Visualizzazione di condrociti intercalazione e direzionale proliferazione via Zebrabow Analisi cellulare clonale nella cartilagine del Embryonic Meckel

Riepilogo

Organizzazione delle cellule di ossa cranio-facciali è stato a lungo ipotizzato ma mai visualizzato direttamente. Marcatura delle cellule Multi-spettrale e in vivo vivo l'imaging consente di visualizzare il comportamento delle cellule dinamica mandibola zebrafish. Qui, abbiamo dettaglio il protocollo di manipolare Zebrabow pesci transgenici e osservare direttamente intercalazione cellulare e cambiamenti morfologici di condrociti nella cartilagine di Meckel.

Abstract

Sviluppo delle strutture cranio-facciali vertebrati richiede coordinazione precisa di migrazione cellulare, la proliferazione, l'adesione e la differenziazione. Patterning della cartilagine del Meckel, un primo arco faringeo derivata, prevede la migrazione di cranico cresta neurale (CNC), le cellule e il partizionamento progressivo, la proliferazione e l'organizzazione dei condrociti differenziati. Diversi studi hanno descritto la migrazione CNC durante inferiore morfogenesi mascella, ma i dettagli di come i condrociti raggiungono organizzazione nella crescita e l'estensione della cartilagine di Meckel rimane poco chiaro. Il SOX10 limitata e indotto chimicamente Cre ricombinasi mediata ricombinazione genera permutazioni di proteine ​​fluorescenti distinti (RFP, YFP e CFP), creando così un sistema di etichettatura multispettrale delle cellule progenitrici e la loro progenie, riflettendo popolazioni clonali distinte. Utilizzando confocale fotografia time-lapse, è possibile osservare i condrociti behavio durante lo sviluppo della cartilagine del pesce zebra di Meckel.

Etichettatura cella multispettrali consente agli scienziati di dimostrare l'estensione dei condrociti della Meckel. Durante la fase di estensione della cartilagine del Meckel, che prefigura la mandibola, condrociti intercalare di effettuare estensione come impilano in una cella singola fila stratificato organizzata. Fallimento di questo processo intercalante organizzato mediare estensione cella fornisce la spiegazione meccanicistica cellulare per mandibola ipoplasia che osserviamo in malformazioni mandibolari.

Introduzione

Sviluppo craniofacciale richiede, interazioni cellulari e tissutali complessi molecolari di guidare la proliferazione cellulare, la migrazione e la differenziazione ^{1,2, 3.} Questo processo strettamente regolato e complesso è soggetto alle perturbazioni genetici e ambientali, in modo tale che deformità cranio facciali sono tra le malformazioni congenite più comuni ^1-9. Mentre gli interventi chirurgici rimangono il cardine del trattamento per le anomalie cranio-facciali, la comprensione della base di sviluppo è essenziale per innovare terapie future. Pertanto, lo studio della morfogenesi e meccanismi nella convergenza ed estensione e integrazione cella fornisce nuove intuizioni nella formazione dello scheletro craniofacciale ^1.

Cranica migrazione cresta neurale e popolano il primo arco faringeo, poi formare coppie di processi mandibolare che si estendono a formare cartilagine di Meckel, che prefigura la mandibola. Morfogenesi of cartilagine di Meckel richiede organizzazione condrociti via proliferazione direzionale, la polarizzazione cellulare e la differenziazione ^1,10. Tuttavia, la complessità di organizzazione condrociti nella crescita e l'estensione della cartilagine del Meckel rimane poco chiaro. Capire il comportamento delle cellule dinamico è fondamentale per comprendere malformazioni congenite che colpiscono le dimensioni della mandibola, come ad esempio ipoplasia fenotipi mandibola ^11.

Embrioni di zebrafish offrono molti vantaggi evolutivi e genetici per lo studio dettagliato della cartilagine morfogenesi di Meckel. Il loro trattabilità genetica, la trasparenza, ex vivo e rapido sviluppo sono potenti vantaggi prestito bene per l'osservazione del movimento e l'organizzazione delle cellule per l'imaging dal vivo ^6. L'utilizzo di strumenti di lineage tracing, come SOX10: Kaede linea transgenica, noi e altri abbiamo delineato le origini della cresta neurale dello scheletro cranio embrionale ^1,5. Using il SOX10: ERT2-Cre con la ubi: linea transgenica Zebrabow-M, è ora possibile esplorare i dettagli dei movimenti cellulari durante lo sviluppo craniofacciale. Il Zebrabow-M, è una linea transgenica ingegnerizzata con il promotore ubiquitina guidare l'espressione di diversi fluorofori, ogni fiancheggiato da siti Lox ^8. Il Zebrabow-M predefinita fluoroforo è rosso, che esprime RFP. Dopo l'induzione di espressione Cre, il Zebrabow-M costrutto ricombina e le cellule esprimono una combinazione di diversi fluorofori (RFP, CFP e YFP) creando espressione multispettrale nell'embrione. Tutte le cellule figlie che dividono dalle cellule marcate dopo l'evento di ricombinazione sono poi clonale etichettati, in modo che le popolazioni di cellule che derivano da diverse progenitori giustapposte sono clonale etichettati. Con questa marcatura cellulare clonazione, cellule proliferazione e migrazione con risoluzione clonale può essere seguito (figura 1 e 2).

Protocollo

Massachusetts General Hospital Istituzionale Cura e Comitato uso degli animali (IACUC) ha approvato tutte le operazioni in numero di protocollo # 2010N000106. Ciò è in accordo con l'Associazione per la valutazione e l'accreditamento di laboratorio Animal Care International (AAALAC) le linee guida.

1. Reagenti e materiali di preparazione

1. Preparare 1 L di 50X medio E3 embrione (Vedi Tabella 1) e preparare 1 l di 1X E3 medio embrione (vedi tabella 2).
2. Preparare E3 medio embrione con N-feniltiourea (PTU) con l'aggiunta di 30 mg di PTU a 1 L di 1X E3. Mescolare O / N per garantire che il PTU completa dissoluzione. Conservare a temperatura ambiente.
3. Per preparare la soluzione pronasi, diluire 150 ml di pronasi (0,5 mg / ml) con 15 ml di 1X E3. Tale importo è sufficiente per il piatto 1 Petri. Utilizzare immediatamente.
4. Preparare la soluzione metilcellulosa.
   1. Preparare la soluzione E3-tricaine mescolando 75 ml di 0,2% tricaine con 25 mldi 1X E3. Far bollire 3 g di metilcellulosa in 75 ml di soluzione di E3-tricaine.
   2. Portare il volume finale a 100 ml con la soluzione E3-tricaine. La soluzione metilcellulosa finale è viscoso e opaco con una tinta giallastra. Conservazione: RT al riparo dalla luce.
5. Tamoxifene magazzino e la soluzione ad induzione
   1. Preparare 5 mM tamoxifene soluzione madre sciogliendo 4 hydroxytamoxifen in 100% di etanolo. Conservare magazzino a -80 ° C.
   2. Preparare la diluizione fresco di tamoxifene alla concentrazione desiderio 1X E3 per ottenere la soluzione di induzione. ATTENZIONE! Si prega di consultare Scheda di Sicurezza prima dell'uso.
6. Preparare 1 L di 0,2% tricaine come da Tabella 3.
7. Ottenere diapositive confocale. Colla quattro coprioggetti (18 x 18) per formare un blocco poi posto 2 blocchi su un 24 x 60 cm di distanza coprioggetti 2 per consentire il montaggio di un embrione nel mezzo.

2. Preparazione Embrione

1. Linee transgeniche.
   Nota: Zebrabow-M è stato un dono generoso da laboratorio di Alex Schier.
2. SOX10: ERT2-Cre
   NOTA: Genera il vettore targeting pDestTol2- SOX10: ERT2-Cre utilizzando metodi di clonazione molecolare standard e commercialmente ottenuto ricombinazione tecnologia di clonazione.
   1. Combina 5 'entrata clone (pENTR5'- sox10p) contenente 7.2Kb del promotore SOX10, un clone di mezzo Gateway (PME-ERT2-Cre), ea 3' entrata clone (pENTR3'-polyA) in una reazione di LR con destinazione lente vettore pDestTol2- α-cristallina: YFP.
   2. Purificare costrutto pDestTol2- SOX10: ERT2-Cre. Co-iniettare il costrutto purificato (100 ng / mL) con Tol2 trasposasi mRNA (50 ng / ml) in embrioni WT (F0) nella fase una cella.
   3. Schermo fondatori F0 per adulti per la trasmissione germinale basate su una forte fluorescenza gialla in embrioni di F1.
3. SOX10: ERT2-Cre, Zebrabow-M
   1. Outcross il Zebrabow-MLinea (2.1.1) con la SOX10: linea transgenica ERT2-Cre.
   2. Selezionare gli embrioni che presentano una forte espressione RFP ubiquitaria e marcatore lente YFP e farle crescere fino adulti.

3. embrioni Collection

1. Impostare diverse paia di SOX10: ERT2-Cre, Zebrabow-M zebrafish transgenico 05:00-06:00 il giorno 1.
2. Il giorno seguente, tirare i divisori al mattino e raccogliere le uova intorno a mezzogiorno.
3. Trasferirli al di Petri e aggiungere 15 ml di soluzione di pronasi dechorionate gli embrioni.
4. Incubare gli embrioni per 1-5 minuti fino a circa il 60% degli embrioni sono stati dechorionated. Arrestare la reazione per decantazione la soluzione pronasi e lavare gli embrioni 3-4 volte con fresco medio E3.
5. Incubare gli embrioni dechorionated in E3 a RT O / N e far loro sviluppare per raggiungere la fase 10 somiti. Incubare 50-60 embrioni per la frizione per evitare la crescita di sviluppo diverso.

4. Trattamento

1. Controllare fase dello sviluppo degli embrioni al microscopio campo di luce per garantire che siano in fase di 10 somiti.
2. Utilizzando un microscopio a fluorescenza con una proteina fluorescente (RFP) filtro rosso, isolare gli embrioni di colore rosso vivo.
3. Procedere alla induzione della ricombinazione Cre-aggiungendo 10 mM di soluzione hydroxytamoxifen alla capsula di Petri e incubando gli embrioni isolati a 28,5 ° C per 3 ore.
4. Decantare la soluzione tamoxifene e lavare gli embrioni più volte con E3.
   ATTENZIONE! scartare la soluzione di tamoxifene in un apposito contenitore per rifiuti biologici.
5. Incubare gli embrioni a 28,5 ° CO / N.
6. Quando gli embrioni sono circa il 28-29 fase somiti (circa 24 ore dopo la fecondazione), incubare gli embrioni a 28,5 ° C a E3-PTU soluzione qui di seguito.
   NOTA: PTU è qui utilizzato per inibire la formazione di melanofori negli embrioni di sviluppo. Questo trattamento è necessarioevitare la distorsione del segnale di fluorescenza melanofori auto-fluorescente.
7. Incubare gli embrioni a 28,5 ° C

Selezione 5. Embrione

1. Per visualizzare le strutture craniofacciali completamente sviluppati, selezionare gli embrioni a 4 giorni dopo la fecondazione per l'intensità del segnale rosso e Cre marcatore espressione positività (giallo nella retina).
2. Anestetizzare gli embrioni con una soluzione di E3 / 0,015% tricaine. L'anestesia è confermata quando non movimenti attivi o attività pinna si osserva quando incitando delicatamente l'embrione.

6. Montaggio del Embryo in metilcellulosa

1. Trasferire l'embrione selezionato per l'imaging in una capsula di Petri contenente una goccia di metilcellulosa e imbalsamare delicatamente l'embrione con metilcellulosa.
2. Su un confocale vetrino pulito, una goccia di metilcellulosa fresca e montare la embrione all'interno della goccia con una punta microloader. Posizione embrione dorsale prendere attenzione a non toccarel'embrione direttamente.
3. Coprire l'embrione montato con 25 x 25 coprioggetto e regolare la posizione dell'embrione eventualmente manipolando il coprioggetto.
4. L'embrione è ora pronto per l'immagine.

7. Analisi per microscopia a fluorescenza

1. Utilizzare l'obiettivo 20x secca obiettivo (apertura numerica 0,75; dimensione pinhole 2.0 micron) per mettere a fuoco l'embrione.
2. Premere il tasto L100 sul microscopio e selezionare i canali nel software.
3. Selezionare il pulsante di configurazione confocale e fare clic su 'auto' e selezionare i seguenti canali prima di chiudere la finestra: Ch1: CFP, Ch2: GFP, Ch3: RFP o mCherry
4. Accendere Ch2 e Ch3 prima di fare clic sul pulsante 'rimuovere blocco'. Fare clic su 'play' per iniziare la scansione.
5. Focus sulla struttura di interesse, che è meglio farlo partendo da ½ telaio / sec e alta tensione (HV) 150 e quindi regolando le impostazioni di conseguenza fino a quando la qualità di immagine desiderata è achieved. La richiesta di offerta sarebbe più luminoso di altri colori, quindi regolare l'alta tensione. Cambiare la posizione Z per trovare sia YFP e cellule positive RFP.
6. Una volta impostato con le impostazioni, acquisire l'immagine della vostra dell'embrione. Salvare l'immagine nel formato confocale format software di imaging e TIFF per l'elaborazione delle immagini in ogni canale di divisione.
7. Quindi, per l'imaging CFP, spegnere Ch2 e Ch3 e accendere Ch1. Re-regolare le impostazioni come nel passaggio 5 senza modificare l'area di messa a fuoco.
   NOTA: CFP può essere davvero difficili da individuare a causa di segnale di fondo in blu canale che può essere aggirato regolando la dimensione del foro stenopeico. Una dimensione più grande foro stenopeico permette una migliore rilevazione della fluorescenza, riducendo il rapporto segnale rumore / sfondo. Tuttavia, un più ampio foro stenopeico ridurranno effetto confocale, compromettere la qualità dell'immagine. Pertanto, un'attenta regolazione delle impostazioni è necessario per ottenere la qualità dell'immagine desiderata e intensità.
8. Catturare l'immagine e salvarla in formato sia (software confocale e TIFF) per l'elaborazione delle immagini. Le immagini possono poi essere elaborati con software comune elaborazione delle immagini per unire i livelli e migliorare le impostazioni di colore, come descritto da Pan e colleghi ^8.

Risultati

Visualizzazione cartilagine tradizionale da tutto il monte Alcian macchie blu è stato prezioso per osservare la sviluppo della cartilagine di Meckel e comunemente usato per visualizzare finale cellulare organizzazione ¹² (Figura 1A). Per analizzare ulteriormente i condrociti in via di sviluppo straordinario, lignaggio tracciando con SOX10: linee transgeniche Kaede ci ha permesso di studiare la migrazione delle cellule, la convergenza e l'estensione in embrioni vivi ^2,12

Discussione

Alcian blue linee transgeniche e fotoconvertibile come descritto sopra complementi tra loro per definire il complesso processo di cartilagine e sviluppo osseo. Tuttavia, la migrazione cellulare dal vivo e organizzazione durante l'organogenesi è stato a lungo ipotizzato e dimostrato indirettamente ma mai visualizzato. Linea transgenica Zebrabow-M accoppiata con una cartilagine specifica Cre permette simultaneamente l'osservazione dal vivo di tutti questi eventi distinti coinvolti nella formazione delle ossa e de...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pronase	Roche Life Sciences	10165921001	Prepare 500 μl stock aliquots at 50 mg/ml
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0262
PTU (N-Phenylthiourea)	Sigma-Aldrich	P7619
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
4-HydoxyTamoxifen	Sigma-Aldrich	T176
24 x 60 coverslips	Fisher Scientific	12-548-5P
18 x 18 coverslips	Fisher Scientific	12-540A
25 x 25 coverslips	Fisher Scientific	12-540C
pENTR5'-TOPO TA Cloning Kit	Life technologies	K591-20
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Life Technologies	K2400-20
pENTR3'-pA	Tol2Kit	302
pDEST			Gift from Geoffrey Burns labs
Bright field microscope
Fluorescent microscope
Confocal microscope
Image processing software