית למניעת הפצת נשק באמצעות ניתוח תא משובט Zebrabow בסחוס של העוברית מקל

Summary

ארגון תא של עצמות craniofacial כבר שיערו ארוך אבל אף פעם לא דמיין ישירות. תיוג תא Multi-רפאים ובשידור חי vivo הדמיה מאפשרת הדמיה של התנהגות הדינמית של תאים בלסת תחתונה דג הזברה. כאן, אנו פירוט הפרוטוקול לתמרן Zebrabow דג מהונדס וישירות להתבונן עיבור תא ושינויים מורפולוגיים של כונדרוציטים בסחוס של מקל.

Abstract

פיתוח של מבני craniofacial חוליות דורש תיאום מדויק של נדידת תאים, התפשטות, הדבקה ובידול. דפוסים של סחוס של מקל, נגזר קשת בלוע ראשון, כרוך בהגירה של תאי רכס עצבי גולגולתי (CNC) ומחיצות, ההפצה המתקדמת וארגון של כונדרוציטים מובחנים. מספר מחקרים שתוארו הגירת CNC במהלך המורפוגנזה לסת תחתונה, אבל את הפרטים של איך להשיג כונדרוציטים ארגון בצמיחה וההרחבה של הסחוס של מקל עדיין לא ברורים. Sox10 מוגבל ורקומבינציה בתיווך recombinase Cre המושרית כימי יוצרת תמורות של חלבונים שונים ניאון (RFP, YFP וCFP), ובכך ליצור תיוג רב-רפאים של תאי אב וצאצאיהם, המשקפת אוכלוסייה משובט שונה. באמצעות צילום הזמן לשגות confocal, ניתן לצפות בכונדרוציטים behaviאו במהלך הפיתוח של הסחוס של דג הזברה מקל.

תיוג תא Multispectral מאפשר למדענים להפגין סיומת של כונדרוציטים של מקל. במהלך שלב הארכה של סחוס של מקל, שבישר הלסת התחתונה, כונדרוציטים intercalate לבצע הרחבה כפי שהם המחסנית בשורה שכבתית תא בודד מאורגנת. כישלון של תהליך intercalating מאורגן זה לתווך הארכת תא מספק הסבר מכניסטי הסלולרי ללסת תחתונה היפופלסטי שאנו רואים במומי לסת.

Introduction

פיתוח Craniofacial דורש אינטראקציות מולקולריות, תאיות ורקמות מורכבות לנהוג התפשטות תאים, הגירה ובידול ^{1,2, 3.} תהליך מוסדר היטב ומורכב זה כפוף להפרעות גנטיות וסביבתיות, כגון שעיוותי craniofacial הן בין המומים הלידה הנפוצים ביותר ^1-9. בעוד התערבות כירורגית להישאר התווך של טיפול בחריגות craniofacial, הבנת בסיס הפיתוח הוא חיוני לחדש טיפולים עתידיים. לכן, לימוד המורפוגנזה והמנגנונים בהתכנסות והרחבה והאינטגרציה תא מספק תובנות רומן להיווצרות של שלד craniofacial ^1.

להגר רכס העצבי גולגולתי ולאכלס את קשת בלוע הראשונה, תהליכי לסת אז טופס לזווג שמרחיבים לטופס סחוס של מקל, שבישר הלסת התחתונה. o המורפוגנזהF הסחוס של מקל דורש ארגון הכונדרוציטים באמצעות התפשטות כיוונית, קיטוב התא ^ו1,10 בידול. עם זאת, המורכבות של ארגון הכונדרוציטים בצמיחה וההרחבה של הסחוס של מקל עדיין לא ברורות. ההבנה דינמית התנהגות תא היא קריטית להבנת מומים מולדים המשפיעים על גודל לסת, כגון פנוטיפים לסת תחתונה היפופלסטי ^11.

עוברי דג הזברה מציעים יתרונות רבים התפתחותיים וגנטיים למחקר מפורט של המורפוגנזה הסחוס של מקל. נְהִילוּת הגנטית, שקיפות, vivo לשעבר והתפתחות מהירה הן יתרונות חזקים הלוואות זה טוב להתבוננות בתנועת תא וארגון על ידי הדמיה חיה ^6. שימוש בכלי התחקות שושלת, כגון sox10: קו מהונדס קאאד, אנו ואחרים התוו את מקורות רכס העצביים של שלד craniofacial העוברי ^1,5. Using sox10: ERT2-Cre עם UBI: קו מהונדס Zebrabow-M, ניתן כיום לחקור את הפרטים של תנועות סלולריות במהלך פיתוח craniofacial. Zebrabow-M, הוא קו מהונדס מהונדס עם אמרגן היוביקוויטין נהיגה הביטוי של fluorophores שונה, כל אחד מוקף אתרי קס ^8. Fluorophore ברירת מחדל Zebrabow-M הוא אדום, להביע RFP. לאחר האינדוקציה של ביטוי Cre, Zebrabow-M לבנות משתלבת מחדש ותאים להביע שילוב של fluorophores שונה (RFP, CFP ו YFP) יצירת ביטוי רב-רפאים בעובר. כל תאי הבת שלחלק מהתאים שכותרתו לאחר אירוע רקומבינציה לאחר מכן כותרת clonally, כך שאוכלוסיות התאים שנובעות מאבות סמיכותם שונים מסומנות clonally. על ידי תיוג תא שיבוט זה, התפשטות תאים ונדידה עם רזולוציה משובט יכולים להיות אחרי (איור 1 ו -2).

Protocol

הכללית של מסצ'וסטס ועדת בית חולים מוסדי טיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) אישרה את כל הנהלים תחת מספר # פרוטוקול 2010N000106. זה עומד באגודה להערכה והסמכה של מעבדה טיפול בבעלי חיים בינלאומי (AAALAC) הנחיות.

1. ריאגנטים וחומרי הכנה

1. הכן 1 ליטר של 50X בינוני E3 עובר (ראה טבלת 1) ולהכין 1 ליטר של מדיום עובר 1X E3 (ראה טבלה 2).
2. הכן בינוני עובר E3 עם N-Phenylthiourea (PTU) על ידי הוספת 30 מ"ג של PTU לL 1 של 1X E3. O מערבבים / N כדי להבטיח שPTU נמס לגמרי. אחסן בRT.
3. כדי להכין פתרון pronase, לדלל 150 μl של pronase (0.5 מ"ג / מיליליטר) עם 15 מיליליטר של 1X E3. סכום זה מספיק לצלחת פטרי 1. להשתמש באופן מיידי.
4. הכן פתרון Methylcellulose.
   1. הכן פתרון E3-tricaine על ידי ערבוב 75 מיליליטר של tricaine 0.2% עם 25 מיליליטרשל 1X E3. מרתיחים 3 גרם של methylcellulose ב -75 מיליליטר של תמיסת E3-tricaine.
   2. מרכיבים את הנפח הסופי 100 מיליליטר עם פתרון E3-tricaine. פתרון methylcellulose הסופי הוא צמיג ואטום עם גוון צהבהב. אחסון: RT מוגן מפני האור.
5. מניית טמוקסיפן ופתרון אינדוקציה
   1. הכן 5 מ"מ פתרון מניות טמוקסיפן ידי ההמסה ב 100% אתנול-hydroxytamoxifen 4. מניית החנות ב -80 ° C.
   2. הכן דילול טרי של טמוקסיפן בריכוז הרצון ב1X E3 להשיג פתרון האינדוקציה. זהירות! יש להתייעץ MSDS לפני השימוש.
6. הכן 1 ליטר של tricaine 0.2% בהתאם לטבלה 3.
7. להשיג שקופיות confocal. דבק ארבעה coverglass (18 x 18) יחד כדי ליצור בלוק אז במקום 2 בלוקים על coverglass 24 x 60 סנטימטר זה מזה 2 כדי לאפשר הרכבה של העובר באמצע.

2. העובר הכנה

1. קווים מהונדסים.
   הערה: Zebrabow-M הייתה מתנה נדיבה מהמעבדה של אלכס Schier.
2. sox10: ERT2-Cre
   הערה: צור וקטור מיקוד pDestTol2- sox10: ERT2-Cre באמצעות שיטות שיבוט מולקולרי סטנדרטיים ומסחרית שהושגה רקומבינציה שיבוט טכנולוגיה.
   1. לשלב 5 'שיבוט כניסה (pENTR5'- sox10p) המכיל 7.2Kb של אמרגן sox10, שיבוט אמצע Gateway (PME-ERT2-Cre), ו3' שיבוט כניסה (pENTR3'-פולה) בתגובת LR עם יעד עדשה וקטור pDestTol2- α-crystallin: YFP.
   2. לטהר מבנה pDestTol2- sox10: ERT2-Cre. שיתוף להזריק המבנה מטוהר (100 ng / μl) עם mRNA Tol2 transposase (50 ng / μl) לעוברי WT (F0) בשלב תא אחד.
   3. מייסדי מבוגרים F0 מסך לשידור נבט-קו המבוססים על הקרינה צהובה חזקה בעוברי F1.
3. sox10: ERT2-Cre; Zebrabow-M
   1. Outcross Zebrabow-Mקו (2.1.1) עם sox10: הקו המהונדס ERT2-Cre.
   2. עוברים בחרו מציגים ביטוי חזק בכל מקום RFP וסמן עדשת YFP ולגדל אותם עד מבוגרים.

אוסף 3. העובר

1. הקים כמה זוגות sox10: ERT2-Cre; דג הזברה מהונדס Zebrabow-M 17:00-06:00 ביום 1.
2. למחרת, למשוך את החוצצים בבוקר ולאסוף את הביצים בשעתי הצהריים.
3. העבר אותם לפטרי מנות ולהוסיף 15 מיליליטר של פתרון pronase לdechorionate את העוברים.
4. דגירה עובר ל1 עד 5 דקות, עד כ -60% מהעוברים כבר dechorionated. לעצור את התגובה באמצעות אחסון פתרון pronase ולשטוף את העוברים 3-4 פעמים עם מדיום E3 טרי.
5. דגירה עובר dechorionated בE3 ב RT O / N ולתת להם לפתח כדי להגיע לשלב 10 somites. דגירה 50-60 עוברים לכל מצמד, כדי למנוע צמיחה התפתחותיים שונה.

4. טיפול

1. בדוק שלב ההתפתחותי של העוברים תחת מיקרוסקופ שדה אור כדי להבטיח שהם נמצאים בשלב 10 somites.
2. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן אדום חלבון פלואורסצנטי (RFP), לבודד את העוברים בצבע אדומים הבוהקים.
3. המשך לאינדוקציה של Cre-רקומבינציה על ידי הוספת 10 מיקרומטר של פתרון hydroxytamoxifen לצלחת פטרי ודוגרים עוברים המבודדים על 28.5 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
4. למזוג את פתרון טמוקסיפן ולשטוף את העוברים כמה פעמים עם E3.
   זהירות! השלך את פתרון טמוקסיפן במכל פסולת ביולוגי מיוחד.
5. דגירה עובר על 28.5 מעלות CO / N.
6. כאשר הם עובר כ שלב somites 28-29 (כ 24 שעות לאחר ההפריה), דגירה את העוברים על 28.5 מעלות צלזיוס בלהלן פתרון E3-PTU.
   הערה: PTU הוא כאן נהג לעכב היווצרות melanophores בעוברים המתפתחים. טיפול זה הוא הכרחי ללמנוע את עיוות האות של הקרינה על ידי melanophores האוטומטי ניאון.
7. דגירה עובר על 28.5 מעלות צלזיוס

בחירת 5. העובר

1. כדי להמחיש את מבני craniofacial מפותחים, בחר את העוברים על 4 ימים לאחר הפריה לעוצמת האות האדומה וחיוביות Cre סמן ביטוי (צהובה ברשתית).
2. להרדים את העוברים עם פתרון E3 / 0.015 tricaine%. הרדמה הוא אישר כאשר אין תנועות פעילים או פעילות סנפיר הוא ציינה כאשר בעדינות דוחפות את העובר.

6. הרכבה העובר בMethycellulose

1. העבר את העובר שנבחר להדמיה לצלחת פטרי המכילה ירידה של methylcellulose ועדינות לחנוט את העובר עם methylcellulose.
2. בשקופית confocal נקייה, במקום ירידה של methylcellulose הטרי והר העובר שלך בירידה באמצעות קצה microloader. עובר העמדה dorsally לוקח זהירות לא לגעתהעובר ישירות.
3. מכסה את העובר רכוב עם coverslip 25 x 25 ולהתאים את המיקום של העובר במידת צורך על ידי מניפולציה של coverslip.
4. העובר מוכן לתמונה עכשיו.

7. ניתוח על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי

1. השתמש במטרת 20x היבשה העדשה (הצמצם מספרי 0.75; גודל חריר 2.0 מיקרומטר) להתמקדות העובר.
2. לחץ על הכפתור L100 על המיקרוסקופ ובחר את הערוצים בתוכנה.
3. בחר confocal התקנת לחצן ולחץ על 'אוטומטי' ובחר את הערוצים הבאים לפני סגירת החלון: CH1: CFP, CH2: GFP, CH3: RFP או mCherry
4. הפעל CH2 וCH3 לפני לחיצה על הכפתור 'להסיר את הנעילה'. לחץ על 'הצגה' כדי להתחיל בסריקה.
5. להתמקד במבנה של עניין, שנעשה על ידי המיטב מתחיל עם מסגרת ½ / sec ומתח גבוה (HV) 150 ולאחר מכן לשנות את ההגדרות בהתאם עד איכות התמונה הרצויה היא AChieved. RFP יהיה בהיר יותר מצבע אחר, ולכן להתאים את HV. לשנות את מיקום Z למצוא שני YFP ותאים חיוביים RFP.
6. ברגע שנקבע עם ההגדרות, ללכוד את התמונה של העובר שלך. להציל את התמונה שלך בפורמט פורמט תוכנת הדמיה וTIFF confocal לעיבוד תמונה בכל ערוץ מפוצל.
7. בשלב הבא, להדמיה CFP, לכבות את CH2 וCH3 ולהפעיל CH1. להתאים מחדש את ההגדרות כמו בשלב 5 מבלי לשנות את אזור המיקוד.
   הערה: CFP יכול להיות ממש קשה לזהות בגלל אות רקע בערוץ כחול שניתן לעקוף באמצעות התאמת גודל חריר. גודל חריר גדול יותר מאפשר זיהוי טוב יותר של הקרינה על ידי הקטנת יחס רעש אות / רקע. עם זאת, חריר גדול יותר יפחית השפעת confocal, להתפשר על איכות תמונה. לכן, התאמה מדוקדקת של ההגדרות נדרש כדי להשיג את איכות תמונה הרצויה ועוצמה.
8. ללכוד את התמונה ולשמור אותו בפורמט שניהם (תוכנת confocal וTIFF) לעיבוד תמונה. אז יכולות להיות מעובד תמונות באמצעות תוכנת עיבוד תמונה נפוצה למזג שכבות ולשפר את הגדרות צבע כפי שתוארו על ידי פאן ועמיתים ^8.

תוצאות

הדמיה סחוס מסורתית על ידי כתמים כחולים הר Alcian כל כבר לא יסולא בפז בהתבוננות הסחוס של מקל פיתוח ונפוץ לדמיין (איור 1 א) הסלולרי סופי ארגון ^12. כדי לנתח נוסף כונדרוציטים פיתוח שעות נוספות, התחקות שושלת באמצעות sox10: קווים מהונדסים קאאד אפשרו לנו ללמוד נד...

Discussion

קווים מהונדסים כחולים וphotoconvertible Alcian כפי שתואר לעיל משלים אחד את השני כדי להגדיר את התהליך המורכב של סחוס ועצם פיתוח. עם זאת, העברת חיה סלולרית וארגון במהלך organogenesis כבר שיערו ארוכה ובעקיפין הפגינו אבל מעולם לא דמיינו. קו מהונדס Zebrabow-M בשילוב עם סחוס Cre הספציפי מאפשר תצפ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pronase	Roche Life Sciences	10165921001	Prepare 500 μl stock aliquots at 50 mg/ml
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0262
PTU (N-Phenylthiourea)	Sigma-Aldrich	P7619
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
4-HydoxyTamoxifen	Sigma-Aldrich	T176
24 x 60 coverslips	Fisher Scientific	12-548-5P
18 x 18 coverslips	Fisher Scientific	12-540A
25 x 25 coverslips	Fisher Scientific	12-540C
pENTR5'-TOPO TA Cloning Kit	Life technologies	K591-20
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Life Technologies	K2400-20
pENTR3'-pA	Tol2Kit	302
pDEST			Gift from Geoffrey Burns labs
Bright field microscope
Fluorescent microscope
Confocal microscope
Image processing software