Visualisierung von Chondrozyten-Einlagerung und Directional Verbreitung über Zebrabow klonalen Zellanalyse in der embryonalen Meckel-Knorpel

Zusammenfassung

Zellorganisation von Gesichtsschädelknochen war lange vermutet worden, aber nie direkt sichtbar gemacht. Multi-Spektral-Zellmarkierung und in vivo-Live- Bildgebung ermöglicht Visualisierung dynamischer Zellverhalten im Zebrafisch Unterkiefer. Hier haben wir ausführlich das Protokoll zu manipulieren Zebrabow transgene Fische und direkt zu beobachten Zell Einlagerung und morphologischen Veränderungen der Knorpelzellen in der Meckel-Knorpel.

Zusammenfassung

Entwicklung der Wirbeltiere kraniofazialen Strukturen erfordert eine genaue Abstimmung der Zellmigration, Proliferation, Adhäsion und Differenzierung. Strukturieren der Meckel-Knorpel, einem ersten Schlundbogen-Derivat, beinhaltet die Migration der Schädel Neuralleiste (CNC) Zellen und die fortschreitende Partitionierung, Proliferation und Organisation von differenzierten Chondrozyten. Mehrere Studien haben CNC Migration während der Unterkiefer Morphogenese beschrieben, aber die Details, wie die Chondrozyten zu erreichen Organisation in das Wachstum und die Erweiterung der Meckel-Knorpel, bleibt unklar. Die Sox10 beschränkt und chemisch induzierte Cre-Rekombinase-vermittelte Rekombination erzeugt Permutationen von verschiedenen fluoreszierenden Proteinen (RFP, YFP und CFP), wodurch die Schaffung eines multispektralen Kennzeichnung von Vorläuferzellen und deren Nachkommen, was deutliche Klonpopulationen. Mittels konfokaler Zeitraffer-Fotografie, ist es möglich, die Chondrozyten beobachten behavioder während der Entwicklung des Zebrafisches Meckel-Knorpel.

Multispektrale Zellmarkierung ermöglicht es Wissenschaftlern auf eine Verlängerung des Meckel-Chondrozyten zu demonstrieren. Während der Extensionsphase des Meckel-Knorpel, der den Unterkiefer vorwegnimmt, interkalieren Chondrozyten zu Verlängerung zu bewirken, wie sie in einer organisierten Einzelzellschicht Reihe stapeln. Die Nichtbeachtung dieser organisierten interkalierenden Prozess zur Zellerweiterung vermitteln, bietet das Mobil mechanistische Erklärung für die hypoplastischen Unterkiefer, die wir in der Unterkieferfehlbildungen zu beobachten.

Einleitung

Kraniofazialen Entwicklung erfordert komplexe molekularer, zellulärer und Gewebe-Wechselwirkungen, die Zellproliferation, Migration und Differenzierung ^{1,2, 3} fahren. Diese streng reguliert und komplexer Prozess unterliegt genetischen und umweltbedingten Störungen, so dass kraniofazialen Fehlbildungen gehören zu den häufigsten Geburtsfehlbildungen ^1-9. Während chirurgischer Eingriffe bleiben die Hauptstütze der Behandlung für kraniofaziale Anomalien, das Verständnis der Entwicklung Basis ist wichtig, um zukünftige Therapien zu innovieren. Daher Studium der Morphogenese und die Mechanismen in der Konvergenz und der Erweiterung und Zell Integration bietet neue Einblicke in die Bildung des kraniofazialen Skeletts ^1.

Schädel Neuralleiste migrieren und Füllen der ersten Schlundbogen, dann gepaart bilden Kiefer Prozesse, die zur Meckel-Knorpel, der den Unterkiefer vorwegnimmt bilden verlängern. Morphogenese of der Meckel-Knorpel benötigt Chondrozyten-Organisation über Richtungsproliferation, Zellpolarisation und Differenzierung ^1,10. Allerdings bleibt die Komplexität der Chondrozyten-Organisation in das Wachstum und die Erweiterung des Meckel-Knorpel unklar. Grundlegendes zu dynamischen Zellverhalten ist entscheidend für das Verständnis angeborene Fehlbildungen betroffen Kiefergröße, wie hypoplastische Mandibula Phänotypen ^11.

Zebrafischembryonen bieten viele Entwicklungs- und genetische Vorteile für die detaillierte Untersuchung der Meckel-Knorpel Morphogenese. Ihre genetische Lenkbarkeit, Transparenz, ex vivo und schnelle Entwicklung sind leistungsstarke Vorteile verleiht ihm auch zur Beobachtung der Zellbewegung und Organisation von ^{Live-Imaging-6.} Verwendung Linie-Tracing-Tools, wie Sox10: kaede transgene Linie, haben wir und andere der Neuralleiste Ursprünge der embryonalen kraniofazialen Skeletts ^1,5 abgegrenzt. Using der Sox10: ERT2-Cre mit dem ubi: Zebrabow-M transgene Linie, ist es nun möglich, um Details des Zellbewegungen während kraniofazialen Entwicklung zu erforschen. Die Zebrabow-M, eine transgene Linie mit der Ubiquitin-Promotor, der die Expression von verschiedenen Fluorophore, die jeweils von Lox-Stellen flankiert ⁸ entwickelt. Die Zebrabow-M Standard Fluorophor Rot, RFP ausdrückt. Nach Induktion der Cre-Expression, die Zebrabow-M zu konstruieren rekombiniert und Zellen exprimieren eine Kombination von verschiedenen Fluorophoren (RFP, CFP und YFP) Erzeugen multispektraler Expression im Embryo. Alle Tochterzellen, die von den markierten Zellen nach dem Rekombinationsereignis teilen werden dann klonal beschriftet, so dass die Zellpopulationen, die aus verschiedenen nebeneinander liegenden Vorläuferzellen abgeleitet werden klonal beschriftet. Durch diese Klonierung Markierung von Zellen, können die Zellen-Proliferation und Migration mit klonaler Auflösung (Abbildung 1 und 2) eingehalten werden.

Protokoll

Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) genehmigt alle Verfahren unter Protokollnummer # 2010N000106. Dies ist im Einklang mit der Gesellschaft für Evaluierung und Akkreditierung von Laboratory Animal Care International (AAALAC) Richtlinien.

1. Reagenzien und Materialien Vorbereitung

1. Bereiten Sie 1 l 50X E3 Embryo Medium (siehe Tabelle 1) und bereiten 1 l 1X E3 Embryo Medium (siehe Tabelle 2).
2. Vorbereitung E3 Embryo Medium mit N-Phenylthioharnstoff (PTU), die durch Zugabe von 30 mg PTU zu 1 l 1X E3. Stir O / N, um sicherzustellen, daß die PTU vollständig gelöst hat. Lagern bei RT.
3. Auf Pronase-Lösung herzustellen, verdünnter 150 ul Pronase (0,5 mg / ml) mit 15 ml 1X E3. Diese Menge reicht für 1 Petrischale. Verwenden Sie sofort.
4. Bereiten Methylcellulose-Lösung.
   1. Vorbereitung E3-Tricaine Lösung durch Mischen von 75 ml 0,2% Tricaine mit 25 ml1X E3. Sieden 3 g Methylcellulose in 75 ml E3-Tricaine Lösung.
   2. Bilden das Endvolumen auf 100 ml mit E3-Tricaine Lösung. Die endgültige Methylcelluloselösung ist viskos und opak mit einem gelblichen Farbton. Lagerung: RT lichtgeschützt.
5. Tamoxifen Lager und Induktionslösung
   1. Vorbereitung 5 mM Tamoxifen Stammlösung durch Auflösen von 4-Hydroxytamoxifen in 100% Ethanol. Shop Lager bei -80 ° C.
   2. Bereiten Sie frische Verdünnung von Tamoxifen auf den Wunsch Konzentration in 1X E3, um die Induktion Lösung zu erhalten. VORSICHT! Bitte wenden Sie sich vor dem Gebrauch MSDS.
6. Bereiten Sie 1 l 0,2% Tricaine gemäß Tabelle 3.
7. Erhalten konfokalen Rutschen. Kleben Sie vier Deckglas (18 x 18) zusammen, um einen Block zu bilden dann legen Sie 2 Blocks auf einem 24 x 60 Deckglas 2 cm voneinander entfernt, damit die Montage des Embryos in der Mitte.

2. Embryo Vorbereitung

1. Transgenen Linien.
   Hinweis: Zebrabow-M war ein großzügiges Geschenk von Alex Schier Labor.
2. Sox10: ERT2-Cre
   HINWEIS: Generieren Sie die Targeting-Vektor pDestTol2- Sox10: ERT2-Cre unter Verwendung von Standardverfahren und molekulare Klonierung kommerziell erhalten Rekombination Cloning-Technologie.
   1. Kombinieren Sie 5 "entry clone (pENTR5'- sox10p) enthält 7.2Kb des Sox10-Promotor, eine Gateway-Mitte-Klon (PME-ERT2-Cre) und eine 3'-entry clone (pENTR3'-polyA) in einer LR-Reaktion mit Objektiv Ziel vector pDestTol2- α-Kristallin: YFP.
   2. Reinige Konstrukt pDestTol2- Sox10: ERT2-Cre. Co-einspritzen des gereinigten Konstrukts (100 ng / ul) mit Tol2 Transposase mRNA (50 ng / & mgr; l) in WT Embryonen (F0) an dem einen Zellstadium.
   3. Screen F0 Erwachsenen Gründer für Keimbahn-Übertragung auf der Grundlage starker gelber Fluoreszenz in F1 Embryonen.
3. Sox10: ERT2-Cre; Zebrabow-M
   1. Outcross die Zebrabow-MLinie (2.1.1) mit der Sox10: ERT2-Cre transgene Linie.
   2. Wählen Sie die Embryonen eine starke allgegenwärtigen RFP Ausdruck und YFP Linsenmarkierung und wachsen sie, bis Erwachsenen zeigt.

3. Embryonen

1. Richten Sie mehrere Paare von Sox10: ERT2-Cre; Zebrabow-M transgenen Zebrafisch von 17.00 bis 06.00 Uhr am Tag 1.
2. Am folgenden Tag, ziehen Sie die Teiler in der Früh und sammeln die Eier um die Mittagszeit.
3. Übertragen Sie sie auf Petrischalen und fügen Sie 15 ml des Pronaselösung, um die Embryonen dechorionate.
4. Die Embryonen für 1 bis 5 min inkubieren, bis ca. 60% der Embryonen wurden dechorionated. Die Reaktion durch Dekantieren der Pronaselösung und waschen Sie die Embryonen 3-4 mal mit frischem E3 Medium.
5. Inkubieren Sie die dechorionated Embryonen in E3 bei RT O / N und lassen Sie sie zu entwickeln, um die 10 Somiten Stadium zu erreichen. Inkubieren 50-60 Embryonen pro Gelege zu verschiedenen Entwicklungswachstum zu vermeiden.

4. Behandlung

1. Überprüfen Entwicklungsstadium der Embryonen unter einem Lichtfeld-Mikroskop, um sicherzustellen, sie sind auf dem 10 Somiten Stadium.
2. Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops mit einem rot fluoreszierendes Protein (RFP) Filter, isolieren die leuchtend roten Embryonen.
3. Verfahren zur Induktion des Cre-Rekombination durch Zugabe von 10 uM Hydroxytamoxifen Lösung in eine Petrischale und Inkubieren der isolierten Embryonen bei 28,5 ° C für 3 Stunden.
4. Dekantiert man die Tamoxifen-Lösung und waschen Sie die Embryonen mehrmals mit E3.
   VORSICHT! verwerfen die Tamoxifen-Lösung in einem speziellen biologischen Abfallbehälter.
5. Die Embryonen Inkubation bei 28,5 ° CO / N.
6. Wenn die Embryonen sind ungefähr 28-29 Somiten Stadium (etwa 24 Stunden nach der Befruchtung), Inkubation der Embryonen bei 28,5 ° C in der E3-PTU-Lösung Jenseits.
   HINWEIS: PTU hier verwendet, um die Bildung von Melanophoren in den sich entwickelnden Embryonen zu hemmen. Diese Behandlung notwendig istvermeiden Sie die Signalverzerrung der Fluoreszenz von Autofluoreszenz Melanophoren.
7. Die Embryonen Inkubation bei 28,5 ° C

5. Embryonenauswahl

1. Um die ausgereifte kraniofazialen Strukturen sichtbar zu machen, wählen Sie die Embryonen im 4 Tage nach der Befruchtung für die Intensität des roten Signals und Cre Expressionsmarker Positivität (gelb in der Netzhaut).
2. Betäuben die Embryonen mit E3 / 0,015% Tricaine Lösung. Anästhesie wird bestätigt, wenn keine aktiven Bewegungen oder fin-Aktivität beobachtet wird, wenn sanft Drängen des Embryos.

6. Montage der Embryo in Methylcellulose

1. Übertragung der gewählten Embryo zur Bildgebung in eine Petrischale gegeben, die einen Tropfen von Methylcellulose und sanft embalm den Embryo mit Methylcellulose.
2. Auf eine saubere konfokalen Rutsche, einen Tropfen von frischem Methylcellulose und montieren Ihren Embryo innerhalb der Tropfen mit Hilfe eines Microloader Spitze. Position Embryo dorsal unter Vorsicht, nicht zu berührender Embryo direkt.
3. Decken Sie die montierten Embryo mit einer 25 x 25 Deckglas und die Position des Embryos ggf. durch Manipulation des Deckglases.
4. Der Embryo ist nun bereit, image.

7. Analyse durch Fluoreszenzmikroskopie

1. Nutzen Sie die 20-fach trockenen Linsenobjektiv (numerische Apertur 0,75; Lochblendengröße 2,0 um) zum Fokussieren des Embryos.
2. Drücken Sie die L100-Taste auf dem Mikroskop und wählen Sie die Kanäle in der Software.
3. Wählen Sie das konfokale Setup-Taste und klicken Sie auf 'auto' und wählen Sie die folgenden Kanäle vor dem Schließen des Fensters: Ch1: CFP, Kanal 2: GFP, Ch3: RFP oder mCherry
4. Schalten Sie CH2 und CH3, bevor Sie auf die 'entfernen Interlock "-Taste. Klicken Sie auf "Play", um das Scannen zu beginnen.
5. Konzentrieren Sie sich auf Struktur von Interesse, die sich am besten, indem Sie mit ½ Rahmen / s und Hochspannung (HV) 150 und dann die Einstellungen entsprechend durchgeführt wird, bis die gewünschte Bildqualität achieved. Der RFP wäre heller als andere Farben, damit die HV einzustellen. Ändern Sie die Z-Position, um sowohl YFP und RFP-positiven Zellen zu finden.
6. Sobald Sie mit den Einstellungen festgelegt, erfassen Sie das Image Ihres Embryos. Speichern Sie Ihr Bild in der konfokalen Imaging-Software-Format und TIFF-Format für die Bildverarbeitung in jedem Split-Kanal.
7. Als nächstes wird für CFP-Bildgebung, schalten Sie CH2 und CH3, und schalten Sie Ch1. Durch Veränderung der Einstellungen wie in Schritt 5 ohne Änderung des Fokusbereichs.
   HINWEIS: CFP kann wirklich schwer zu erkennen aufgrund von Hintergrundsignal in blauen Kanal, der durch Einstellen der Lochblendengröße umgangen werden kann. Eine größere Lochblendengröße ermöglicht eine bessere Detektion der Fluoreszenz durch die Reduzierung Signal / Rausch-Verhältnis. Allerdings wird eine größere Pinhole konfokalen Effekt zu reduzieren, Kompromisse bei der Bildqualität. Daher ist eine sorgfältige Einstellung der Einstellungen erforderlich ist, um die gewünschte Bildqualität und Intensität zu erreichen.
8. Nehmen Sie das Bild und speichern Sie es in der sowohl Format (konfokalen Software und TIFF) für die Bildverarbeitung. Bilder können dann mit gängigen Bildverarbeitungssoftware, um Schichten zusammenzuführen und zur Verbesserung der Farbeinstellungen, wie Pan und Kollegen ⁸ beschrieben verarbeitet werden.

Ergebnisse

Traditionelle Knorpel Visualisierung ganze Berg Alcianblau Flecken ist von unschätzbarem Wert bei der Beobachtung der Entwicklung von Meckel-Knorpel und häufig verwendet, um endgültige zelluläre Organisation ¹² (1A) zu visualisieren. Um die Entwicklung von Knorpelzellen weiter zu analysieren Überstunden, Linie Tracing mit Sox10: Kaede transgenen Linien hat uns ermöglicht, die Zellmigration, Konvergenz und Extension im Live-Embryonen ^2,12 (1B) zu stud...

Diskussion

Alcianblau und Photokonvertierbare transgenen Linien wie oben beschrieben, gegenseitig ergänzt den komplizierten Prozess der Knorpel- und Knochenentwicklung zu bestimmen. Allerdings hat Live-Zellmigration und Organisation während der Organogenese lange vermutet worden und indirekt nachgewiesen, aber nie visualisiert. Zebrabow-M transgene Linie gepaart mit einer Knorpel spezifischen Cre ermöglicht die gleichzeitige Live-Beobachtung aller dieser verschiedenen Ereignisse im Knochen- und Knorpelbildung beteiligt. Diese T...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pronase	Roche Life Sciences	10165921001	Prepare 500 μl stock aliquots at 50 mg/ml
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0262
PTU (N-Phenylthiourea)	Sigma-Aldrich	P7619
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
4-HydoxyTamoxifen	Sigma-Aldrich	T176
24 x 60 coverslips	Fisher Scientific	12-548-5P
18 x 18 coverslips	Fisher Scientific	12-540A
25 x 25 coverslips	Fisher Scientific	12-540C
pENTR5'-TOPO TA Cloning Kit	Life technologies	K591-20
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Life Technologies	K2400-20
pENTR3'-pA	Tol2Kit	302
pDEST			Gift from Geoffrey Burns labs
Bright field microscope
Fluorescent microscope
Confocal microscope
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