Embriyonik Meckel Kıkırdak içinde Zebrabow klonal Hücre Analizi aracılığıyla Kondrosit interkalasyonu ve Yön Yayılması Görselleştirme

Özet

Kraniyofasiyal kemiklerin Hücre organizasyonu uzun öne sürülmüştür ancak doğrudan görüntülenmiştir olmamıştı. Çok spektral hücre etiketleme ve in vivo canlı olarak Görüntüleme Zebra balığı alt çene dinamik hücre davranışı görselleştirme sağlar. Burada, biz detay protokolü Zebrabow transgenik balık işlemek için doğrudan hücre ardalanması ve Meckel kıkırdak kondrosit morfolojik değişiklikleri gözlemek.

Özet

Omurgalı kraniofasial yapıların geliştirilmesi hücre göçü, çoğalması, yapışma ve farklılaşma hassas koordinasyon gerektirir. Meckel kıkırdağı, birinci farengeal kemer türevinin, bir Desenlendirme kranial nöral krest (CNC) hücrelerin göçünü ve ilerici bölümleme, çoğalmasını ve farklılaştırılmış kondrositlerin organizasyonunu gerektirir. Çeşitli çalışmalar alt çene morfolojilerinden sırasında CNC göç tarif, ama kondrositler Meckel kıkırdak büyümesi ve uzantısı organizasyonu gerçekleştirmek nasıl ayrıntıları belirsizliğini korumaktadır. Sox10 kısıtlı ve kimyasal olarak neden olunan Cre rekombinaz aracılı rekombinasyon ve böylece ayrı bir klonal popülasyonları yansıtan progenitör hücrelerin ve bunların soyu bir multi-spektral etiketleme oluşturma farklı floresan protein (RFP, YFP ve CFP) PERMÜTASYON oluşturur. Konfokal zaman atlamalı fotoğraf kullanarak, kıkırdak gözlemlemek mümkündür Behaviya Zebra balığı Meckel kıkırdak gelişimi sırasında.

Çok bantlı cep etiketleme Meckel kondrosit uzantısı göstermek için bilim adamları sağlar. Çene prefigures Meckel kıkırdağı, uzatma aşamasında, kondrositlere onlar organize bir tek hücreli katmanlı satırda yığını olarak uzantısı etkileyecek enterkale. Hücre uzantısı aracılık etmek, bu örgütlü interkalasyon sürecinin başarısızlığı biz çene malformasyonlar gözlemlediğimiz hipoplastik mandibula için hücresel mekanistik açıklama sağlar.

Giriş

Kraniyofasiyal gelişme hücre çoğalması, göç ve farklılaşma ^{1,2, 3} sürücü karmaşık moleküler, hücresel ve doku etkileşimleri gerektirir. Bu sıkı regüle ve karmaşık bir süreç kraniofasial deformiteler en yaygın doğum anomalileri ^1-9 arasında olacak şekilde genetik ve çevresel pertürbasyonlar tabidir. Cerrahi girişimler geliştirme temelini anlamak, kraniofasyal anomaliler için tedavinin temelini kalırken gelecek tedaviler yenilik şarttır. Bu nedenle, yakınsama ve uzatma ve hücre entegrasyonu morfolojilerinden ve mekanizmaları okuyan kraniofasyal iskeletin ¹ oluşumuna yepyeni bakış açıları sağlar.

Kranial nöral krest geçirmek ve birinci faringeal kemer çene prefigures Meckel kıkırdağı, oluşturmak için uzatmak, daha sonra eşleştirilmiş formu mandibular süreçler doldurmak. Morphogenesis oMeckel kıkırdağı f yönlü çoğalması, hücre kutuplaşma ve farklılaşma ^1,10 üzerinden kondrosit organizasyon gerektirmektedir. Ancak, Meckel kıkırdak büyümesi ve uzantısı kondrosit örgütünün karışıklık belirsizliğini koruyor. Dinamik hücre davranışını anlamak gibi hipoplastik mandibula fenotipleri ¹¹ olarak çene boyutu, etkileyen konjenital anomali anlamak için çok önemlidir.

Zebra balığı embriyolar Meckel kıkırdağı morfolojilerinden ayrıntılı çalışma için birçok gelişimsel ve genetik avantajlar sunuyoruz. Onların genetik tractability, şeffaflık, ex vivo ve hızlı bir gelişme canlı görüntüleme ⁶ hücre hareketi ve organizasyon gözlem için iyi kredi güçlü avantajları vardır. Böyle sox10 olarak soy-tracing araçları kullanarak: kaede transgenik çizgi, biz ve diğerleri embriyonik kraniofasyal iskeletin ^1,5 nöral krest kökenlerini tasvir var. Usiubi ile ERT2-Cre: sox10 ng Zebrabow-M transgenik hat, bu Kraniofasiyal gelişimi sırasında hücresel hareketlerin ayrıntılarını keşfetmek için artık mümkün. Zebrabow-M, farklı flüoroforlar ifadesini süren ubikuitin promotörü, Lox sitelerinin ⁸ tarafından sınırlanan her biri ile tasarlanmış bir transgenik bir çizgidir. Zebrabow-M varsayılan fluorofor RFP ifade Kırmızı. Cre ifade indüksiyon sonrasında Zebrabow-M birleşir inşa ve hücreler embriyo çoklu spektral ifade oluşturarak farklı fluorophores (RFP, OBP ve YFP) birleşimini ifade eder. Farklı yan yana atalarıdır kaynaklandığını hücre popülasyonları klonal etiketli böylece rekombinasyon olaydan sonra etiketli hücrelerden bölmek Tüm kızı hücreleri daha sonra klonal, etiketli. Bu klonlama hücre etiketleme ile klonal çözünürlüğe sahip hücre proliferasyon ve migrasyon (Şekil 1 ve 2) takip edilebilir.

Protokol

Massachusetts General Hospital Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) protokol numarası # 2010N000106 altındaki tüm prosedürleri onayladı. Bu değerlendirme ve laboratuvar Animal Care International (AAALAC) rehberlerin Akreditasyon Derneği ile uyumludur.

1. Reaktifler ve Malzeme Hazırlanması

1. 50X E3 embriyo orta 1 L hazırlayın (Tablo 2 bakınız) (Bakınız Tablo 1) ve 1X E3 embriyo orta 1 L hazırlar.
2. 1X E3 1 L propiltiyourasil'i 30 mg ekleyerek N-feniltiyoüre (PTU) E3 embriyo orta hazırlayın. Karıştırma O / N PTU tamamen çözülene sağlamak. Oda sıcaklığında saklayın.
3. , Pronaz çözelti hazırlamak 1X E3 15 ml Pronaz (0,5 mg / ml) 150 ul sulandırmak için. Bu miktar 1 petri için yeterlidir. Hemen kullanın.
4. Metilselüloz çözeltisi hazırlayın.
   1. 25 ml% 0.2 tricaine 75 ml karıştırılarak E3-tricaine çözeltisi hazırlayın1X E3. E3-tricaine çözeltisi 75 ml metilselüloz, 3 g kaynatılır.
   2. E3-tricaine çözeltisi ile 100 ml nihai hacme tamamlanır. Nihai metilselüloz çözüm sarımsı bir renk tonu ile viskoz ve opak olduğunu. Depolama: RT ışıktan korunmalıdır.
5. Tamoksifen stok ve indüksiyon çözümü
   1. 4-OH,% 100 etanol içinde eritilmesi ile 5 mm tamoksifen stok çözelti hazırlayın. -80 ° C'de saklayın stoku.
   2. Indüksiyon çözüm elde etmek 1X E3 arzu konsantrasyonunda tamoksifen taze seyreltme hazırlayın. DİKKAT! Kullanmadan önce MSDS'ye danışın.
6. Tablo 3 uyarınca% 0.2 tricaine 1 L hazırlayın.
7. Konfokal slaytlar edinin. Bir blok oluşturmak için bir araya dört coverglass (18 x 18) Tutkal sonra ortada embriyonun montaj izin 2 cm arayla 24 x 60 coverglass 2 blok yerleştirin.

2. Embriyo Hazırlık

1. Transjenik hatlar.
   Not: Zebrabow-M Alex Schier laboratuarından gelen cömert bir hediye oldu.
2. sox10: ERT2-Cre
   NOT: Standart moleküler klonlama yöntemleri kullanılarak ERT2-Cre ve ticari teknoloji klonlama rekombinasyon elde: hedefleme vektör pDestTol2- sox10 oluşturun.
   1. Lens hedef bir LR reaksiyonunda giriş klonu (pENTR3'-poliA) birleştirin 5 'sox10 promotörünün 7.2Kb, bir ağ geçidi, orta clone (pME-ERT2-Cre) ve 3 ihtiva eden giriş klonu (pENTR5'- sox10p)' Vektör pDestTol2- α-kristalin: YFP.
   2. Yapı arındırın pDestTol2- sox10: ERT2-Cre. Bir hücre aşamasında embriyoların WT (F0) içerisine Tol2 transposaz mRNA (50 ng / ul) ile arıtılmış, yapı (100 ng / | il), Co-enjekte edilir.
   3. Germ-line iletimi için ekran F0 yetişkin kurucuları F1 embriyolar güçlü sarı floresan dayalı.
3. sox10: ERT2-Cre, Zebrabow-M
   1. Zebrabow-M outcrossERT2-Cre transgenik hat: sox10 hattı (2.1.1).
   2. Güçlü bir yerde RFP ifade ve YFP objektif işaretleyici ve yetişkinler kadar onları büyümeye sergileyen seçin embriyolar.

3. Embriyo Koleksiyon

1. Sox10 birkaç çift ayarlayın: ERT2-Cre, Zebrabow-M transgenik zebrafish 5 pm ve Gün 1 6 saatleri arasında.
2. Ertesi gün, sabah bölücüler çekin ve öğlen yumurta toplamak.
3. Petri ve embriyoların dechorionate için Pronase çözeltisi 15 ml ekleyin aktarabilirsiniz.
4. Embriyoların yaklaşık% 60'ı dechorionated edilene kadar 1 ila 5 dakika için embriyolar inkübe edin. Pronase çözümü süzülerek reaksiyonu durdurmak ve taze E3 orta embriyolar 3-4 kez yıkayın.
5. RT O / N at E3 içinde dechorionated embriyolar inkübe ve onları 10 Somitlerin aşamaya ulaşmak için geliştirmek sağlar. Farklı gelişim büyümeyi önlemek için debriyaj başına 50-60 embriyolar kuluçkaya yatmaktadır.

4. Tedavi

1. Onlar 10 Somitlerin aşamada sağlamak için bir ışık alan mikroskobu altında embriyo gelişim aşamasını kontrol edin.
2. Kırmızı floresan proteini (RFP) filtresi ile bir floresan mikroskop kullanılarak, parlak kırmızı embriyolar izole.
3. Petri hidroksitamoksifen çözeltisi 10 uM ekleme ve 3 saat için 28,5 ° C 'de izole edilmiş embriyolar inkübe edilerek Cre rekombinasyon indüksiyonu geçin.
4. Tamoksifen çözüm Durusu ve E3 embriyolar birkaç kez yıkayın.
   DİKKAT! Özel bir biyolojik atık kapta tamoksifen çözüm atın.
5. 28.5 ° CO / N embriyolar kuluçkaya yatmaktadır.
6. Embriyolar yaklaşık 28-29 Somitlerin aşaması (24 saat civarında sonrası fertilizasyon) olduğunda, E3-PTU çözümü ahirette 28.5 ° C embriyolar kuluçkaya yatmaktadır.
   Not: PTU burada geliştirme embriyolar melanophores oluşumunu inhibe etmek için kullanılabilir. Bu tedavi için gerekli olanOtomatik floresan melanophores tarafından floresan sinyal bozulmasını önlemek.
7. 28.5 ° C embriyolar inkübe

5. Embriyo Seçimi

1. Tam gelişmiş kraniofasyal yapıları görselleştirmek için, Kırmızı sinyal ve Cre ifade işaretleyici pozitifliği (retinada sarı) yoğunluğu için 4 gün sonra döllenme embriyolar seçin.
2. E3 /% 0.015 tricaine çözeltisi ile embriyolar anestezisi. Yavaşça embriyo prodding zaman aktif hareketler veya fin aktivite gözlenir zaman Anestezi onaylanır.

6. metilselüloz içinde Embriyo Montaj

1. Metilselüloz bir damla içeren bir petri kabı içine görüntüleme için seçilen embriyo transferi ve yavaşça metilselüloz ile embriyo mumyalamak.
2. Temiz bir konfokal slayt, taze metilselülozun bir damla koyun ve bir Microloader ucunu kullanarak damla içinde embriyo monte edin. Pozisyon embriyo dorsal dokunmamaya dikkat çekicidoğrudan embriyo.
3. 25 x 25 lamel monte embriyo Kapak ve gerekirse lamel manipüle ederek embriyonun konumunu ayarlamak.
4. Embriyo artık görüntüye hazırdır.

Floresan Mikroskopi 7. Analiz

1. Embriyo odaklama için, 20x kuru lens objektif (iğne deliği boyutu 2.0 mikron sayısal açıklık 0.75) kullanın.
2. Mikroskop L100 düğmesine basın ve yazılım kanalları seçin.
3. Konfokal kurulum düğmesini seçin ve 'auto' tıklayın ve pencereyi kapatmadan önce aşağıdaki kanalları seçmek: Ch1: CFP, Ch2: GFP, CH3: RFP veya mCherry
4. 'Kilidini kaldırmak' düğmesini tıklamadan önce CH2 ve CH3 açın. Taramaya başlamak için 'oyun' tıklayın.
5. İstenen görüntü kalitesi ac kadar iyi ½ çerçeve / sn ve yüksek gerilim (YG) 150 ile başlayan ve daha sonra buna göre ayarlarını ayarlayarak yapılır ilgi yapısı, odaklanınhieved. RFP nedenle YG ayarlamak diğer renkler daha parlak olacaktır. YFP ve RFP pozitif hücreler hem bulmak için Z konumunu değiştirin.
6. Ayarlarıyla sonra, embriyonun görüntüyü yakalamak. Her bölünmüş kanalda görüntü işleme konfokal görüntüleme yazılımı formatı ve TIFF formatında resminizi kaydedin.
7. Daha sonra, CFP görüntüleme için, CH2 ve CH3 kapatıp Ch1 açın. Odak alanını değiştirmeden 5. adımda olduğu gibi ayarları yeniden ayarlayın.
   NOT: OBP nedeniyle iğne deliği boyutunu ayarlayarak atlatılabilir mavi kanalda arka sinyaline tespit etmek çok zor olabilir. Daha büyük bir iğne deliği boyut sinyali / arka plan gürültü oranını azaltarak floresan iyi algılama izin verir. Ancak, büyük iğne deliği görüntü kalitesinden ödün, konfokal etkisini azaltacaktır. Bu nedenle, ayarlar dikkatli ayarlanması istenen görüntü kalitesini ve yoğunluğunu elde etmek için gereklidir.
8. Görüntü yakalamak ve (her ikisi de formatta konfokal yazılım ve T kaydetmekGörüntü işleme için IFF). Görüntüler daha sonra katmanları birleştirme ve Pan ve ⁸ arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi renk ayarlarını iyileştirmek için ortak görüntü işleme yazılımı kullanılarak işlenebilir.

Sonuçlar

Bütün montaj Alsiyan mavi lekeler Geleneksel kıkırdak görselleştirme gelişmekte Meckel kıkırdağı gözlemleyerek ve yaygın olarak nihai hücresel organizasyonu ¹² (Şekil 1A) görselleştirmek için kullanılan çok değerli olmuştur. Ayrıca soy sox10 kullanarak izleme, fazla mesai gelişen kıkırdak analiz etmek için: Kaede transgenik çizgiler, canlı embriyolar ^2,12 (Şekil 1B) hücre göçü, yakınsama ve uzatma çalışma sağ...

Tartışmalar

Yukarıdaki birbirini tamamlar açıklandığı gibi alcian mavi ve photoconvertible transgenik hatları kıkırdak ve kemik gelişimi karmaşık sürecini tanımlamak için kullanılır. Ancak, organogenezis sırasında canlı hücre göç ve organizasyon uzun hipotez ve dolaylı olarak gösterdi ama görüntülenmiştir asla edilmiştir. Bir kıkırdak Belirli Cre ile birleştiğinde Zebrabow-M transgen doğru, kemik ve kıkırdak oluşumunda yer, tüm bu olayların eş zamanlı canlı gözlem izin verir. Bu teknik mi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pronase	Roche Life Sciences	10165921001	Prepare 500 μl stock aliquots at 50 mg/ml
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0262
PTU (N-Phenylthiourea)	Sigma-Aldrich	P7619
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
4-HydoxyTamoxifen	Sigma-Aldrich	T176
24 x 60 coverslips	Fisher Scientific	12-548-5P
18 x 18 coverslips	Fisher Scientific	12-540A
25 x 25 coverslips	Fisher Scientific	12-540C
pENTR5'-TOPO TA Cloning Kit	Life technologies	K591-20
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Life Technologies	K2400-20
pENTR3'-pA	Tol2Kit	302
pDEST			Gift from Geoffrey Burns labs
Bright field microscope
Fluorescent microscope
Confocal microscope
Image processing software